CN104342484A - 一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用。本发明通过对小麦自然变异群体中6-SFT基因的遗传变异分析，发现有两个SNP，分别对应于序列表序列1自5’末端第1371和第2450位，这两个SNP存在三种单体型：单体型甲（G、G）、单体型乙（G、A）、单体型丙（A、G）。通过关联分析证明，这三种单体型的纯合类型中，千粒重大小为：单体型丙纯合的小麦>单体型甲纯合的小麦>单体型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述两个SNP的CAPS标记。实验证明，通过检测所述两个SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。

Description

一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用。
背景技术
我国是世界上小麦生产和消费的第一大国，小麦生产与国家粮食安全密切相关。干旱一直是影响小麦生产的最主要非生物胁迫因素。果聚糖不仅是一种重要的储藏性可溶性碳水化合物，籽粒灌浆的重要碳源，也是主要的渗透调节物质，植物体内果聚糖的积累可提高其抗旱、耐寒能力。因此，研究和利用小麦果聚糖合成酶（Sucrose:fructan6-fructosyltransferase，6-SFT）基因对于高产、抗旱的遗传改良具有重要意义。小麦6-SFT是果聚糖合成过程中的关键酶之一，有两种功能，一是直接以蔗糖为底物，催化蔗糖分子上的果糖基转移到另一个蔗糖分子果糖基的C6位上，合成6-蔗果三糖，二是以寡果聚糖为底物，生成分支型果聚糖。随着分子生物技术的快速发展，重要基因的功能不断被揭示，在作物遗传改良中高效利用这些基因已成为基因发掘的重要目标。分子标记辅助选择技术为提高目标性状选择效率，改良作物提供了一条新的有效途径。基于基因序列开发的功能分子标记直接标记基因本身，能够高效选择目标基因，因此受到相关研究者的高度关注。然而迄今为止，尚未开发出小麦6-SFT基因的分子标记，并分析标记与产量性状的关系。
CAPS技术又称为PCR-RFLP，是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物（19—27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。GAPS标记揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦千粒重相关的分子标记及其应用。
本发明提供一种利用小麦多态性位点鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，所述多态性位点为X和Y两个单核苷酸多态性位点，所述X和Y两个单核苷酸多态性位点分别对应于小麦基因组DNA中序列表序列1自5’末端第1371位和第2450位；
所述X和Y两个单核苷酸多态性位点依次为下述Ⅰ）、Ⅱ）和Ⅲ）的情况时相对应的基因型为A、B和C：
Ⅰ）G/G和G/G；
Ⅱ）G/G和A/A；
Ⅲ）A/A和G/G。
所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
所述获得基因型A、B和C的方法包括对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述2个单核苷酸多态性位点X和Y在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定的步骤。
所述PCR扩增的靶序列为序列表序列1自5’末端第1—2663bp。
所述PCR扩增使用的特异性引物对为序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA。
所述酶切鉴定包括如下步骤：将PCR产物分别用MboII和BsgI酶切，获得酶切产物M和酶切产物B；
若所述酶切产物M为762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为G/G，即G纯合；
若所述酶切产物M为1137bp、681bp、465bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为A/A，即A纯合；
若所述酶切产物B为1955bp、510bp和198bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述Y位点为G/G，即G纯合；
若所述酶切产物B为1955bp和708bp的DNA片段，则将所述待测小麦候选为在所述Y位点为A/A，即A纯合。
上述任一所述方法可用于鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状；
被确定为基因型为C的待测小麦，其千粒重高于被确定为基因型为A和B的待测小麦；被确定为基因型为A的待测小麦，其千粒重高于被确定为基因型为B的待测小麦。
本发明还保护扩增如下DNA片段的PCR引物对：小麦基因组DNA上的任意一段包括所述X和Y两个单核苷酸多态性位点在内的DNA片段。
所述PCR引物对为序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA。
本发明还提供一种鉴别或辅助鉴别小麦千粒重性状的试剂或试剂盒，包括序列表序列2所示的单链DNA、序列表序列3所示的单链DNA、和限制性内切酶MboII和BsgI。
本发明通过对小麦自然变异群体中6-SFT基因的遗传变异分析，发现有两个SNP，分别对应于序列表序列1自5’末端第1371位和第2450位，这两个SNP存在三种单体型：单体型甲（G、G）、单体型乙（G、A）、单体型丙（A、G）。通过关联分析证明，这三种单体型的纯合类型中，千粒重大小为：单体型丙纯合的小麦>单体型甲纯合的小麦>单体型乙纯合的小麦。本发明还提供了检测所述两个SNP的CAPS标记。实验证明，通过检测所述两个SNP，即可找到千粒重相对较高的小麦。本发明为小麦的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育高产小麦品种或研究中具有重要意义。
附图说明
图1为根据本发明两个SNP开发CAPS标记酶切产物电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准，左图从上至下的片段大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；右图从上至下的片段大小依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp。左图为用MboⅡ对不同小麦的PCR产物进行酶切的带型；右图为用BsgⅠ对不同小麦的PCR产物进行酶切的带型；左图中的泳道G含有六条从上至下大小依次为762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的条带，泳道A含有五条从上至下大小依次为1137bp、681bp、465bp、225bp和155bp的条带；右图中的泳道G含有三条从上至下大小依次为1955bp、510bp和198bp的条带，泳道A含有两条从上至下大小依次为1955bp和708bp的条带。
图2为DH群体（旱选10号×鲁麦14）中CAPS标记酶切产物电泳检测结果。其中，泳道M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；泳道H为旱选10号；泳道L为鲁麦14；泳道1-150分别为DH群体中的150个株系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库（http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm），材料信息见中国作物种质信息网，网址：http://icgr.caas.net.cn。
实施例1、与小麦千粒重相关的2个SNP及其PCR-RFLP多态性检测
1、扩增含小麦2个SNP的基因组DNA片段的特异引物及序列分析
在小麦基因组上的基因6-SFT（Genbank号为FJ228688）中发现2个SNP，分别对应于序列表序列1自5’末端的第1371位（命名为X位点，存在G和A的多态性），和序列表序列1自5’末端的第2450位（命名为Y位点，存在G和A的多态性）；这两个位点X和Y在小麦自然变异群体中存在三种单体型：
单体型甲：G、G；
单体型乙：G、A；
单体型丙：A、G；
根据小麦不同基因组的序列差异，设计特异性引物PCR扩增包含这2个SNP位点在内的DNA片段：
F：5'-CTCTCTAGACATAATCAAAAGGGA-3'（序列表序列2）；
R：5'-TTCTTTGATCCAATGTAGCTTCA-3'（序列表序列3）；
所述PCR扩增的靶序列如序列表的序列1所示（2663bp），该序列包括小麦6-SFT基因组DNA的部分第3外显子、第3内含子和部分第4外显子。酶切分析显示，这两个位点的多态性分别可被MboⅡ和BsgⅠ识别。
2、PCR-RFLP多态性检测及基因分型方法的建立
1）提取待测小麦的基因组DNA；
2）以步骤1）的基因组DNA为模板，用引物F和R进行PCR扩增，PCR扩增的体系（15μL）为：ddH2O8.0μL、5×PCR buffer3.0μL、引物F2（5μmol·L-1）和R2（5μmol·L-1）各0.6μL、dNTP（2.5μmol·L-1）0.4μL、transfastpfu酶（5U）0.3μL、模板DNA（20ng·μL-1）2.1μL；
PCR扩增条件为：95℃5min；95℃1min，55℃45s，72℃3min30s，35次循环；72℃10min，15℃保存。
3）将步骤2）得到的PCR产物分别用MboII和BsgI酶切，获得酶切产物M和酶切产物B，进行1％琼脂糖电泳检测，记录酶切产物中各片段大小，并根据如下方法判断并记录待测小麦的在所述X和Y位点的情况：
若所述酶切产物M为762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为G纯合（表示为G/G）的小麦（图1左图中的泳道G）；
若所述酶切产物M为1137bp、681bp、465bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为A纯合（表示为A/A）的小麦（图1左图中的泳道A）；
若所述酶切产物B为1955bp、510bp和198bp的DNA片段，则所述待测小麦为在所述Y位点为G纯合（表示为G/G）的小麦（图1右图中的泳道G）；
若所述酶切产物B为1955bp和708bp的DNA片段，则所述待测小麦为在所述Y位点为A纯合（表示为A/A）的小麦（图1右图中的泳道A）；
4）根据步骤3）的结果，将小麦分为在所述X和Y位点的情况为如下Ⅰ—Ⅲ种类型：
Ⅰ：G/G和G/G（即单体型甲纯合）；
Ⅱ：G/G和A/A（即单体型乙纯合）；
Ⅲ：A/A和G/G（即单体型丙纯合）；
所述“/”前为一条同源染色体上的情况，所述“/”后为另一条同源染色体上的情况。
3、利用两个CAPS标记对自然群体进行分型并与千粒重性状进行关联分析
以154份六倍体小麦组成的自然群体中各小麦分别作为待测小麦按照步骤2的方法进行分型，随机对部分小麦的扩增产物大小进行测序验证，结果如表1所示。
表1、小麦自然群体中X和Y位点的情况
序号 小麦品种名称 类型
1 04-030 Ⅰ
2 04-037 Ⅲ
3 04-044 Ⅰ
4 04-067 Ⅰ
5 04-111 Ⅰ
6 04-112 Ⅰ
7 04-135 Ⅲ
8 04-208 Ⅰ
9 安85中124-1 Ⅲ
10 安86中17 Ⅱ
11 北京10号 Ⅰ
12 北京14号 Ⅱ
13 北京837 ——
14 北京8686 Ⅲ
15 单R8043 Ⅲ
16 单R8093 Ⅱ
17 单R8108 Ⅲ
18 单R8194 Ⅲ
19 单R9062 Ⅰ
20 丰抗13 Ⅲ
21 丰优5号 Ⅲ
22 京411 Ⅲ
23 京春70-5321 Ⅱ
24 京东82东307 Ⅱ
25 京东83东65 Ⅲ
26 京核8922 Ⅰ
27 京农79-15 Ⅲ
28 京农80鉴107 Ⅲ
29 京农84-6786 Ⅲ
30 京农84-6789 Ⅲ
31 京品10号 Ⅰ
32 京品11 Ⅰ
33 京品30 Ⅰ
34 京品3号 Ⅲ
35 京双16 Ⅲ
36 京双2号 Ⅲ
37 京选20 Ⅰ
38 京选25 Ⅰ
39 京延85鉴28 Ⅲ
40 科遗26 ——
41 红良4号 Ⅱ
42 农大146 Ⅲ
43 农大183 Ⅰ
44 农大20074 Ⅰ
45 农大81146 Ⅲ
46 原冬834 Ⅱ
47 原冬8445 Ⅲ
48 原冬847 Ⅱ
49 原冬856 Ⅲ
50 运旱2028 Ⅲ
51 早穗21 Ⅰ
52 早穗65 Ⅰ
53 早穗66 Ⅰ
54 中7902 Ⅲ
55 中84Ⅰ-40551 Ⅲ
56 中8502 Ⅲ
57 小山8号 Ⅰ
58 中86Ⅰ-50455 Ⅲ
59 中大86-鉴2 ——
60 中大91-品9 Ⅲ
61 中大92-鉴49 Ⅲ
62 中大92-品8 Ⅱ
63 中优9507 Ⅲ
64 中作60064 Ⅲ
65 中作60115 Ⅰ
66 中作634 Ⅲ
67 白齐麦 Ⅱ
68 西峰20 Ⅲ
69 沧州小麦 Ⅰ
70 霸王鞭 Ⅲ
71 冀92-5203 Ⅱ
72 冀麦26 Ⅲ
73 冀麦30 Ⅱ
74 冀麦32 Ⅰ
75 冀麦41 Ⅲ
76 冀麦6号 Ⅲ
77 冀麦1号 Ⅰ
78 高优504 Ⅱ
79 邯4589 Ⅲ
80 衡麦2号 Ⅲ
81 石特14 Ⅲ
82 四棱红葫芦头 Ⅰ
83 百农3217 Ⅱ
84 白糙麦 Ⅱ
85 温麦6号 Ⅲ
86 偃展一号 Ⅱ
87 豫麦13号 Ⅱ
88 豫麦18 Ⅱ
89 豫麦2号 Ⅲ
90 豫麦8号 Ⅱ
91 洛旱2号 Ⅱ
92 洛阳8628 Ⅱ
93 洛阳9048 Ⅲ
94 紫秆白芒先 Ⅱ
95 昌乐5号 Ⅰ
96 济南13 Ⅱ
97 鲁麦14 Ⅲ
98 鲁麦15 Ⅰ
99 鲁麦19 Ⅲ
100 烟881414 Ⅲ
101 蚂蚱麦 Ⅲ
102 红和尚 Ⅰ
103 临旱6105 Ⅲ
104 临旱917 Ⅰ
105 临旱935 Ⅲ
106 临抗5108 Ⅱ
107 平阳348 Ⅲ
108 长治6878 Ⅰ
109 小偃54 Ⅱ
110 旱选11 Ⅰ
111 旱选12 Ⅰ
112 旱选3号 Ⅰ
113 晋2148-7 Ⅰ
114 晋麦17 Ⅱ
115 晋麦33 Ⅱ
116 晋麦39 Ⅰ
117 晋麦44 Ⅲ
118 晋麦47 Ⅲ
119 晋麦50 Ⅲ
120 晋麦54 Ⅲ
121 晋麦57 Ⅲ
122 旱选10号 Ⅰ
123 晋麦68 Ⅲ
124 晋麦72 Ⅲ
125 金光 Ⅱ
126 长武131 Ⅲ
127 长武89(1)3-4 Ⅲ
128 大荔1号 Ⅲ
129 陕225-9 Ⅱ
130 陕229 Ⅲ
131 陕旱8675 Ⅲ
132 陕合6号 Ⅰ
133 陕农7859 Ⅱ
134 陕优225 Ⅱ
135 陕资1869 Ⅲ
136 渭麦4号 Ⅰ
137 小齐麦 Ⅱ
138 PANDAS Ⅰ
139 SALGEMMA Ⅲ
140 春029th-3 Ⅱ
141 春039th-4 Ⅱ
142 春049th-5-1 Ⅱ
143 春079th-7 Ⅲ
144 春179th-18 Ⅱ
145 春219th-24 Ⅲ
146 春229th-25 Ⅲ
147 春239th-26 Ⅲ
148 春259th-28 Ⅲ
149 春349th-38 Ⅲ
150 春359th-39 Ⅲ
151 春379th-41 Ⅲ
152 春409th-44 Ⅲ
153 春429th-46 Ⅱ
154 春459th-50-1 Ⅱ
注：表中的“——”表示无PCR产物。
2008和2009年，在中国农业科学院作物科学研究所实验农场（北京昌平）大田种植上述自然群体的小麦，正常水肥管理，调查各小麦品种的千粒重，用Tassel2.1软件对千粒重和X和Y位点的情况进行关联分析，为了防止伪关联，将K=4的群体结构信息（张嘉楠等用83对SSR标记通过Structure2.1（Prichard et al，2000）对表1所示的154份小麦材料的群体结构进行了分析，发现K=4时有明显的拐点，因此将表1的154份材料分为4组）代入Tassel2.1进行关联分析，选择P<0.05为显著性水平，结果如表2所示。
表2小麦自然群体中X和Y位点的情况与千粒重的关联分析结果
a千粒重用平均值±标准差来表示；*表示P<0.05。
表2的关联分析结果表明，表1所示的154份六倍体小麦组成的自然群体形成的三种类型的千粒重差异均达到显著水平（P<0.05）。其中，类型Ⅲ的小麦千粒重最高，Ⅰ次之，Ⅱ的千粒重最小。两年中类型Ⅲ的小麦材料的千粒重分别较Ⅱ的小麦高2.58g和3.13g。对自然群体的研究表明，类型Ⅲ是提高小麦千粒重的优异基因型。
4、利用两个SNP对DH群体进行分型及千粒重检测和关联分析
DH（加倍单倍体）群体：对旱选10号（表1中的序号为122，类型为I）和鲁麦14（表1中的序号为97，类型为Ⅲ）为亲本获得的杂交1代进行花药培养（方法按照文献：景蕊莲等.用花药培养创建小麦加倍单倍体作图群体.生物技术.1999，9(3):4-9），得到由150个株系组成的DH群体；
以上述DH群体中各株系分别作为待测小麦，按照步骤2的方法进行分型，结果如图2所示；在2001、2005、2006、2009—2011六年北京地区大田种植上述DH群体和亲本，正常水肥管理，调查各小麦的千粒重；根据分型结果及其千粒重结果进行t检验，结果表明，DH群体中的两种情况，显著影响小麦千粒重，说明类型Ⅲ是提高千粒重的优异基因型（表3）。
表3小麦DH群体中X和Y位点的情况与千粒重的关联分析
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

Claims (10)

1.一种利用小麦多态性位点鉴定或辅助鉴定小麦基因型的方法，所述多态性位点为X和Y两个单核苷酸多态性位点，所述X和Y两个单核苷酸多态性位点分别对应于小麦基因组DNA中序列表序列1自5’末端第1371位和第2450位；
所述X和Y两个单核苷酸多态性位点依次为下述Ⅰ）、Ⅱ）和Ⅲ）的情况时相对应的基因型为A、B和C：
Ⅰ）G/G和G/G；
Ⅱ）G/G和A/A；
Ⅲ）A/A和G/G。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得基因型A、B和C的方法包括对待测小麦的基因组DNA中任意一段包括所述2个单核苷酸多态性位点X和Y在内的DNA片段进行PCR扩增，并将该PCR扩增产物进行酶切鉴定的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的靶序列为序列表序列1自5’末端第1—2663bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增使用的特异性引物对为序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述酶切鉴定包括如下步骤：将PCR产物分别用MboII和BsgI酶切，获得酶切产物M和酶切产物B；
若所述酶切产物M为762bp、681bp、465bp、375bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为G/G；
若所述酶切产物M为1137bp、681bp、465bp、225bp和155bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述X位点为A/A；
若所述酶切产物B为1955bp、510bp和198bp的DNA片段，则所述待测小麦在所述Y位点为G/G；
若所述酶切产物B为1955bp和708bp的DNA片段，则将所述待测小麦候选为在所述Y位点为A/A。
6.权利要求1—5中任一所述方法在鉴定或辅助鉴定小麦千粒重性状中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
被确定为基因型为C的待测小麦，其千粒重高于被确定为基因型为A和B的待测小麦；被确定为基因型为A的待测小麦，其千粒重高于被确定为基因型为B的待测小麦。
8.扩增如下DNA片段的PCR引物对：小麦基因组DNA上的任意一段包括所述X和Y两个单核苷酸多态性位点在内的DNA片段。
9.根据权利要求8所述的PCR引物对，其特征在于：所述PCR引物对为序列表序列2所示的单链DNA和序列表序列3所示的单链DNA。
10.一种鉴别或辅助鉴别小麦千粒重性状的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括序列表序列2所示的单链DNA、序列表序列3所示的单链DNA、和限制性内切酶MboII和BsgI。
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