CN1656379A - 分析血清中酶原形式的***特异抗原以提高***癌检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提高了检测和确定***癌存在的试验。所述试验能够检测游离PSA与总PSA的比例显著高的男人群体中的***癌。所述试验能够检测低量总PSA，即范围为2－4ng/ml的男人群体中的***癌。根据本发明的一个实施方案，所述试验包括下列步骤：(a)确定患者生物样品中所含的总PSA的量，(b)确定同一样品中游离PSA的量，并且计算游离PSA与总PSA的比例，(c)确定同一样品中pPSA的量，以及(d)基于总PSA的水平和游离PSA％，通过将pPSA的量与采用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所确立的预定值进行比较，使样品中所含的pPSA的量与患者中***癌的存在相关。

Description

分析血清中酶原形式的*** 特异抗原以提高***癌检测的方法

发明领域

总的来说，本发明涉及检测和鉴定蛋白以及蛋白的各种形式和亚基，其作为诊断标记具有潜在的用途。具体而言，本发明涉及检测血清中失活前体形式的***特异抗原以及***癌检测改进的方法。

发明背景

血清***特异抗原(PSA)的测量广泛用于筛选和早期诊断***癌(1-3)。通过当今临床免疫分析可测量的血清PSA主要以游离“非复合的”形式(游离PSA)存在或以与α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的复合物形式存在(4-5)。血清中游离PSA与总PSA的比例已表明可显著提高PCa与BPH的辨别，以较高的比例相关于较低风险的***癌(6-7)。

游离PSA水平在血清中变化的生物学机理是未知的。已经变成复合的血清PSA可能是相对均一的，因为它代表了酶活性的完整的PSA。从PAS-ACT复合物释放的PSA在***癌(PCa)和良性***增生(BPH)血清中发现与***PSA是不可区分的，正确认了这种假设(8)。由此得出结论，游离PSA可提供更好的生化指标(insight)，以及表征游离PSA的分子形式可帮助阐明其***起源和释放到血清中的机理。然而，在诊断相关的范围接近10ng/ml时，利用目前技术努力从血清中纯化和表征低水平的PSA一般尚未被视为可行。迄今为止，研究主要集中在PSA水平非同寻常高，100s或1000s的ng/ml PSA的男人血清上。本发明人报道了在收集的含有63ng/ml总PSA的PCa血清中存在截短形式的proPSA(pPSA)(9)。但是，其他组在含有更高水平的PSA的血清中没有鉴定到pPSA。尽管建议采用高水平血清PSA进行研究，但是共同缺点在于该PSA可能不反映的通常存在于疾病的早期阶段PSA的种类或百分比，其中PSA为10ng/ml或更低。从大的原发性肿瘤损伤或转移性疾病中释放的PSA比从早期可能是低级疾病中释放的PSA具有不同的生化特性。因此，为了用作临床检测早期***癌中的助手，截短的pPSA形式必须在诊断上相关水平的总PSA接近10ng/ml的血清中，以显著水平存在。

当总PSA水平接近10ng/ml时，游离PSA比例或百分比较高的男人更有可能患有良性疾病。研究已经表征了这些水平的游离PSA，并且例如已经建议总PSA以游离PSA存在大于25％的男人不必对癌症进行活检，因为癌症在这些病例中只有8％的可能性。然而，没有已知的诊断方法可用于帮助在8％癌症可能性的男人群体中进一步检测***癌。此外，当总PSA为2.5-4ng/ml，许多癌症存在，但出现的概率低于总PSA为4-10ng/ml的情形。目前，利用游离PSA的比例在2.5-4ng/ml范围中提高癌症检测的努力还未建立诊断价值。

所以，仍需要开发用于改进检测和确定患者中早期***癌的试验。

发明概述

本发明基于下列意料之外的发现：pPSA异型，例如[-2]pPSA形式，在游离PSA与总PSA的比例显著提高的特定亚群的男人，尤其在游离PSA大于25％的男人中具有升高的癌症预测值。此外，本发明还发现，当患者样品中的总PSA为2-4ng/ml范围时，pPSA在鉴定高百分比的患有***癌的男人中可能也是有效的，在所述范围中，存在许多癌症，但是出现率较低。因此，本发明提供了手段，以帮助在癌症更稀罕的男人的特别群体中，以及在当前利用免疫试验无法检测***癌的地方检测***癌。

因此，基于本发明的发现，本发明的一方面提供诊断方法，以帮助检测和/或确定个体中***癌的存在，或帮助区分个体中的***癌和BPH。根据本发明的实施方案，这种方法包括下列步骤：

a)确定患者生物样品中所含的总PSA的量；

b)确定样品中游离PSA的量；以及计算游离PSA与总PSA的比例；

c)确定样品中pPSA的量；以及

d)基于总PSA的水平和游离PSA％，通过将pPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所确立的预定值进行比较，使样品中所含的pPSA的量与患者中***癌的存在相关。

根据本发明的实施方案，总PSA的范围可以为2-10。游离PSA与总PSA的比例大于10％-25％。或者，总PSA的范围可以为2.5-4ng/ml，而游离PSA的比例小于15％。pPSA可以为[-2]pPSA，[-4]pPSA或[-5/-7]pPSA。特别地，pPSA为[-2]pPSA。样品为血清或血浆。

用于诊断或区分***癌和BPH的试剂盒也包括在本发明的实施方案中。

附图简述

图1示出了接受者操作特征(ROC)分析[2，4，5，7]pPSA/游离PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，与患有癌症和BPH以及总PSA为4-10ng/ml的男人中的游离PSA/总PSA(％F)比较。

图2示出了ROC分析[2]pPSA/游离PSA(％[-2]pPSA)，与患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中游离PSA/总PSA(％F)的比较。

图3示出了ROC分析[-2]pPSA，与患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中游离PSA/总PSA(％F)的比较。

图4示出了ROC分析[-2]pPSA，与患有癌症或BPH，总血清PSA为4-10ng/ml以及游离PSA大于20％的男人中游离PSA/总PSA(％F)的比较。

图5示出了ROC分析[-2]pPSA，与患有癌症或BPH，总血清PSA为4-10ng/ml以及游离PSA大于25％的男人中游离PSA/总PSA(％F)的比较。

图6为图5的[-2]pPSA数据的点印迹，显示界限为0.053ng/ml。

图7示出了ROC分析[2，4，5，7]pPSA/游离PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，与患有癌症和BPH以及总血清PSA为2.5-4ng/ml的男人中的游离PSA/总PSA(％F)的比较。

图8示出了ROC分析[2，4，5，7]pPSA/游离PSA(％[2，4，5，7]pPSA，％[-2]+[-4]+[-5]+[-7]pPSA的和)，与患有癌症和BPH，总血清PSA为2.5-4ng/ml以及游离PSA小于15％的男人中游离PSA/总PSA(％F)的比较。

优选实施方案的详述

本发明的一个方面提供了诊断方法，以帮助检测和/或确定个体中***癌的存在，或者帮助区分个体中***癌和BPH。根据本发明的实施方案，这种方法包括下列步骤：

a)确定患者生物样品中所含的总PSA的量；

b)确定样品中游离PSA的量；以及计算游离PSA与总PSA的比例；

c)确定样品中pPSA的量；以及

d)基于总PSA的水平和游离PSA％，通过将pPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所确立的预定值进行比较，使样品中所含的pPSA的量与患者中***癌的存在相关。

总PSA和游离PSA的测量方法是本领域众所周知的，在此不再赘述。对于本发明而言，术语“总PSA”是指免疫学上可用的PSA形式，包括游离PSA和PSA与ACT的复合物。本发明所用的术语“游离PSA”是指不与其他任何蛋白复合但在溶液中以30kDa蛋白形式存在的PSA。

如本发明所用，术语“proPSA”，“pPSA”，“proPSA多肽”，以及“pPSA多肽”可以互换，并且优选包括所有失活前体形式的PSA，包括但不限于[-2]proPSA，[-4]proPSA，[-7]proPSA以及[-5]proPSA。

pPSA的量可通过本发明所述，或本领域公知，或将来开发的任何方法测量，只要它们能够进行这种测量。根据本发明的一个实施方案，样品中所含的pPSA可通过包括下列步骤的方法进行测量：将特异性结合于proPSA的因子与样品在允许形成包含proPSA和因子的二元复合物的条件下接触，以及检测和确定复合物的量。

对于本发明而言，因子可以是能够以足够特异性结合于pPSA的任何分子种类。如果结合使得包含因子和pPSA的复合物形成并且确定复合物的量，则结合特异性就是足够的。潜在分子种类的例子包括但不限于抗体，衍生自抗体的抗原结合片段以及抗体等同物，诸如但不限于适体(aptamer)等。对于本发明而言，特异于pPSA的因子可通过本领域公知的方法加以选择。例如，任何已知的结合试验均可用于确定任何给定因子的特异结合活性。

根据本发明的实施方案，proPSA可通过免疫测定方法进行测量。可用于确定本发明的proPSA的量的抗体和免疫测定描述在在审U.S.申请No.09/251,686，09/302,965，09,792,692；和09,792,534中，内容在此以其全文引作参考。具体而言，在哺乳动物细胞中表达PSA以及制备特异于PSA的抗体的细节提供在在审U.S.专利申请No.09/251,686和09/302,965中。如该在审申请所述，proPSA多肽或对应于proPSA区的肽可表达和分离自哺乳动物细胞。一旦分离，proPSA肽可用于制备抗pPSA抗体。

怎样制备抗-pPSA抗体的详细方法还描述在在审U.S.申请No.09,792,692中。简而言之，根据本发明，用于生成抗体的proPSA多肽包括但不限于-7，-5，-4和-2proPSA。对应于proPSA区域的肽也可用于生成抗pPSA抗体，并且包括所有含有任何部分的pPSA多肽前区的肽。这些肽优选含有约8-15个氨基酸，并且包括免疫原性表位。根据本发明的实施方案，通过本发明产生的抗体优选与本发明的proPSA特异性免疫反应和结合。如本发明所用的“特异性免疫反应或特异性结合”表示本发明的抗体识别和结合proPSA的交叉反应性，与识别和结合其他形式的PSA，诸如其他截短或非截短的成熟形式的PSA相比低10％。特异性结合proPSA的单克隆抗体的例子包括但不限于PSIZ134，PSIZ120，PSIZ125，PSIZ80，PS2P206，PS2P309，PS2P446，PS2X094，PS2X373，PS2V411和PS2V476。例如，单克隆抗体PS2P446特异于[-7]/[-4]pPSA。PS2X373特异于[-2]pPSA。PS2V476特异于[-4]pPSA。

本发明的抗体可用于检测和确定样品中proPSA的存在及其量，还可用于检测和确定样品中不同形式的proPSA的存在及其量。用于检测和确定proPSA或不同形式的proPSA的量的免疫测定的详细描述提供在在审U.S.专利申请No.09,792,534中，在此不再赘述。

本发明用于确定生物样品中所含的任何目的PSA的量的典型免疫测定包括下列步骤：将特异性与目的PSA结合的抗体与样品在允许形成含有PSA和抗体的二元复合物的条件下接触；以及(b)检测和确定复合物的量。对于本发明而言，任何能够与proPSA形成可检测复合物的因子可视为抗体的等同物。

通常，本发明的任何PSA在样品中的定性和/或定量确定都可通过竞争或非竞争性免疫测定步骤以直接或间接方式完成。这种免疫测定的例子有放射性免疫测定(RIA)和夹心(免疫测定(immunometricassay))试验。利用本发明的单克隆抗体检测抗原可以通过以正向，反向或双向的方式运行的免疫测定，包括对生理学样品进行的免疫组织化学试验来实施。本领域的专业技术人员会知道，或者可容易地辨别其他免疫测定方式而无需过多的实验。

术语“免疫测定试验”或“夹心免疫测定”包括双向夹心，正向夹心以及反向夹心的免疫测定。这些术语为本领域专业技术人员所熟知。本领域的专业人员还会意识到，本发明的抗体在试验的其他变体和形式中将是有用的，这些变体和形式无论是现今公知的还是将来有待开发的，都欲包括在本发明的范围内。

对于本发明而言，生物样品可以是任何含有本发明的proPSA的人生理流体样品。人生理生理流体样品的例子包括但不限于血清，***，尿和血浆。此外，单克隆和多克隆抗体均可使用，只要这种抗体对本发明所提供的抗原具有必要的特异性。优选的是采用单克隆抗体。

根据本发明的实施方案，免疫测定包括特异于[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5/-7]pPSA的试验。在患有已知***癌或BPH的男人的血清中测量特异形式的pPSA，以及这些分析物的水平用来开发算法以区分***癌和良性***病。本发明免疫测定可用来检测人生理样品，诸如血清和组织中的pPSA，其目的是帮助诊断和监测***癌。本发明的试验也可用来帮助区分***癌和良性***增生。

本发明令人惊奇的发现，当分析总PSA为4-10ng/ml以及游离PSA％大于20％，或尤其大于25％的血清样本时，pPSA，例如[-2]pPSA，或[-2]，[-4]和[-5/-7]pPSA的和具有显著升高的癌症预测值。此外，在总PSA介于2.5-4ng/ml以及游离PSA低于15％的血清样本中，pPSA显示增加的癌症预测值。因此，在特定亚群的总PSA和游离PSA％内，pPSA异型具有显著升高的癌症预测值。在系列样品的整个游离PSA％的范围中，pPSA异型也可显示增加的癌症区分。当选择选定的游离PSA％范围或界限时，这种效果得以显著增强。下述实施例显示在游离PSA大于25％的血清中，一定界限以上的％[-2]pPSA能够从13个错失的癌症中检测出11个。

因此，根据本发明的实施方案，样品中总PSA约2-10ng/ml。当总PSA的量介于2-4ng/ml的范围时，样品中游离PSA与总PSA的比例可大于10-25％，或小于15％。在特殊的实施方案中，总PSA为4-10ng/ml，而游离PSA的比例为大于20％，或25％。

对于本发明而言，在患者样品中检测的pPSA的量可以以任何生成诊断值用于确定***癌存在的方式与***癌的存在相关。根据本发明的实施方案，将pPSA的量与预定值比较用于确定***癌的存在。鉴于本发明的教导，本领域专业技术人员通过常规实验可容易地确定“预定的界限值”(或阈值)或其他对pPSA的水平用于确定***癌存在所必需的分析参数。例如，可在诊断有***癌的个体与没患有***癌或BPH的个体中比较上述pPSA的比例，以确定界限值。接受者操作特征(ROC)分析可以以要求的特异性和灵敏度用来确定界限值。ROC分析在本领域中是公知的，并且详细描述在参考文献13(13)中，相关内容在此以其全文引作参考。然后，样品中pPSA的量可与预定的界限值进行比较，以确定个体中***癌的存在，其中较高水平的pPSA可以指示***癌。以要求的特异性和灵敏度确定界限值的这种方法和其他方法在本领域是众所周知的，无需在此重复(14-21)。

参照下列实施例进一步对本发明加以描述。

实施例I

分析患有癌症和良性疾病的总PSA为4-10ng/ml的血清

材料和方法

开发针对pPSA的单克隆抗体(mAbs)

通过小鼠免疫有附着于匙孔血蓝蛋白(Pierce Chemical Co.Rockford，IL)的肽开发针对[-2]和[-4]pPSA的mAbs。对于[-2]pPSA而言，前肽为SRIVGGWECEK，而对于[-4]pPSA而言，肽为ILSRIVGGWECEK。通过常用方法学19生产杂交瘤，而由与上述各自肽的反应性挑选抗体克隆，与对照肽成熟PSA，IVGGWECEK，没有反应性。依据在Western印迹上识别纯化的[-2]和[-4]pPSA蛋白的能力，进一步筛选克隆。当在还原条件下进行SDS-PAGE电泳时，通过Western印迹，PS2X373与成熟PSA蛋白显示出约20％的交叉反应性。然而，在非还原条件下，交叉反应性降低至5％或更少，因此这些条件用于检测结果中的[-2]pPSA。通过标准免疫测定技术在微滴定板中利用肽免疫原生成的克隆没有一个能够识别溶液中的天然[-2]或[-4]pPSA蛋白。

通过小鼠免疫有附着到人激肽释放酶2的由PSA prepro前导肽组成的纯化的重组嵌合蛋白，获得针对全长[-7]pPSA的mAbs 16，20。依据识别天然重组pPSA，以及不识别天然成熟PSA，筛选克隆。通过免疫测定，发现这些mAbs识别[-7]pPSA和[-5]pPSA，并因此这些抗体在试验形式中可交替的称为[-7]pPSA或[-5，-7]pPSA的试验。

从哺乳动物细胞中分离重组pPSA

如前所述，重组PSA表达在哺乳动物AV12细胞中。用尽的培养基传递到PSA特异mAb，PSM773上。PSM773先前已经显示对成熟PSA，截短形式的PSA和前体形式的PSA具有特异性(10-12)。用40倍体积的含有0.1％还原Triton-X 100的PBS冲洗柱子，结合蛋白用含有200mM氯化钠的100mM甘氨酸pH 2.5洗脱。洗脱液立即用10％％vol/vol IM Tris pH8.0中和。纯化的PSA不含有成熟的PSA，但含有通过HIC-HPLC纯化(12)的[-5/-7]，[-4]和[-2]pPSA分子异型的pPSA。

免疫测定PSA

PSA在血清和纯化的制剂中的浓度通过Tandem-MP PSA和Tandem-MP游离PSA试验(Hybritech Incorporated，San Diego，CA；Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)确定。

免疫测定[-2]，[-4]和[-5/-7]pPSA

本发明人已经开发了如下用于测量pPSA形式的免疫测定。将50ul生物素酰化的抗PSA Ab PSM 773的TandemPSA零cal稀释剂(5ug/ml)加入EG&G Wallac链亲和素包被的微滴定板，并且在室温下振荡反应1小时。然后，用TandemE洗涤液洗涤板5次。接着将50ul的TandemPSA零cal稀释剂加入板中，随后加入50ul的待测血清或抗原。如上让混合物室温下反应2小时。用TandemE洗涤液洗涤板5次。向板中加入100ul合适的铕标记的检测mAb的ImA溶液，用于测量各种形式的pPSA。对于[-2]pPSA，检测mAb为PS2X373；对于[-4]pPSA，为PS2V 411；以及对于[-5/-7]pPSA，为PS2P309。同上让混合物室温下反应1小时。然后用TandemE洗涤液洗涤板5次，并且在EG&G Wallac Victor仪上读数。

接受者操作特征(ROC)曲线分析

采用MedCalc软件程序(MedCalc Software，Belgium，([email protected]))生成ROC分析和图。理论和实践描述在：Zwieg和Campbell，接受者操作特征(ROC)：临床医学中的基本评价工具(Receiver operating characteristic(ROC)：a fundamental evaluation toolin clinical medicine)，Clinical Chemistry，39，561-577，1993。

结果

在303个血清样品上，对总PSA，游离PSA和[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5/-7]pPSA免疫试验进行测量，所述样品含有已知诊断为107个癌症和196个良性疾病。计算各个组分的值，并且表示成ng/ml的血清。为了生成ROC曲线分析，将各个PSA异型的血清值输入MedCalc程序。ROC是统计学方法，其对一群中的各个样品赋予癌症的阳性和阴性预测值，并且是最广泛使用的方法以评价作为癌症预测器的PSA以及游离PSA试验的值和性能。以最简单的术语，对于各个ROC分析曲线下面积AUC用于评价试验预测值。较高的AUC值指示更好的总预测值。ROC值范围从0.5(随机机会上没有改进)到1.0(100％预测值的完全试验)。

在大多数情况下，ROC分析的目的是使辨别患有癌症的男人的最大化，以及使对那些没患有癌症，即假阳性的男人活检最小化。当分析诸如血清中PSA的生物样品时，在真阳性和假阳性的检测之间存在平衡。例如，取决于所需的结果，最期望的是检测95％的癌症，而对那些患有良性疾病的男人，这不可避免地伴随着高的假阳性率。在游离PSA％的情形下，例如，为了检测95％的癌症，它要求游离PSA小于25％的所有男人进行活检。然而，这却伴随着80％的假阳性率。在不同情形下，最期望的是使假阳性率最小化，在此仅有小百分比的真正癌症会得以检测。当用癌症发生率相对小的大群体处理时，这第二种范例可能是期望的。对整个群体进行活检不是可行的，因此人们确立了平衡并且检测如对给定数目的活检可行的一样多的癌症。这些假设的例子表示ROC分析的评价和值不是绝对的，并且在本发明采用pPSA的情形下，将需要试验以建立有待在实践中使用的真正参数。但是，鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该能够容易地确定必要的参数，而无需过多的试验。下文给出的实施例表明pPSA在检测给定群体中以及在给定组的标准下的癌症的值和功效，但是pPSA的用途和界限不限于这些实施例。

在PSA测试领域，已知游离PSA％与只有总PSA比较在早期癌症检测范围为4-10ng/ml的总PSA中提高了癌症检测。在图1所示的样品组中，游离PSA％比PSA也具有较高的预测值，因此在这些样品中的pPSA测量与游离PSA％比较对提高癌症预测值的能力加以评价。图1示出了％F(游离PSA％，或游离/总PSA)和％[2，4，5，7]pPSA(所有pPSA形式的和除以游离PSA，即由所有pPSA形式组成的游离PSA的百分比)的比较。在这种情形下，％[2，4，5，7]pPSA比％F示出了适度的提高，正如所见，相对％F，其AUC较高，为0.698对0.631。

图2使用稍微不同的范例，并且比较了单个pPSA组分％[-2]pPSA与％F。这种比较的AUC显示两种分析物均具有几乎同等的检测癌症的能力。图3示出[-2]pPSA与％F的比较。在此种情形下，[-2]pPSA表示了这种前体形式在血清中的ng/ml，而非游离PSA％。AUC分析表明[-2]pPSA本身比游离PSA％预测癌症的能力较小。

然而，图4中，对303个全部样品群中的子集进行了分析。只有那些游离PSA大于20％的男人才筛选出来用于ROC分析。这代表了303个样品中的120个。尽管整个群含有35％癌症，但这120个样品亚组仅含有23％癌症，这与随着％F增加癌症相对百分比降低的总趋势一致。图4中，在游离PSA大于20％的男人中，测量％F几乎没有预测癌症的能力，AUC为0.504。相比之下，在同样范围内，[-2]pPSA显示了显著提高的预测癌症的能力，如AUC为0.674所示。因此，在游离PSA％升高的群体中，[-2]pPSA显示了癌症检测的更高的特异性，其中癌症更少和更难以检测。

更迅速和实际应用这种现象可见于图5中。在该图中，只对游离PSA大于25％的男人进行了分析。在真正随机筛选群中，建议游离PSA大于25％的男人不对癌症进行活检，这是因为癌症发现的可能性仅约有8％。由于在该组中没有常规血检预测癌症，因此该组男人中的癌症在正常情形下往往保持不被检测。图5显示[-2]pPSA对该组中癌症具有高度增强的预测值，AUC为0.743。游离PSA大于25％处比在游离PSA界限大于20％中，[-2]pPSA的AUC甚至更高，该事实证实了下列全部观察结果：随着游离PSA％升高，[-2]pPSA变成癌症的更好的预测器。难以预料的是pPSA形式会在特定范围或界限的游离PSA％中，显示选择性癌症预测。

如何使用pPSA试验的实际例子可见于图6中，显示了在图5中单个值的点阵图，从生成图5的同一程序中绘制。在游离PSA大于25％的群体中，有13个癌症和51个非癌症，假设主要是BPH。使用界限0.053ng/ml[-2]pPSA，人们可检测13个癌症中的11个(85％灵敏度)，而活检仅在该组中测出51个非癌症中的含17个(67％特异性)。再者，给出这作为pPSA如何可用于检测***癌的例子，但不暗含0.053ng/ml[-2]pPSA为用于这些类型的样品的最终界限。对患有已知癌症和BPH的较大对照群体进行更广泛分析，会用于确定适当的界限值。如早先所述，这不是采用不同群体患者的可以期望的唯一方法。

虽然未示出游离PSA大于25％的样品，其他pPSA形式诸如％[-2]pPSA，[-2]pPSA/总PSA，％[2，4，5，7]pPSA和其他形式与％F比较示出了改进的ROC AUCs。

实施例II

分析患有癌症和良性疾病的男人的含有总PSA为2.5-4ng/ml的血清

如实施例1一样，在这群总PSA值为2.5-4ng/ml的患者中对同样系列的PSA试验进行测量。在总共286个样品中有109个癌症和177个良性疾病样品。范围2.5-4ng/ml为一区域，其中存在许多癌症，但在随机筛选群体中比4-10ng/ml患者的发生率较低。目前试图使用％F提高该范围中的癌症检测尚未建立诊断值。

图7示出了％[2，4，5，7]pPSA与％F的ROC比较。％[2，4，5，7]pPSA对癌症示出了显著提高的预测值。在图8中，只有游离PSA低于15％的样品进行ROC分析。％[2，4，5，7]pPSA比％F显示甚至更显著的AUC增加，指示改进的癌症预测值。这是下列情形的一个例子，其中存在癌症概率低的大群体，并且在此情形下通过设定参数以仅挑选癌症概率非常高，即特异性高的那些样品，使假阳性最小化是最期望的。

讨论

这些例子表明，总体上pPSA异型的游离PSA与游离PSA比较充当癌症检测的独立标记。这在当今诊断目的PSA为2.5-10ng/ml的整个范围中是真实的。所有pPSA异型或单个异型的pPSA的和提高了患者群体中的癌症检测，如早先在下列申请中提出的一样：1999年4月30日提交的申请No.09/302,965(其是1999年2月17日提交的申请No.09/251,686的部分继续申请，而这又是1997年4月30日提交的申请No.08/846,408的继续申请)。

然而，不可预料的是，迅速增加的预测值在由其％F分层抽样的样品中将是如此显著。这是新的发现，并且暗示pPSA和游离PSA在血清中的总百分比之间的复杂关系。为了提高癌症检测和减少不必要的活检，pPSA的测量可应用在早期诊断为2-10ng/ml PSA的整个范围中。结果中所给出的例子表明pPSA异型对***癌检测的实用性，并且暗示一些相关例子，但是这些例子并不表示采用不同范围的PSA，游离PSA％或pPSA界限来限制其他潜在的应用。

参考文献：

1.Catalona，W.J.，Smith，D.S.，Ratliff，T.L.，Dodds，K.M.，Coplen，D.E.，Yuan.J.J.，Tetros.J.A，和andriole.G.L.血清中***特异抗原的测量作为***癌的筛选测试(Measurement of prostate-specificantigen in serum as a screening test for prostate cancer)，N.Engl.J.Med.，324：1156-1161，1991。

2.Oesterling，J.E.***特异抗原：对***腺癌最有用的肿瘤标记的临界评价(Prostate-specific antigen：a critical assessment of themost useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate)，J.Urol..145：907-923，1991。

3.Labrie，F.，Dupont，A.，Suburu，R.，Cusan.L.，Trembla.M.，Gomez，J.L.，和Emond，J.血清***特异抗原作为***癌的预先筛选测试(Serum prostate specific antigen as pre-screening test for prostatecancer)，J.Urol.，147：846-851，1992。

4.Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.，Matikainen，M.T.，Nilsson，O.，Pettersson，K.，和Lovgren，T.血清中的***特异抗原主要以与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物的形式出现(Prostate-Specific Antigen inSerum Occurs Predominantly in Complex with α1-Antichymotrypsin)，Clin.Chem，37：1618-1625，1991。

5.Stenman，U.H.，Leinonen，J.，Alfthan，H.，Rannikko，S.，Tuhkanen，K.和Alfthan，O.***特异抗原与α1-抗胰凝乳蛋白酶之间的复合物是患有***癌的患者血清中主要形式的***特异抗原：复合物的试验提高了癌症的临床灵敏度(A complex between prostate-specificantigen andα1-antichymotrypsin is the major form of prostate-specificantigen in serum of patients with prostatic cancer：assay of the compleximproves clinical sensitivity for cancer)，Cancer Res.，51：222-226，1991。

6.Catalona，W.J.，Partin，A.W.，Slawin，K.M.，Brawer，M.K.，Flanigan，R.C.，Patel，A.，Richie，J.P.，Dekernion，J.B.，Walsh，P.C.，Scardino，P.T.，Lange，P.H.，Subong，E.N.，Parson，R.E.，Gasior，G.H.，Loveland，K.G.，和Southwick，P.C.采用游离***特异抗原的百分比增加***癌与良性***疾病的区分：未来多中心临床试验(Use ofthe percentage of free prostate-specific antigen to enhance differentiationof prostate cancer from benign prostatic disease：a prospective multicenterclinicaltrial)，JAMA，279：1542-1547，1998。

7.Woodrum，D.L.，Brawer，M.K.，Partin，A.W.，Catalona，W.J.和Southwick，P.C.游离***特异抗原临床研究对***癌检测的解释(Interpretation of free prostate-specific antigen clinical research studiesfor the detection of prostate cancer)，J.Urol.，159：5-12，1998。

8.Peter，J.，Unverzagt，C.和Hoesel，W.游离***特异抗原(PSA)在从与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)中通过化学释放后的分析(Analysis of free prostate-specific antigen(PSA)after chemicalrelease from the complex with alpha(1)-antichymotrypsin(PSA-ACT))，Clin.Chem.，46：474-482，2000。

9.Mikolajczyk，S.D.，Grauer，L.S.，Millar，L.S.，Hill，T.M.，Kumar，A.，Rittenhouse，H.G.，Wolfert，R.L.，和Saedi，M.S.前体形式的PSA(pPSA)为游离PSA在***癌血清中的组分(A precursor form ofPSA(pPSA)is a component of the free PSA in prostate cancer serum)，Urology，50：710-714，1997。

10.Wang，T.J.，Linton，H.J.，Sokoloff，R.L.，Grauer，L.S.，Rittenhouse.H.G.和wolfert，R.L.通过SDS-PAGE Western印迹分析PSA和PSA片段的抗体特异性(Antibody specificities for PSA and PSAfragments by SDS-PAGE Western blot analysis)，Tumor Biology，20：75-78，1997。

11.Finlay，J.A.，Day，J.R.和Rittenhouse，H.G.***特异抗原的多克隆抗体和单克隆抗体可与人激肽释放酶2和人激肽释放酶1交叉反应(Polyclonal and Monoclonal Antibodies to Prostate-Specific Antigencan Cross-React with Human Kallikrein 2 and Human Kallikrein 1)，Urology，53：746-751，1999。

12.Kumar，A.，Mikolajczyk，S.D.，Goel，A.S.，Millar，L.S.和saedi.M.S.由哺乳动物细胞表达前体形式的***特异抗原并通过人激肽释放酶2将其转化为成熟的活性形式(Expression of pro form ofprostate-specific antigen by mammalian cells and its conversion to mature，active form by human kallikrein 2)，Cancer Res.，57：3111-3114，1997。

13.Dawson，J.M.1999.临床试验：分析和呈递。在第26届医学诊断制造商协会年会上的发言(Clinical Trials：Analysis and Presentation，Presented at the 26TH Annual Meeting of the Association of MedicalDiagnostics Manufacturers)，可获自http://www.amdm.or/AMDM/NewsletterV12-2-2.html。

14.Linnet，K.1999.对基于回归分析的方法比较研究所必需的样品大小(Necessary sample size for method comparison studies based onregression analysis)，Clin.Chem.，45：882-94。

15.Linnet，K.1993.回归程序对比较方法研究的评价(Evaluationof regression procedures for methods comparison studies)，Clin.Chem.，39：424-32。

16.Bland，J.M.，Altman，D.G.1986.用于评价两种临床测量方法之间一致性的统计学方法(Statistical methods for assessing agreementbetween two methods of clinical measurement)，Lancet，i：307-10。

17.Reid，M.C.，Lachs，M.S.，Feinstein A.R.1995.方法学标准在诊断测试研究中的应用正变得更好但仍然不是最好(Use of methodologicstandards in diagnostic test research.Getting better but still not good)，JAMA，274：645-51。

18.Krouwer，J.S.累积分布分析图--ROC曲线的替代(Cumulative distribution analysis graphs-an alternative to ROC curves[Tech Brief])，Clin.Chem.，33：2305-6。

19.Albert，A.1982.有关使用和计算临床化学中的可能性比例(Onthe use and computation of likelihood ratios in clinical chemistry)，Clin.Chem.，28：1113-9。

20.Solberg，H.E.1978.判别式分析(Discriminant analysis)，Crit.Rev.Clin.Lab.SCi.，9：209-42。

21.Matthews，J.N.S.，Altman，D.G.，Campbell，M.J.，Royston，P.1990.医学研究中系列测量的分析(Analysis of serial measurements inmedical research)，Br.Med.J.，300：230-5。

Claims (14)

1.一种帮助检测或确定患者中***癌的存在的方法，包括下列步骤：

a)确定患者生物样品中所含的总PSA的量；

b)确定样品中游离PSA的量；以及计算游离PSA与总PSA的比例；

c)确定样品中pPSA的量；以及

d)基于总PSA的水平和游离PSA％，通过将pPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所确立的预定值进行比较，使样品中所含的pPSA的量与患者中***癌的存在相关。

2.权利要求1的方法，其中所述样品为血清或血浆。

3.权利要求1的方法，其中总PSA为2.5-10ng/ml，游离PSA与总PSA的比例大于20％，以及pPSA的量高于预定值指示***癌的存在。

4.权利要求3的方法，其中总PSA为4-10ng/ml。

5.权利要求4的方法，其中游离PSA与总PSA的比例大于25％。

6.权利要求1的方法，其中总PSA为2.5-10ng/ml，游离PSA与总PSA的比例选自5％-25％，以及pPSA的量高于预定值指示***癌的存在。

7.权利要求6的方法，其中总PSA为4-10ng/ml。

8.权利要求1的方法，其中pPSA选自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA。

9.权利要求1的方法，其中pPSA为选自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA的任意组合。

10.权利要求8的方法，其中pPSA为[-2]pPSA。

11.权利要求1的方法，其中总血清PSA为2.5-4ng/ml。

12.权利要求11的方法，其中游离PSA与总PSA的比例选自5％-25％。

12.权利要求11的方法，其中游离PSA与总PSA的比例小于15％。

13.权利要求1的方法，其中总PSA选自增量从2.0到10.0ng/ml的任意组合。

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