CN111593136B - 一种小麦千粒重相关snp标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦千粒重相关SNP标记及其应用，涉及的是小麦分子育种的技术领域，包括与小麦千粒重相关的SNP标记，所述SNP标记位于小麦4B染色体540326609bp处，且这一SNP标记的核苷酸为C/G，同时本发明还提供了判断小麦千粒重的方法，包括提取小麦DNA，并利用对应的引物对进行扩增，对扩增产物酶切，根据酶切结果判断小麦千粒重的类型；本发明为小麦千粒重选型提供了一种新的检测手段，检测方法简便，有助于提高分子标记选择的目标性和针对性，从而提高小麦高产分子育种的效率。
Description
技术领域
本发明涉及的是小麦分子育种的技术领域，尤其涉及的是一种小麦千粒重相关的SNP标记及其应用。
背景技术
小麦是世界上种植最广泛的粮食作物，也是人类食物的主要来源。提高小麦产量是满足人口快速增长和人民生活水平不断提高的重要前提。亩穗数、穗粒数和千粒重是构成小麦产量的三要素，其中千粒重的遗传力最高，受环境影响最小。因此，通过解析千粒重形成的遗传机制进而改良千粒重是提高小麦产量的有效途径。在前人研究中，一些千粒重相关QTL已被广泛报道(Cui et al.2014；Xin et al.2019；Cao et al.2020)，部分千粒重基因也已被克隆，主要位于1A、1B、第2同源群、3A、3D、4A、5A、5D、第6同源群和第7同源群(Maet al.2012；Zhang et al.2015；Miao et al.2017；Yan et al.2019)。尤其是7A染色体上，已有多个千粒重基因被鉴定，如TaSus1-7A,6-SFT-A2,TaGASR-A1,TaTGW-7A,TaMOC1-7A,TaSAP1-A1等(Hou et al.2014；Yue et al.2015；Dong et al.2014；Hu et al.2016；Zhanget al.2015；Chang et al.2013)。这些基因的克隆以及功能标记的开发，为小麦高产分子聚合育种提供了重要的基因资源和分子工具。然而，小麦千粒重受多基因共同控制，不同材料其遗传机制也可能不同。因此，从不同小麦材料中鉴定更多的千粒重新位点/基因，并开发与其紧密连锁的分子标记，将有助于通过多基因聚合手段进一步提高小麦产量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小麦千粒重相关SNP标记及其应用，以从不同小麦材料中鉴定更多的千粒重新位点确定一段用于开发新千粒重主效位点Qtgw.ahau-4B.1代表性CAPS标记的模板序列；
同时本发明还提供一种用于扩增上述CAPS标记的引物对，以便于对CAPS标记进行扩增；
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述CAPS标记进行小麦千粒重鉴定的方法，以解决小麦千粒重无法迅速鉴定的问题。
本发明提供1、一种与小麦千粒重相关的SNP标记，所述SNP标记位于小麦4B染色体540326609bp处，且这一SNP标记的核苷酸为C/G。
本发明还提供一种鉴定小麦千粒重的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1、提取待测小麦基因组DNA
步骤2、利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的序列对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤3、利用限制性内切酶RsaI对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
步骤4、当步骤2获得的扩增产物可被酶切时，其对应的小麦为低千粒重小麦，若步骤2获得的扩增产物不可被酶切时，其对应的小麦为高千粒重。
进一步，步骤2的PCR扩增体系配置：1μL 2.5mM dNTP，0.25uL 10μM引物，1μL 10×EasyTaq Buffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
进一步，步骤3中酶切体系为：5μL PCR产物，1μL 10×CutSmart Buffer，0.5URsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
进一步，所述小麦品种具体为京411或红芒春21。
本发明相比于现有技术具有以下优点：
本发明针对一个控制千粒重的新主效QTL Qtgw.ahau-4B.1,发现了一个SNP标记，同时根据SNP标记开发了一个CAPS标记4B-8621。相对SSR分子标记，该标记经电泳检测后条带清晰可辩，不同千粒重的小麦品种间带型差异明显，检测方法简便，有助于提高分子标记选择的目标性和针对性，从而提高小麦高产分子育种的效率。
附图说明
图1为酶切产物琼脂糖电泳图，其中；J为京411类型条带；H为红芒春21类型条带。M为2K Marker的条带；
图2为京411/红芒春21群体中千粒重主效位点Qtgw.ahau-4B.1的局部连锁图谱。
具体实施方式
实施例
为了验证本发明提出的SNP标记的有效性，本实施例进行了以下验证性实验：
(一)千粒重(Thousand grain weight,TGW)表型测定
随机取300粒小麦种子，用千粒重仪和万深SC-G型自动考种分析仪，于2007、2008、2010、2012、2016、2017和2018共7个年份，分别测量其TGW(g)，三次重复，并取平均值。数据整理由Excel软件完成，表型数据与标记间的相关性分析由SPSS软件完成。
RILs群体亲本京411和红芒春21在7个年份的TGW测定值(g)
表1
(二)小麦基因组DNA提取
用于DNA提取的试验材料为亲本京411/红芒春21重组自交系群体174个家系，180份中国小麦微核心种质资源。具体方法为：
1、将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mL SDS提取液(0.1M Tris-HCl(PH＝8.5)，0.1M NaCl，0.05M EDTA(PH＝8.0)，2％SDS)在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡。
2、在4℃ 12000rpm条件下，离心10min。
3、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层。
4、在4℃ 12000rpm条件下，离心10min。
5、取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转数次。
6、在4℃ 12000rpm条件下，离心10min。
7、取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min。
8、在4℃ 12000rpm条件下，离心10min。
9、用70％的乙醇洗涤两次。
10、在4℃ 12000rpm条件下，离心10min。
11、沉淀自然风干，4℃存，备用。
(三)简化基因组酶切方案设计和测序
1、酶切方案的选择：根据小麦的基因组大小以及GC含量等信息，最终选取小麦A基因组作为参考基因组进行酶切预测。通过酶切预测软件对参考基因组进行酶切预测，选择最合适的酶切方案。
2、具体实验流程：根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA用限制性内切酶RsaI(New England Biolabs,NEB)，进行酶切。对得到的酶切片段(SLAF标签)用Klenow Fragment(3′→5′exo–)(NEB)和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增(PCR扩增引物：F，AATGATACGGCGACCACCGA；R，CAAGCAGAAGACGGCATACG)、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。为评估酶切实验的准确性，选用日本晴(Oryza sativa japonica)作为对照进行测序。
3、利用Dual-index识别测序得到的原始数据，获取各个样品的reads。评估过滤完接头的测序reads的测序质量和数据量。通过Control数据的比对效率来评估酶的酶切效率，进而验证实验过程的准确性与有效性。采用reads比对基因组的方法，在亲本以及子代中开发大量的SLAF标签，并筛选出多态性的SLAF标签。对多态性的SLAF标签进行基因型编码后，按如下标准进行质控：
(1)过滤父母本测序深度10×以下reads；
(2)过滤SNP数大于5的标签；
(3)过滤完整度小于70％的标记；
(4)过滤严重偏分离(P<0.01)标记。
将通过质控的SLAF标签利用HighMap作图软件，构建高密度遗传图谱，图谱评估合格后，用于QTL分析。
(四)QTL分析
采用如下三种算法进行QTL分析：
1、QTLICIMapping v4.1软件中完备复合区间作图的加性效应算法(ICIM-ADD)，1000次随机排列检验计算LOD阈值，步移区间1cM。
2、QTLnetwork v2.0软件中的基于混合线性模型的复合区间作图法(MCIM)，设定显著性水平(P)为0.05，默认步长1cM。
3、QTL.gCIMapping.GUI v1.1软件中多位点混合模型算法(gCIM),LOD值设为3.0，步长1cM。
(五)小麦660K SNP芯片扫描
基于重组自交系群体174份家系的千粒重表型值构建高、低千粒重混池，并利用小麦660K芯片对高、低千粒重混池进行扫描。高、低千粒重混池分别包含1个高千粒重亲本和2个高千粒重极端混池(每个高千粒重混池选取5个极端高千粒重家系混合)以及1个低千粒重亲本和2个低千粒重极端混池(每个低千粒重混池选取5个极端低千粒重家系混合)。利用Excel将660K芯片中在池内一致、池间存在基因型差异的SNP进行筛选和提取，接着针对4B染色体主效QTL区段进行差异SNP的富集分析，挑选出位于Qtgw.ahau-4B.1(如图2)目标区段内的差异SNP，用于进一步开发CAPS标记。
(六)QTL区段内CAPS标记4B-8621开发
1、差异SNP酶切位点分析
对目标区段内所有SNP进行酶切位点分析，发现AX-110948621(4B染色体540326609bp处)这一SNP的C/G差异可以通过限制性核酸内切酶HincII(New EnglandBiolabs,NEB)区分。HincII的识别位点为：GTY^RAC。
2、引物设计
用AX-110948621侧翼序列在小麦参考基因组上(IWGSC RefSeq v1.0，网址https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/blast.php)BLAST并前后延伸300bp，，得到一段总长671bp的序列SEQ ID NO.1。
然后以SEQ ID NO.1为模板，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物：
4B-8621-F:5'AGAGTAGGTGAGGAGCAG 3'SEQ ID NO.2
4B-8621-R:5'CGGATAGCGTTAAGACA 3'SEQ ID NO.3
(七)目标产物的扩增、酶切和电泳
1、PCR扩增体系配置：1μL 2.5mM dNTP，0.25uL 10μM引物，1μL 10×EasyTaqBuffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL。
2、PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
3、扩增后酶切体系：5μL PCR产物，1μL 10×CutSmart Buffer，0.5U RsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
4、酶切反应程序：37℃ 6小时。
酶切后，在样品中加入3μL 6×DNA Loading Buffer，取5μL酶切后产物用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行分型。京411(高千粒重，C等位类型)条带不能被酶切，红芒春21(低千粒重，G等位类型)条带可以被切开(如图1所示)。
(八)CAPS标记4B-8621在重组自交系群体中的连锁分析
如表2所示，将CAPS标记4B-8621加密到SLAF-seq构建的高密度遗传图谱上，采用ICIM，GCIM和MCIM三种算法进行千粒重QTL分析，发现4B-8621是4B染色体千粒重主效位点的侧翼标记，与Qtgw.ahau-4B.1紧密连锁。在上述3种算法中，共检测到4B-8621与4个年份的TGW显著相关，平均表型贡献率为14.66％。
京411/红芒春21群体中检测到的千粒重主效位点Qtgw.ahau-4B.1信息
表2
注：Qtgw.ahau-4B.1区段包含四个标记，Marker12906959(542.85Mb)、4B-8885（541.91Mb）、4B-8621（540.33Mb）和4B-6505（541.45Mb）。其中ICIM算法中检测到的2007年份的TGW相关QTL和MCIM算法中检测到的2010年份的TGW相关QTL（侧翼标记为Marker12906959～4B-8885）均与CAPS标记4B-8621紧密连锁。（九）CAPS标记4B-8621在自然群体中的验证曼尼-惠特尼检验（U检验）结果表明，在180份小麦微核心种质组成的自然群体中，携带CAPS标记4B-8621的两种等位变异类型（4B-8621a和4B-8621b）的小麦品种间，其TGW表型值（2015TGW、2016TGW和2017TGW）之间的差异均达到极显著水平（P＜0.01）（表3）。
利用180份小麦微核心种质资源验证CAPS标记4B-8621与千粒重极显著相关
| 4B-8621a Mean±SD | 4B-8621b Mean±SD | U-test | |
| 2015TGW | 38.40±7.34 | 31.57±7.53 | 5.863** |
| 2016TGW | 38.39±7.17 | 31.37±8.17 | 6.039** |
| 2017TGW | 37.93±6.15 | 30.50±7.96 | 6.169** |
表3注：**表示标记与性状之间在0.01水平上极显著相关；4B-8621a为与京411一致的等位类型；4B-8621b为与红芒春21一致的等位类型。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种小麦千粒重相关CAPS标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 671
<212> DNA
<213> Triticum aestivum L
<400> 1
aaattgttct ggacatgtgt gcaatataag aggacgagaa acaataacta aaatgtatcg 60
aaagttgggt tggagtatga gcatacacaa tggaatgatt acttgcatcg ttttgttttt 120
agctctatac gttccatttt ttgtgaaatg aattcgttta tttataatgg catatagtga 180
ctggctattc tgcagcttgc ttgtccatgg ccttgttttg tttgttggtt gggttttgca 240
ggacttgggt gtaatgtcac ggggttgaaa tgctgtttgg aagagtaggt gaggagcagg 300
tagcactcaa tcttactatt tctaaatttt cagttcacat gtgaagggct agaatttcta 360
ttcaattggt tgaaataaac cggggcatcg aggtaatgtt attcggatgt gctttcaaga 420
aatacgttta gacctttgtg aaaacaataa tatgtcttaa cgctatccgg agaactagaa 480
taaaggtaat gttccaaagt tgactttcaa ttgtttctct aaaataggaa agctgacttt 540
caattaagaa aatcatcttg cttaaatgaa gttgtgagtg tgtattttcc tgcttactat 600
cagatcgatg gttctagttg ttttgttaag cccatggcag taccttgaaa atctcttttg 660
aaagagcctt t 671
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 2
agagtaggtg aggagcag 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 3
cggatagcgt taagaca 17
Claims (5)
1.一种与小麦千粒重相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于参考基因组IWGSCRefSeq v1.0版本的小麦4B染色体540326609bp处，且这一SNP标记的核苷酸为C/G。
2.一种鉴定小麦千粒重的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1、提取待测小麦基因组DNA
步骤2、设计跨权利要求1所述SNP标记的PCR引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3构成的引物对对步骤1获得的小麦基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
步骤3、利用限制性内切酶RsaI对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
步骤4、当步骤2获得的扩增产物可被酶切时，其对应的小麦为低千粒重小麦，若步骤2获得的扩增产物不可被酶切时，其对应的小麦为高千粒重。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2的PCR扩增体系配置：1μL 2.5mMdNTP，0.25uL 10μM引物，1μL 10×EasyTaq Buffer，0.5U EasyTaq，100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；62℃开始每循环降落0.3℃退火30s；72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸8min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3中酶切体系为：5μL PCR产物，1μL10×CutSmart Buffer，0.5U RsaI，用双蒸馏水补齐到10μL。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述小麦品种具体为京411或红芒春21。
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