CN116396904A - 一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用，包括以下步骤：S1、菌株活化培养；S2、筛选抗冻增殖培养基；S3、进行亚致死处理；S4、加入保护剂，冷冻干燥，得到益生菌菌粉。本发明采用上述的一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用，制备了高活性的益生菌菌粉，为提高益生菌在冻干过程中的存活率提供了一种新的思路和方法。

Description

一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用
技术领域
本发明涉及菌粉制备技术领域，尤其是涉及一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用。
背景技术
近年来，益生菌在食品中的应用引起了全世界的关注。自1989年Fuller定义益生菌为“一类活的微生物，通过改善宿主动物的肠道平衡从而改善宿主的健康状况”以来，越来越多的科学研究证明了益生菌的健康益处，如提高免疫力，降低肠道相关疾病的发病率，改善肠道菌群平衡，促进营养物质的有效吸收等等。其中鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌是常用的益生菌，具有丰富而显著的功能特性。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)属于革兰氏阳性菌，从健康人肠道分离得来，能发酵多种单糖，但不能发酵乳糖。大量动物及临床实验证明，鼠李糖乳杆菌能够定植在动物肠道中，维护肠道菌群平衡，并可以通过调节细胞因子的分泌来激活人体免疫***，从而抵御外源性抗原对人体的威胁。Alander等通过对志愿者的粪便及结肠活检样本的检测，证实了鼠李糖乳杆菌对人体肠道粘膜的附着以及停止摄入后持续附着，这使得其可以长期、持续地发挥其益生功效。Makra发现鼠李糖乳杆菌可抑制部分致病菌的生长，这归因于其在发酵单糖时生成的乳糖降低了肠道pH。
双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)属于G+杆菌，是一种无芽孢的不运动的厌氧菌，通常呈弯曲杆状，但随年龄和生长环境的变化而变化，具有维持肠道菌群平衡、降低人体内的胆固醇、延缓人体衰老等生理功能；双歧杆菌是应用最广泛的益生菌之一，对酸或氧敏感，在储存期间容易导致失活。双歧杆菌可以黏附在肠上皮细胞与其他细菌形成细菌生物膜，从而增强肠道的定植抗力，且双歧杆菌代谢产生的多种有机酸降低了肠道的pH值，使腐生菌及条件致病菌的定植、生长均受到抑制。
干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)属于G+杆菌，是一种嗜酸、杆状的乳酸菌，存在于多种环境，包括生牛乳和发酵乳、肉类或植物类产品，以及人和动物的口腔、肠道和生殖***，菌体长短不一，常呈链状，能发酵多种糖，可以在各种自然和人为环境中进行定植，在进入肠道后能够大量存活，起到调节胃肠道平衡的作用，同时还可以有效地降低血压和胆固醇。Aragon等人报告了添加菊粉和副干酪乳杆菌的巧克力慕斯，发现这种益生菌制品具有与常规产品类似甚至更好的性能。
益生菌通常以粉末形式，作为食品补充剂添加到特定食品如奶粉、巧克力、大豆酸奶和谷类产品中，使其获得一定的保健效果。由于消费者越来越意识到益生菌对健康的影响，益生菌产品的需求正在迅速增长。相较以液体形式出售的益生菌产品，以干粉形式存在的益生菌产品更便于储存和运输，且活菌数受时间的影响较小，深受人们的欢迎。
冷冻干燥是常用来生产制备菌粉的方法之一，它是一种将样品中的水分通过冰晶升华而除去的干燥方式，能够有效去除样品中的水分，且制得的菌粉存活率高、复水性好，适合益生菌菌粉的制备。然而研究发现，冷冻过程中形成的冰晶会对菌体造成机械损伤，随后的干燥过程会导致蛋白的结构发生变化，包括蛋白二硫键的交换和其他可能致其失活的反应，这可能会导致菌体细胞的死亡。
喷雾干燥也是制备菌粉的常用方法。相较于冷冻干燥，喷雾干燥具有较大的成本优势，而且可以在短时间内连续干燥大批量样品。然而，在喷雾干燥过程中，细菌接触到的各种不利因素(渗透、热、氧化)，都可能造成细胞膜损伤及蛋白失活，从而大大降低益生菌的活力。Kim指出喷雾干燥过程中所采用的工艺参数，如干燥机进出口温度的设置、料液特性、干燥操作条件对上述干燥过程均有影响，进而使最终获得的菌粉性能也受到影响。
因此，基于干燥过程中益生菌可能受到的损伤，有针对性地选择不同的保护措施可提高菌体存活率，对益生菌的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用，制备了高活性的益生菌菌粉，为提高益生菌在冻干过程中的存活率提供了一种新的思路和方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用，包括以下步骤：
S1、菌株活化培养；
S2、筛选抗冻增殖培养基；
S3、进行亚致死处理；
S4、加入保护剂，冷冻干燥，得到益生菌菌粉。
优选的，所述步骤S1中，所述菌株为鼠李糖乳杆菌LR22(LactobacillusrhamnosusLR22)，干酪乳杆菌LC61(LactobacilluscaseiLC61)和乳双歧杆菌BB12(BifidobacteriumlactisBB12)。
优选的，步骤S2中，所述抗冻因子为山梨醇、谷氨酸、氯化钠的混合物，所述抗冻因子配比为山梨醇0.05％，谷氨酸0.048％，氯化钠0.4％。
优选的，步骤S3中，所述亚致死处理包括冷休克，热休克和酸休克。
优选的，所述热休克处理温度为40-50℃，时间为20-40min；所述冷休克处理温度为4-20℃，时间为30-120min；所述酸休克处理pH为4-5，时间为30-120min。
优选的，所述保护剂中包含糖类、蛋白质类、氨基酸类、维生素类、无机盐类中的一种或几种。
一种添加益生菌菌粉的羊乳粉，包括如下重量份计的原料：1kg最终配方羊奶粉产品中益生元添加量均为低聚半乳糖25g，水苏糖15g，低聚木糖15g，益生菌添加量为1.0g益生菌复合菌粉(菌种比例为LR22：BB12：LC61＝1:1:1)，儿童配方羊奶粉中再添加AA13g、DHA7g、牛磺酸0.5g、葡萄糖酸锌600mg，运动员配方羊奶粉中再添加乳清蛋白50g，中老年配方羊奶粉再添加植物甾醇酯50g，孕妇配方奶粉再添加维生素B94mg、维生素B1266μg、酵母葡聚糖25g。
优选的，制备方法为：采用干湿法复合工艺，加入益生菌菌粉、益生元和功能因子制备儿童配方羊奶粉、运动员配方羊奶粉、中老年配方羊奶粉、孕妇配方羊奶粉。
优选的，所述功能因子包含花生四烯酸(AA)、二十二碳六烯酸(DHA)、牛磺酸、葡萄糖酸锌、乳清蛋白、植物甾醇酯、酵母葡聚糖、维生素B9和B12中的一种或几种。
因此，本发明采用上述一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用，制备了高活性的益生菌菌粉，为提高益生菌在冻干过程中的存活率提供了一种新的思路和方法。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的培养基对鼠李糖乳杆菌LR22，乳双歧杆菌BB12，干酪乳杆菌LC61的活菌数的影响；
图2是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的热休克、冷休克及酸休克处理对鼠李糖乳杆菌LR22的冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图3是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的热休克、冷休克及酸休克处理条件对乳双歧杆菌BB12冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图4是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的热休克、冷休克及酸休克处理条件对干酪乳杆菌LC61冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图5是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的不同保护剂对鼠李糖乳杆菌LR22的冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图6是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的不同保护剂对乳双歧杆菌BB12的冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图7是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的不同保护剂对干酪乳杆菌LC61的冻干存活率和单位菌粉活菌数的影响；
图8是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的鼠李糖乳杆菌LR22在最优抗冻增值培养基(a)、亚致死处理条件(b)、保护剂(c)、最佳复合条件下(d)的扫描电镜图；
图9是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的LR22益生菌菌粉的Arrhenius图；
图10是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的乳双歧杆菌BB12在最优抗冻增值培养基(a)、亚致死处理(b)；保护剂(c)；最佳复合条件下(d)的扫描电镜图；
图11是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的乳双歧杆菌BB12益生菌菌粉的Arrhenius图；
图12是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的干酪乳杆菌LC61在抗冻增值培养基(a)、亚致死处理(b)、保护剂(c)、复合条件下(d)的扫描电镜图(10.00kx)；
图13是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的LC61益生菌菌粉的Arrhenius图；
图14是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺制备的益生菌配方羊奶粉的活菌数及存活率；
图15是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺，5000x(左)；干湿法工艺，5000x(右)制备儿童配方羊奶粉的扫描电镜图；
图16是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺，5000x(左)；干湿法工艺，5000x(右)制备运动员配方羊奶粉的扫描电镜；
图17是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺，5000x(左)；干湿法工艺，5000x(右)制备中老年配方羊奶粉的扫描电镜；
图18是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺，5000x(左)；干湿法工艺，5000x(右)制备孕妇配方羊奶粉的扫描电镜图；
图19是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的干湿法复合工艺制备的儿童配方羊奶粉、运动员配方羊奶粉、中老年配方羊奶粉和孕妇配方羊奶粉的粒度分布图；
图20是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺制备的儿童配方羊奶粉、运动员配方羊奶粉、中老年配方羊奶粉和孕妇配方羊奶粉的粒度分布图；
图21是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的益生菌羊奶粉的X衍射图；
图22是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的益生菌羊奶粉的加速试验结果(Arrhenius图)；
图23是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的湿法工艺制备的益生菌配方羊奶粉的Arrhenius图；
图24是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的干湿法复合工艺制备的益生菌羊奶粉的加速试验结果(Arrhenius图)；
图25是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的干湿法复合工艺制备的益生菌配方羊奶粉的Arrhenius图；
图26是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的不同工艺制备的益生元羊奶粉在胃液、肠液中处理不同时间后的活菌数变化；
图27是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用实施例的不同配方的益生菌羊奶粉在模拟胃液、肠液中处理不同时间后的活菌数变化；
图28是本发明一种益生菌菌粉制备及其在羊乳粉中的应用的技术路线图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例一
如图28所示，益生菌菌粉的制备
(1)菌株活化培养
将保藏的鼠李糖乳杆菌LR22，乳双歧杆菌BB12，干酪乳杆菌LC61益生菌菌粉分别接入MRS肉汤培养基中，37℃培养22-24h，经镜检确认无杂菌后，将菌液以5％接种量再接入MRS肉汤，连续培养两次后放入冰箱4℃保存。
(2)筛选抗冻增殖培养基
将上述已活化的菌株接种于不同的培养基(M)中，37℃恒温培养20-22h后离心收集菌泥，等比例加入磷酸缓冲液后冷冻干燥。除对照组使用MRS肉汤且不添加抗冻因子外，其它实验组使用的培养基中都添加了山梨醇0.05％，谷氨酸0.048％，氯化钠0.4％作为抗冻因子。其中，培养基的选取具体见表1。
表1抗冻增殖培养基的种类
Figure BDA0004161666520000081
在图1中可以看到，选择的六种增殖培养基并非均能有效促进鼠李糖乳杆菌LR22，乳双歧杆菌BB12，干酪乳杆菌LC61的活菌数增长，相较于常用的MRS肉汤培养基，只有部分增殖培养基对三种益生菌的生长具有显著的促进作用。
对于鼠李糖乳杆菌LR22，M2、M3、M5和M6培养基的生长促进作用更强，而M1和M4中的活菌数低于对照，其中M3培养基生长促进作用最强，可以显著提高鼠李糖乳杆菌的活菌数(P<0.05)，经过22h培养后其活菌数可达1.09×109CFU/mL；不同培养基对干酪乳杆菌LC61生长也出现相似的情况，M1和M4中干酪乳杆菌LC61的活菌数低于对照，其它4种培养基中的活菌数均高于对照，这可能是因为M1和M4培养基的碳源较为单一，不能够满足菌体的增殖需要。干酪乳杆菌在M2培养基中培养20h后，活菌数可达1.41×109CFU/mL，与对照组相比，差异性显著(P<0.01)；而对于乳双歧杆菌BB12，仅有M6培养基的促生长作用更强，活菌数可达3.02×109CFU/mL，且与对照组(4.27×108CFU/mL)具有显著性差异(P<0.01)，这可能是因为M6培养基中含有L-半胱氨酸盐酸盐，可以提供厌氧环境，有利于乳双歧杆菌的生长。
(3)进行亚致死处理
将活化的菌株接种于培养基中，37℃培养20-22h后取出分为四组，一组作为对照，立即放入冰箱预冻，余下每三组作为实验组，分别进行热休克处理、冷休克处理和酸休克处理，处理条件具体如下：
热休克处理：将菌液分装为2组，分别记为Th(温度变量组)，h(时间变量组)。Th组分别置于40，45，50℃水浴处理30min，记为Th1，Th2，Th3；h组在Th组确定的最佳温度水浴下处理20，30，40min，分别记为h1，h2，h3。将各实验组分装三份，分别用作冻干前计数，冻干后计数和电镜观察。
冷休克处理：取菌液分装为2组，分别记为Tc(温度变量组)，c(时间变量组)。Tc组分别置于4，10，20℃水浴处理60min，记为Tc1，Tc2，Tc3；c组在Tc组确定的最佳温度水浴下处理30，60，120min，分别记为c1，c2，c3。将各实验组分装三份，分别用作冻干前计数，冻干后计数和电镜观察。
c.酸休克处理：将菌液离心后得到的菌泥分装为2组，分别记为Ta(温度变量组)，a(时间变量组)。Ta组分别置于pH4.0，4.5，5.0磷酸缓冲液中处理60min，记为Ta1，Ta2，Ta3；a组在Ta组确定的最佳pH下处理30，60，120min，分别记为a1，a2，a3。具体如下表，将各实验组分装三份，分别用作冻干前计数，冻干后计数和电镜观察。
结果：
图2显示了鼠李糖乳杆菌LR22在不同休克处理条件下冻干存活率和单位菌粉活菌数的变化。三种亚致死处理条件根据冻干存活率的选择标准，由高到低依次为pH5.0处理60min(24.23％)、4℃处理20min(16.53％)、45℃处理20min(16.48％)，相较于其相应的对照组分别提升了11.48％、6.24％、1.60％，表明酸休克处理(pH5.0处理60min)可以较大程度地提高其抗冷冻能力，此时其单位菌粉活菌数为1.14×1010CFU/g，即降低培养基的pH值可使Lactobacillusreuteri菌株的冻干存活率增大，这可能是较低的pH诱导细胞产生了抗性物质，从而提高了它在冻干过程中的抗冻性。
图3显示了乳双歧杆菌BB12在不同休克处理条件下冻干存活率和单位菌粉活菌数的变化。三种亚致死处理条件根据冻干存活率的选择标准，由高到低依次为pH4.0处理120min(36.24％)、40℃处理30min(6.90％)、20℃处理120min(6.20％)，相较于其相应的对照组分别提升了30.42％、0.84％、0.38％，表明酸休克处理(pH4.0处理120min)可以较大程度地提高其抗冷冻能力，此时其单位菌粉活菌数为6.16×109CFU/g，即双歧杆菌的培养基pH由6.2降至5.2时提高了菌株的抗冻能力。
图4显示了干酪乳杆菌LC61在不同亚致死处理条件下冻干存活率和单位菌粉活菌数的变化。三种最佳亚致死处理条件下菌体的冻干存活率，由高到低依次为40℃处理40min(15.49％)、pH5.0处理120min(13.30％)、20℃处理120min(11.14％)，相较于其相应的对照组分别提升了5.68％、2.44％、1.96％，表明热休克可以较大程度地提高其抗冷冻能力。
(4)加入保护剂，冷冻干燥，得到益生菌菌粉
采用MRS液体培养基37℃培养20-22h后，取1mL进行冻干前计数，8000r/min离心15min收集菌体，然后等比例加入不同的保护剂，进行冷冻干燥。对得到的菌粉进行活菌计数及冻干存活率计算。保护剂的选取如表2。
保护剂溶液的配制：将大分子保护剂、糖类、聚合物类中的一种或几种保护剂按一定的浓度用蒸馏水溶解，搅拌均匀，于121℃下灭菌15min，置于4℃冰箱中保存备用；脱脂乳于95℃灭菌30min，抗坏血酸、氨基酸经过0.22μm的滤膜过滤除菌。
表2保护剂的种类
Figure BDA0004161666520000111
结果：
由图5-7确定鼠李糖乳杆菌LR22，乳双歧杆菌BB12，干酪乳杆菌LC61益生菌菌粉的制备工艺如下：
鼠李糖乳杆菌LR22在M3培养基中培养后，在pH5.0处理60min，加入C3保护剂，其单位菌粉活菌数为(1.89±0.21)×1011CFU/g，冻干存活率可达95.11％，较对照组(13.25％)提高了81.86％，相较仅添加了保护剂的实验组(84.47％)提高了10.64％；乳双歧杆菌BB12在M6培养基中培养后，在pH4.0处理120min，加入C2保护剂，其单位菌粉活菌数为(1.40±0.24)×1011CFU/g，冻干存活率可达93.10％，相比于对照组(6.59％)和仅添加了保护剂的实验组(76.67％)，益生菌菌粉的冻干存活率分别提高了86.51％、16.43％；干酪乳杆菌LC61在M2培养基中培养后，在40℃处理40min，加入C1保护剂，其单位菌粉活菌数为(6.84±1.16)×1011CFU/g，冻干存活率可达90.91％，相比于对照组(10.70％)和仅添加了保护剂的实验组(84.47％)，益生菌菌粉的冻干存活率分别提高了80.21％、6.44％。
a1：鼠李糖乳杆菌LR22菌粉的形态观察
通过扫描电镜观察益生菌菌粉的微观结构，可以直观地观察和比较优化的各条件(依次为抗冻因子、预处理条件和保护剂)对鼠李糖乳杆菌LR22菌体的保护作用。
图8呈现了鼠李糖乳杆菌LR22菌粉在不同制备条件下的形态特征，抗冻因子、预处理条件和保护剂均能对菌体提供一定的保护效果。相较于保护剂在菌体表面的均匀覆盖，未添加保护剂的鼠李糖乳杆菌益生菌菌粉的电镜图(图8a,b)中可以观察到清晰且排列紧密的菌体，预处理过的菌体(图8b)中存在部分泄露出的细胞内容物，同时细胞间能观察到一定的多孔结构，这可能是微小的冰晶体的升华留下的痕迹；相比之下，添加了抗冻因子的菌体(图8a)则更加完整，绝大多数菌体仍保留完好的形态，同时观察到表面有一些平滑致密的块状膜，它们似乎包裹在菌体表面，以降低菌体在冻干过程中受到的伤害。细胞生长环境的改变，如培养基的组成、细胞的预处理条件，可能影响细胞膜的成分及结构。
添加了保护剂的菌体(图8c)表面包裹着一层厚厚的保护壳，菌体形态清晰完好无破裂，表明保护剂的保护效果良好。最优工艺制得的菌粉的电镜图(图8d)中观察到的菌体轮廓更加模糊，它们大都被深深包埋在保护基质下，结构紧密，这种结构可以很好的保护菌体细胞，保证菌体在冻干过程中的存活。
a2：鼠李糖乳杆菌LR22菌粉的稳定性分析
在确定的鼠李糖乳杆菌的最佳工艺下制备菌粉，通过加速实验在45℃、50℃、55℃下测定菌粉活菌数的变化情况，并得到双歧杆菌的Arrhenius图(图9)。根据方程y＝-5824.4x+15.948，可预测鼠李糖乳杆菌在不同温度下的失活速率常数，其在冷藏(4℃)和冻藏(-18℃)分别为4.66×10-5和2.20×10-6，进而可计算出鼠李糖乳杆菌LR22菌粉在4℃和-18℃下贮存一年后的活菌数分别为7.41×1010CFU/g和1.81×1011CFU/g。
b1：乳双歧杆菌BB12菌粉的形态观察
扫描电镜可以通过测定颗粒的排列来测定样品的微观结构。扫描电镜图10可以直观地表现出优化的各条件(依次为抗冻因子、预处理条件和保护剂)对乳双歧杆菌BB12菌体的保护作用。
菌粉的SEM图像(图10a,b)表明，抗冻因子的添加保护了细胞，但是仍有部分细胞破裂，对于亚致死条件下处理且未加保护剂的菌体来说，其表面更加粗糙，能观察到细胞间存在的多孔结构，这可能是干燥过程中水分蒸发留下的痕迹，同时细胞间存在有泄露出的细胞内容物；添加了保护剂的菌体(图10c,d)被保护剂包裹完全，结构紧密表面平整，未观察到图10中LR22菌粉表面出现的裂纹，这表明了保护剂良好的保护效果。对于同时添加了抗冻因子和预处理条件下制得的菌粉，其电镜图(图10d)中的菌体轮廓几乎不可见，它们与外界空气隔绝，这样可以起到更好的保护作用，保证菌体在冻干过程中的存活。
b2)乳双歧杆菌BB12菌粉的稳定性分析
通过加速实验，在45℃、50℃、55℃下测定菌粉活菌数的变化情况，并得到双歧杆菌的Arrhenius图(图11)。根据方程y＝-4070.3x+10.457，可预测乳双歧杆菌BB12在4℃、-18℃的失活速率常数分别为7.27×10-5、3.94×10-6，进而可计算出乳双歧杆菌菌粉BB12菌粉在4℃和-18℃下贮存一年后的活菌数分别为1.58×1011CFU/g和6.32×1011CFU/g。
c1)干酪乳杆菌LC61菌粉的形态观察
通过扫描电镜观察益生菌菌粉的表面形态，可以直观地观察优化的各条件(依次为抗冻因子、预处理条件和保护剂)对干酪乳杆菌LC61的保护作用。
菌粉的SEM图像(图12a)表明，在有抗冻因子的添加的细胞中，可以观察到清晰的菌体轮廓和菌体部分表面上包裹的膜状物，它们可能是由抗冻因子形成的保护膜；而对于图12b中的菌体来说，其表面更加粗糙，可以观察到少数完全破损的菌体，这些菌体在冻干过程中受到损伤，失去活力；添加了保护剂的菌体(图12c,d)被保护剂包裹，可以看见清晰的菌体轮廓，其排列紧密且表面光滑，同时，未观察到图8中LR22菌粉表面出现的裂纹，这表明了保护剂良好的保护效果。对于使用最优工艺制得的菌粉，冻干存活率最高，表明其冻干过程中收到的保护效果最好，其电镜图(图12d)中的菌体轮廓被包裹完全，表面没有裂缝或孔洞，这与之前得到的活菌数的测定结果一致。
c2干酪乳杆菌LC61菌粉的稳定性分
通过加速实验，在45℃、50℃、55℃下测定菌粉活菌数的变化情况，并得到乳双歧杆菌的Arrhenius图(图13)。根据方程y＝-5478.4x+14.648，可预测干酪乳杆菌LC61在4℃、-18℃的失活速率常数分别为5.81×10-5、2.36×10-6，进而可计算出干酪乳杆菌菌粉在4℃和-18℃下贮存一年后的活菌数分别为4.34×1010CFU/g和1.34×1011CFU/g。
实施例二
益生菌配方羊奶粉的开发
根据益生菌加入方式的不同，可得到两种不同工艺制得的益生菌羊奶粉。一种工艺是常用的干湿法复合工艺，将益生菌以益生菌菌粉的形式按一定比例与喷雾干燥得到的配方羊奶粉混合；另一种则是国内倡导使用的湿法加工工艺，在复配好的原料乳中加入等比例混合的复合益生菌菌泥，混合均匀后进行喷雾干燥，制备益生菌羊奶粉。
1)干湿法复合工艺制备益生菌配方羊奶粉
干湿法复合工艺制备的针对儿童、运动员、中老年、孕妇4种配方产品都以益生菌和益生元为基础功能因子。1kg最终配方羊奶粉产品中益生元添加量均为低聚半乳糖25g，水苏糖15g，低聚木糖15g，益生菌添加量为1.0g益生菌复合菌粉(菌种比例为LR22：BB12：LC61＝1:1:1)，儿童配方羊奶粉中再添加AA13g、DHA7g、牛磺酸0.5g、葡萄糖酸锌600mg，运动员配方羊奶粉中再添加乳清蛋白50g，中老年配方羊奶粉再添加植物甾醇酯50g，孕妇配方奶粉再添加维生素B94mg、维生素B1266μg、酵母葡聚糖25g。
2)益生菌配方奶粉的湿法制备工艺
不同于干湿法复合工艺，湿法制备工艺是在喷雾干燥前加入菌泥，其中5kg羊乳中复合菌泥的添加量为54g，益生元与功能因子在各配方中的添加量不变。
经此工艺制得益生菌配方羊奶粉的活菌数及存活率见图14。使用湿法制备的儿童、运动员、中老年、孕妇配方羊奶粉的初始活菌数分别为2.21×108CFU/g、2.48×108CFU/g、4.72×108CFU/g、2.7×108CFU/g，以全脂羊奶粉作为对照组，活菌数为1.41×108CFU/g，将羊奶粉复原为喷雾干燥前的浓度，测定其活菌数，发现中老年配方羊奶粉的喷干存活率最高，为14.60％，对照组存活率最低，为3.28％。
图15-18分别显示了儿童配方羊奶粉、运动员配方羊奶粉、中老年配方羊奶粉和孕妇配方羊奶粉在5000倍下的表面形态。可以看到各配方羊奶粉颗粒的形态都有一定的区别，具体表现为：儿童配方羊奶粉(图15)中存在非常多的小粒子且颗粒排列紧密，粒形饱满；运动员配方羊奶粉(图16)的颗粒则呈不规则的圆形，均匀分布、大小不一；中老年配方羊奶粉(图17)呈现出较大的颗粒粒径和颗粒表面不同程度的皱缩；孕妇配方羊奶粉(图18)的颗粒饱满呈球形，虽与儿童配方羊奶粉的颗粒形态相似，但其粒度分布更加分散，颗粒粒径更大。这说明了不同功能因子组合会对羊奶粉颗粒的形态特征产生一定的影响。此外，具有相同配方的羊奶粉样品均表现为相似的球形结构和一致的粒径，说明各配方奶粉的不同制备工艺对羊奶粉的微观结构没有影响。
中老年配方羊奶粉粗糙的表面(图17)和各样品颗粒表面细微孔洞的出现，可能是在干燥过程中作为干燥剂的不同液体成分在颗粒内迁移，改变了干燥颗粒的特性，此外，在干燥过程中，颗粒可能会膨胀、变形、收缩或断裂，这取决于颗粒表层或外壳的流变性、孔隙度。
从图19中，可以观察到通过干湿复合工艺制备的四种配方羊奶粉的粒度分布粒度分布图上可以看出，除运动员配方羊奶粉(b)仅在2～3μm左右处有一个较大分布峰外，其余各配方羊奶粉的粒径分布有三个及以上的峰，且均出现在0.3～1.1μm、1.1～10μm和10～100μm处。这说明儿童配方羊奶粉(a)、中老年配方羊奶粉(c)和孕妇配方羊奶粉(d)具有相似的粒径分布。同时，整体来看各配方羊奶粉的粒径大小均分布在0～276μm之间，90％的颗粒大小分布在70.647μm以下，50％的颗粒大小分布在6.559μm以下，10％的颗粒大小在0.833μm以下，这表明配方羊奶粉颗粒分布广泛且有足够数量的小粒径粉末，从储存及长途运输角度来看，这是一种理想的状态。
同样地，在图20中，可以观察到通过湿法工艺制备的四种配方羊奶粉的粒度分布，除运动员配方羊奶粉仅分布有一峰(2～4μm)外，通过干湿法复合工艺制备的三种配方羊奶粉均分布有三个及以上的峰，且这些峰出现的范围相似，并与湿法工艺制备的羊奶粉样品的粒径分布一致，仅有部分峰的高度存在差异。
图21显示了以湿法、干湿法两种不同工艺制备得到的益生菌-复合益生元羊奶粉样品的XRD图谱，并与全脂羊乳粉及对应的益生元样品进行对比。从该图中可以证实，不论制备工艺如何，益生菌-复合益生元羊奶粉均呈现出完全的非晶结构，无结晶峰形成，这种结构总体上有利于羊奶粉的饮用，无定形基质更能适应复水步骤，并且比晶体结构更容易复水。
a：益生菌配方羊奶粉的色泽
益生菌配方羊奶粉的颜色参数L*、a*、b*值如表3所示。
表3益生菌配方羊奶粉样品的L*、a*、b*值
Figure BDA0004161666520000171
结果：
首先，对于益生菌配方羊奶粉，不论使用那种工艺制备，所有样品的L*值均大于对照组，在92.18～92.69之间；同时，所有样品的-a*值减少，+b*值增加。总的来说，粉末的亮度增加，色度增加，这与单独添加益生元或者功能因子的样品变化趋势一致。各配方羊奶粉样品与全脂羊乳粉间的色差值△E为1.73～2.21NBS，属于可察觉的视觉感受值，人眼仔细观察时可以分辨出配方羊奶粉与全脂羊奶粉间存在细微的颜色差异。
然而各个试验样品间的颜色差异很小，肉眼很难区分，表明不同配方羊奶粉之间没有明显的色泽差异。所有样品的颜色接近白色标准色，呈轻微的乳黄色。
b：益生菌配方羊奶粉的稳定性分析
在益生菌配方羊奶粉的制备过程中，由于益生菌加入方式的不同，可得到两种不同工艺制得的益生菌羊奶粉。在保持初始活菌数在108CFU/g的基础上，通过加速实验测定贮藏过程中羊奶粉活菌数的变化情况，评价了四种配方羊奶粉中益生菌的存活情况，同时评估不同工艺对配方羊奶粉稳定性的影响。
b1湿法工艺制备的益生菌配方羊奶粉的稳定性
将益生菌羊奶粉封装在铝箔袋中，置于不同的加速温度(45℃，50℃，55℃)下，每隔2h取3g羊奶粉溶于47mL的生理盐水中，计算羊奶粉的活菌数，根据方程推算益生菌羊奶粉在4℃与25℃的菌粉失活速率常数k，结果如下图22所示。
由上图可知Arrhenius方程为y＝-3484.1x+9.5584，进而推测益生菌羊奶粉在4℃，25℃下菌体失活速率常数分别为9.72×10-4、7.46×10-3，测得羊奶粉的初始活菌数为1.41×108CFU/g，以1×106CFU/g为羊奶粉活菌数的储藏的最低限度，由一级动力学反应方程预测湿法制备得到的益生菌羊奶粉在4℃，25℃条件下的保质期为92天和12天，益生菌羊奶粉更适宜在4℃储存。
根据图23(a)至(d)所示配方羊奶粉的Arrhenius方程，可知使用湿法制备的儿童、运动员、中老年、孕妇配方羊奶粉在4℃下菌体失活速率常数分别为1.33×10-3、1.06×10-3、2.36×10-3、8.84×10-4，在25℃下菌体失活速率常数k25值分别为8.64×10-3、7.76×10-3、1.26×10-2、7.21×10-3。测得羊奶粉的初始活菌数分别为2.21×108CFU/g、2.48×108CFU/g、4.72×108CFU/g、2.7×108CFU/g，以指标要求的最低活菌数106CFU/g为最终值。预测本研究制备的益生菌羊奶粉在冷藏条件下(4℃)的保存期限分别为73天、94天、47天、115天，在室温条件下(25℃)的保存期限分别为8.9天、14.1天、11.3天、12.9天。
b2：干湿法复合工艺制备的益生菌配方羊奶粉的稳定性
将复合菌粉与羊奶粉按比例混合为益生菌羊奶粉，在上述同样温度下检测活菌数，求出各个温度下益生菌羊奶粉的失活速率常数，并推测其在4℃和25℃条件下的保质期，其中羊奶粉的初始活菌数为7.05×108CFU/g，各温度下的失活速率常数为：k45＝0.1691(R2＝0.9313)、k50＝0.2308(R2＝0.9484)、k55＝0.2968(R2＝0.9844)，结果如下图24所示。
根据Arrhenius方程y＝-5876.4x+16.701得益生菌羊奶粉在4℃、25℃下菌体失活速率常数k25值为9.81×10-4，以指标要求的最低活菌数106CFU/g为最终值，以一级动力学反应方程预测干湿法制备得到的益生菌羊奶粉的保质期，其在4℃、25℃下保存7.8年、91天后活菌数仍可达106CFU/g。
根据图25(a)至(d)所示配方羊奶粉的Arrhenius方程，可知使用干湿法复合工艺制备的儿童、运动员、中老年、孕妇配方羊奶粉在4℃下菌体失活速率常数分别为2.96×10-5、3.04×10-5、6.38×10-5、2.92×10-5，在25℃下菌体失活速率常数k25值分别为9.77×10-4、9.01×10-4、1.58×10-3、9.78×10-4，以指标要求的最低活菌数106CFU/g为最终值。预测本研究制备的益生菌羊奶粉在冷藏条件下(4℃)的保存期限分别为9.1年、8.9年、4.8年、9.5年，在室温条件下(25℃)的保存期限分别为100天、111天、70天、104天。
综上，不同的制备工艺对益生菌配方羊奶粉的储存稳定性有很大的影响，湿法工艺获得的益生菌羊奶粉在4℃的保存期限最长可达115天，在室温下可以保存14天，说明将菌泥和原料乳混合后直接喷雾干燥制得的羊奶粉稳定性较差；而干湿法复合工艺制备的羊奶粉具有良好的保存效果，在25℃下可以保存长达111天，这说明前期制备的益生菌菌粉具有较好的稳定性。
实施例三
益生菌配方羊奶粉在模拟胃肠液中的活性考察
制备工艺对益生菌在模拟胃肠液中稳定性的影响分析
以益生菌的活菌数变化来评价益生菌羊奶粉在模拟胃肠道环境下的稳定性。以不同工艺制备的益生元基粉作为实验组，使用配制好的模拟胃液、肠液进行羊奶粉样品的体外消化，不同样品在模拟胃液、肠液下随消化时间的活菌数变化如图26所示。
以相同添加量的菌粉为参照组，比较不同制备工艺对益生元羊奶粉胃肠道耐受性的影响。在图中可以看到，各样品的活菌数均随着消化时间迅速下降，在模拟胃液(pH1.8)中消化1h后，羊奶粉样品的活菌数就已下降至106CFU/mL，随着消化时间的延长，羊奶粉样品活菌数的下降幅度不同，消化2h时，干湿法制备的羊奶粉样品活菌数最大，这说明干湿法复合工艺制备的羊奶粉在模拟胃肠道环境下的耐受能力更强。
将样品转移到模拟肠液(pH6.5)中继续消化，随着消化时间的增加，各样品活菌数的变化趋势是相似的(图27)，均表现为先增加而后降低，当在模拟肠液中消化0.5h时，各样品的活菌数达到最大，这种增值现象出现的原因可能是一些在低pH下活性受到抑制的益生菌开始逐渐恢复活性
在模拟胃液处理的前半小时内，活菌数迅速下降，随后下降趋势逐渐减缓。除对照组菌粉的活菌数快速下降外，其余配方羊奶粉在模拟胃液中处理1小时后，其活菌数仍维持在106CFU/mL，对胃肠道有一定健康促进作用。此外，经模拟肠液(pH6.5)处理2h后，各样品的活菌数基本维持不变，这说明不同配方对益生菌均有较好的保护效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、菌株活化培养；
S2、筛选抗冻增殖培养基；
S3、进行亚致死处理；
S4、加入保护剂，冷冻干燥，得到益生菌菌粉。
2.根据权利要求1所述的一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述菌株为鼠李糖乳杆菌LR22(LactobacillusrhamnosusLR22)，干酪乳杆菌LC61(LactobacilluscaseiLC61)和乳双歧杆菌BB12(Bifidobacterium lactisBB12)。
3.根据权利要求1所述的一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述抗冻因子为山梨醇、谷氨酸、氯化钠的混合物，所述抗冻因子配比为山梨醇0.05％，谷氨酸0.048％，氯化钠0.4％。
4.根据权利要求1所述的一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述亚致死处理包括冷休克，热休克和酸休克。
5.根据权利要求4所述的一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：所述热休克处理温度为40-50℃，时间为20-40min；所述冷休克处理温度为4-20℃，时间为30-120min；所述酸休克处理pH为4-5，时间为30-120min。
6.根据权利要求1所述的一种益生菌菌粉制备方法，其特征在于：所述保护剂中包含糖类、蛋白质类、氨基酸类、维生素类、无机盐类中的一种或几种。
7.一种添加益生菌菌粉的羊乳粉，其特征在于，包括如下重量份计的原料：1kg最终配方羊奶粉产品中益生元添加量均为低聚半乳糖25g，水苏糖15g，低聚木糖15g，益生菌添加量为1.0g益生菌复合菌粉(菌种比例为LR22：BB12：LC61＝1:1:1)，儿童配方羊奶粉中再添加AA13g、DHA7g、牛磺酸0.5g、葡萄糖酸锌600mg，运动员配方羊奶粉中再添加乳清蛋白50g，中老年配方羊奶粉再添加植物甾醇酯50g，孕妇配方奶粉再添加维生素B94mg、维生素B1266μg、酵母葡聚糖25g。
8.根据权利要求7所述的一种添加益生菌菌粉的羊乳粉，制备方法为：采用干湿法复合工艺，加入益生菌菌粉、益生元和功能因子制备儿童配方羊奶粉、运动员配方羊奶粉、中老年配方羊奶粉、孕妇配方羊奶粉。
9.根据权利要求8所述的一种添加益生菌菌粉的羊乳粉，所述功能因子包含花生四烯酸(AA)、二十二碳六烯酸(DHA)、牛磺酸、葡萄糖酸锌、乳清蛋白、植物甾醇酯、酵母葡聚糖、维生素B9和B12中的一种或几种。
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