CN111592584B - Her2亲和体和诊疗核素标记物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于临床核医学技术领域，涉及一种HER2亲和体和诊疗核素标记物及其制备方法与应用。该HER2亲和体的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明设计合成的HER2亲和体序列具有良好的体内稳定性、药代动力学性质，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的分子探针对HER2分子均具有良好的亲和力和功能活性，有望成为具有良好应用前景的靶向HER2显像用及肿瘤治疗用放射性药物。

Description

HER2亲和体和诊疗核素标记物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于有机化学、放射性核素标记的放射性化学和临床核医学技术领域，更具体地，涉及HER2亲和体(HER2 affibody)分子结构，修饰的HER2 affibody，诊疗核素标记物及其制备方法与应用。
背景技术
随着核医学与分子生物学的深入发展与融合，医学影像技术迈向分子影像学时代，其中正电子发射计算机断层显像(Positron Emission Tomography，PET)进行功能学显像使得人们真正从分子水平开始认识并诊断疾病，尤其在肿瘤的诊疗方面突显出其优势。通过示踪病变组织的受体变化、细胞信号转导的异常，从而克服现代诊断技术中的缺陷，为肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估提供依据，并对预后进行评价，同时也可应用于肿瘤的靶向治疗。肿瘤放射免疫显像是将针对肿瘤相关抗原的特异性抗体或其片段用放射性核素标记后注入人体，随血液流达肿瘤组织，与肿瘤的相关抗原结合，从而使肿瘤组织局部放射性浓聚超过正常组织，然后用核医学显像设备定性、定位显示原发灶和全身转移灶，特别是能够发现其它诊断技术难于明确的隐匿病灶。α或β放射性核素在衰变过程中，可以释放出α射线或β射线等，具有较强的电离辐射效应，对于肿瘤细胞或异常增殖组织等具有较强的杀灭作用。核素治疗就是指利用具有治疗作用的放射性核素，如131I，90Y，177Lu，225Ac，213Bi等核素或标记药物，近距离精准杀伤病变细胞和组织，达到治疗的目的。
人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，为表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)家族成员之一，在多种肿瘤组织中均有不同程度的表达。HER2扩增或过表达与肿瘤高侵袭性、易复发、死亡率增加密切相关。研究显示，在乳腺癌(20％～30％)、胃癌(7％～34％)、卵巢癌、肺癌和***癌中均存在不同程度的HER2过表达，国内胃癌患者的HER2阳性率为12％～13％。HER2过表达往往预示患者预后差。HER2过表达的患者能够从HER2靶向治疗中获益。多种靶向HER2的药物相继问世，最具代表性的靶向HER2治疗药物曲妥珠单抗(赫赛汀，Herceptin)与HER2的胞外结构域结合后，选择性地阻断HER2相关信号通路。曲妥珠单抗联合化学治疗对HER2过表达的晚期胃癌较单纯化疗明显延长总生存期。
已有多项研究表明靶向HER2的PET/CT分子成像可用于乳癌、胃癌的病灶显像，可显示肿瘤HER2表达的异质性，并可用于原发灶HER2表达阴性患者阳性灶的筛选，并能较准确的预测靶向治疗的疗效。64Cu或89Zr标记完整抗体(Trastuzumab，Pertuzumab)的临床研究相继出现，在HER2阳性患者筛选、HER2靶向疗效预测、HER2异质性监测等方面显示出重要的价值。但是完整抗体的血液药代动力学较慢，需要半衰期相对长的核素标记，血池及肝脏背景高，为了获得较好的图像对比度，需要较长时间点的显像，其中，64Cu-trastuzumab最佳显像时间为1-2天，89Zr-trastuzumab最佳显像时间为标记4-6天。
亲和体(Affibody)是一种衍生于葡萄球菌A蛋白Z结构域的人工蛋白质分子，为单链结构，由58个氨基酸组成，相对分子质量约为6.5kDa，最早应用于分子影像学中的是HER2特异性的亲和体。第一代HER2靶向的亲和体主要为ZHER2：4，第二代亲和体ZHER2：342是通过对成熟的亲和体系列进行定点变异而筛选得到的，亲和力较ZHER2：4有显著提高(22pMVS 50nM)。近年来，放射性核素标记的ZHER2：342及其类似物(ZHER2：2891、ZHER2：2395等)在肿瘤分子影像中的应用开始受到人们的广泛关注。Affibody由于其分子量小，生物分布快，可短时间内显像(1-4h)，辐射低于长半衰期分子探针，核素标记亲和体在靶向HER2显像中显示出独特的优势。
Affibody经过双功能偶联剂NOTA、HBED-CC等修饰之后，可以进行诊断性放射性核素68Ga、18F标记，68Ga是应用较为广泛的正电子放射性核素，核素68Ga由68Ge-68Ga发生器制备，来源方便，68Ga与化合物易于配位，标记操作方法较简单；与回旋加速器相比，淋洗标记的68Ga放射性量相对较小，便于随时进行质量控制；且68Ga半衰期较短，能够无创实时对疾病进行诊断，获得全身代谢图像。作为一种理想的PET放射性核素，与68Ga(T1/2＝68min)相比，18F具有较长的半衰期(T1/2＝109min)。且18F通过加速器制备，更适合多个患者的批量制备，同时也更适合开发自动化合成的制备方法。
90Y和177Lu是β放射性核素，90Y的能量较高(2,280keV)，穿透能力较强(12mm)，对于肿瘤细胞或异常增殖组织等具有较强的杀灭作用。与90Y相比，177Lu能发射出小离子范围的β-射线(0.5MeV)，这样不仅能够保证射线能量传输到肿瘤区域，还能减少对周边正常组织的伤害。225Ac和213Bi是α放射性核素，与β放射性核素相比，225Ac(6000-8000keV)和213Bi(>6000keV)的电离作用更强，穿透能力较弱(225Ac最大范围：0.06-0.09mm；213Bi最大范围：84μm)所以α放射性核素比β放射性核素的细胞毒性作用更强。
因此，HER2亲和体诊断用放射性分子探针用于提高HER2状态诊断效能，为HER2阳性乳腺癌、胃癌患者的筛选、HER2表达情况的监测、靶向治疗效果的预测和评价提供无创有效的分子影像学手段；HER2 Affibody治疗用放射性分子探针为HER2阳性乳腺癌、胃癌患者靶向治疗耐药后提供新的治疗手段；同时为HER2阳性乳腺癌、胃癌患者的治疗提供新思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种HER2亲和体分子结构，该HER2亲和体分子结构的修饰物，以及进一步得到的诊疗核素标记物及制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种HER2亲和体，该HER2亲和体的序列为(N端-C端)：
(AEEA)-VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[(Acp)-(Acp)]，其中，Acp为6-氨基己酸，连接在K的C端；中间连续的氨基酸序列(V到K)如SEQ ID NO：1所示；
所述HER2亲和体的结构如式I所示：
Figure BDA0002510258760000041
式I。
本发明中的HER2亲和体的结构是基于第二代亲和体ZHER2：342结构设计的，在ZHER2：342结构的C端增加两个Acp氨基酸结构，在N端增加一个AEEA linker结构，从而提高Affibody分子在人体内的稳定性，还可以避免合成的放射性分子探针出现放射性自分解。
本发明的HER2亲和体可通过本领域各种多肽合成/修饰方法制得，如，先合成氨基酸序列，再与Fmoc-AEEA(CAS No.:166108-71-0)反应，将反应所得产物脱Fmoc后即得，也可以整体商购获得。
本发明的第二方面提供一种修饰的HER2亲和体，该修饰的HER2亲和体为双功能偶联剂修饰的本发明第一方面所述的HER2亲和体，所述双功能偶联剂为NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、HBED-CC(N,N"-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N"-二乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)或3pC-NETA-NCS({4-[2-(双-羧甲基氨基)-5-(4-硝基苯基)戊基]-7-羰基-二甲基-[1,4,7]三氮杂喃-1-基}乙酸-N-氯代丁二酰亚胺)。
根据本发明，优选地，所述双功能偶联剂修饰在所述HER2亲和体的N端。
为进一步解决亲和体空间结构以及体内稳定性和脂溶性等问题，优选地，在所述HER2亲和体的C端修饰有马来酰亚胺(Mal)结构。
双功能偶联剂对HER2亲和体进行修饰的方法可采用本领域常规的各种方法，这些方法为本领域技术人员所熟知，本发明对此没有特别限定。例如，在pH 8.5-9.0 NaHCO3缓冲液体系中，将HER2 affibody与NOTA按照5～10：1的摩尔比混合，常温反应30min-2h。
本发明的第三方面提供一种诊疗核素标记物，该诊疗核素标记物为放射性核素标记的本发明第二方面所述的修饰的HER2亲和体。
根据本发明一种实施方式，所述放射性核素可以为诊断用放射性核素，所述诊断用放射性核素优选为68Ga和/或18F。
当所述放射性核素为68Ga时，放射性核素标记的HER2亲和体的制备方法可包括以下步骤：
1)采用68Ge-68Ga发生器制备68Ga；
2)采用0.04-0.06M HCl溶液淋洗68Ga至0.8-1.2M NaAc溶液中；
3)将所述修饰的HER2亲和体加入步骤2)所得含68Ga的NaAc溶液体系中，混匀，在90-100℃反应5-20min；
4)用生理盐水洗脱步骤3)反应体系中的放射性杂质，然后用乙醇洗脱，得到产物68Ga标记的HER2亲和体。
具体地，以进行双功能螯合剂NOTA修饰为例，68Ga对修饰后的HER2affibody的标记可采用以下方法：
HER2 affibody序列进行双功能偶联剂NOTA修饰后，得到序列(NOTA)-(AEEA)-VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[(Acp)-(Acp)-(3-Mal)](NOTA-HER2 Affibody)；对制备得到的NOTA-HER2 Affibody进行68Ga(T1/2＝68min；β+:89％；E＝511keV)核素的标记，68Ga用68Ge-68Ga发生器进行制备。取1mL 0.05M HCl溶液淋洗68Ga至65μL 1M NaAc中；将0.1mL(100μg)的HER2 affibody前体加入上述体系，混匀，95℃反应10min，用3mL生理盐水洗脱放射性杂质，再用0.8mL 80％乙醇洗脱出目标化合物68Ga-HER2 Affibody，用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。得到的68Ga-HER2 Affibody放射性化学纯度大于99％。标记率小于90％时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，其中Sep-pak柱需用5mL无水乙醇和5mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后期研究。
当所述放射性核素为18F时，放射性核素标记的HER2亲和体的制备方法可包括以下步骤：
1)采用回旋加速器制备18F；
2)将回旋加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.45-0.55mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F-；
3)取步骤2)得到的0.09-0.11mL含18F-的生理盐水与KHP和AlCl3溶液混合，震荡摇匀后室温放置4-6min，再加入所述修饰的HER2 affibody，在100-120℃反应10-20min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，用生理盐水洗涤，然后用乙醇洗脱，得到产物18F-标记的HER2亲和体。
具体地，以进行双功能螯合剂NOTA修饰为例，18F对修饰的HER2affibody标记可采用以下方法：
HER2 affibody序列进行双功能偶联剂NOTA修饰后，得到序列(NOTA)-(AEEA)-VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[(Acp)-(Acp)-(3-Mal)]；对制备得到的NOTA-HER2 Affibody进行18F(T1/2＝109.8min；β+:96.7％；E＝511keV)核素的标记，18F利用回旋加速器制备。将加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.5mL生理盐水冲洗上述QMA柱，将18F-洗脱到反应管中；取0.1mL含18F-的生理盐水于反应管中，再加入11μL 10倍KHP和6μL 2mM AlCl3溶液，震荡摇匀后室温放置5min；再加入14μL 10mg/mL标记前体NOTA-HER2 affibody，110℃反应15min；反应液冷却至室温后，将产物加载到C18分离柱上，用4mL生理盐水洗涤后，用0.7mL 80％乙醇将产物淋洗出并通过0.22μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用生理盐水配制得产品制剂；用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。所述18F-HER2 Affibody经分离纯化后放射化学纯度大于99％。标记率小于90％时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，其中Sep-pak柱需用5mL无水乙醇和5mL高纯水活化以备用。取适量经无菌过滤的产品制剂进行质量控制检验，所有项目均合格后进行后期研究。
根据本发明，所述放射性核素也可以为治疗用放射性核素，以期达到HER2高表达肿瘤靶向分子影像治疗的目的。所述治疗用放射性核素优选为90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的至少一种。
对HER2亲和体序列用双功能偶联剂DOTA、双功能偶联剂DTPA、双峰双功能配体3pC-NETA-NCS修饰之后，进行治疗用放射性核素90Y，177Lu，225Ac或者213Bi标记，得到90Y-HER2 Affibody、177Lu-HER2 Affibody、225Ac-HER2 Affibody、213Bi-HER2 Affibody治疗用分子探针。
治疗用放射性核素的标记可以采用本领域常规的各种方法，根据本发明一种优选实施方式，所述90Y，177Lu，225Ac或者213Bi标记HER2 affibody方法可采用如下方法：以177Lu为例，HER2 affibody进行双功能螯合剂DOTA、DTPA、3pC-NETA-NCS修饰后，得到相应的标记前体。按照1mL 0.05M HCl对应65μL 1M NaAc来配制标记缓冲液，待用；100μL(100μg)标记前体(DOTA-HER2 Affibody，DTPA-HER2 Affibody或者3pC-NETA-HER2 Affibody)中，加入100-150μL标记缓冲液，然后加入177Lu；将pH调至5.5，70-95℃，反应10-15min，标记率小于90％时，用Sep-pak C18 Column分离纯化，得到177Lu-HER2 Affibody。用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。制得的177Lu-HER2 Affibody经分离纯化后放射化学纯度大于99％。
采用诊断性放射性核素68Ga、18F标记本发明修饰后的HER2亲和体，得到68Ga/18F-HER2 Affibody分子探针，该探针体内稳定性良好，安全无毒，可以特异性与HER2分子结合，准确定位HER2高表达的肿瘤组织，表现出良好的靶向性和特异性。由此说明，本发明的HER2亲和体也具有良好的体内稳定性，药代动力学性质，靶向性和特异性。
本发明的第四方面提供上述诊疗核素标记物(诊断用放射性核素标记的HER2亲和体)在制备HER2靶向性的肿瘤PET显像试剂中的应用。
本发明的第五方面提供上述诊疗核素标记物(治疗用放射性核素标记的HER2亲和体)在制备HER2靶向性的肿瘤核素治疗药物中的应用。
本发明提供一种靶向HER2的亲和体结构，并进行了诊断性和治疗性放射性核素的标记与评价。本发明设计合成的HER2 affibody分子结构以及放射性核素标记的HER2affibody分子探针具有下列优点及有益效果：
(1)HER2 affibody结构具有较好的体内稳定性，药代动力学性质，亲和力和特异性。
(2)诊断用放射性分子探针可用于68Ga/18F-HER2 Affibody的PET显像；68Ga/18F-HER2 Affibody可用于HER2阳性乳腺癌、胃癌等肿瘤患者的筛选，治疗预判和疗效监测。
(3)68Ga/18F-HER2 Affibody PET显像可以判断患者对于HER2靶向治疗的疗效响应，判断患者是否适合用治疗性核素90Y/177Lu/225Ac/213Bi替代68Ga/18F进行核素靶向治疗。
(4)90Y/177Lu/225Ac/213Bi-HER2 Affibody等核素靶向治疗，可以为耐药的HER2阳性乳腺癌、胃癌患者提供新的治疗手段。
(5)本发明的68Ga/18F-HER2 Affibody的制备方法标记率高，68Ga标记率可达80％以上，18F标记率可达30％以上。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明HER2 affibody序列的HPLC表征图。
图2a-2b分别为本发明HER2 affibody序列经NOTA修饰之后的结构图和HPLC表征图。
图3为本发明一种实施方式中18F-HER2 affibody体外稳定性分析。
图4为本发明一种实施方式中18F-HER2 affibody在正常KM小鼠体内药代动力学分析。
图5为本发明一种实施方式中18F-HER2 affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中1h内micro-PET/CT分布图像。
图6为本发明一种实施方式中18F-HER2 affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中micro-PET/CT图像以及阻断组micro-PET/CT图像。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
本实施例用于说明本发明的HER2亲和体序列合成与表征。
该HER2亲和体的序列为：
(AEEA)-VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[(Acp)-(Acp)]，结构如式I所示。该HER2亲和体通过商购获得，经验证氨基酸序列正确。
Figure BDA0002510258760000101
对所述HER2亲和体序列的分子结构进行HPLC表征；HPLC分析条件：Kromasil 100-5C18凝胶过滤/体积排阻色谱柱，流速1mL/min；流动相A为含0.1％三氟乙酸TFA的乙腈；流动相B为含0.1％三氟乙酸TFA的水。流动相梯度设置：0.0min 25％的A和75％的B；20min90％的A和10％的B；20.1min 100％的A和0％的B。HPLC结果如图1所示。
实施例2
本实施例用于说明本发明的修饰的HER2亲和体的制备与表征。
对HER2 affibody序列进行NOTA修饰，在pH 8.8NaHCO3缓冲液体系中，将HER2Affibody与NOTA(10mg/mL)按照8：1的摩尔比混合，常温反应1h，得到修饰后的HER2affibody，结构如图2a所示。对修饰后的分子结构进行HPLC表征；HPLC分析条件如实施例1，HPLC结果如图2b所示。
实施例3
本实施例用于说明18F标记HER2亲和体的制备。
将加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.5mL生理盐水冲洗上述QMA柱，将18F-洗脱到反应管中；取0.1mL含18F-的生理盐水于反应管中，再加入11μL 10倍KHP和6μL 2mM AlCl3溶液，震荡摇匀后室温放置5min；再加入14μL10mg/mL标记前体NOTA-HER2 Affibody，110℃反应15min；反应液冷却至室温后，将产物加载到C18分离柱上，用4mL生理盐水洗涤后，用0.7mL 80％乙醇将产物淋洗出并通过0.22μm无菌滤膜；N2吹干溶剂后用生理盐水配制得产品制剂；用radio-HPLC或者radio-TLC测定标记率及放射化学纯度。
经测定，18F-HER2 Affibody的标记率为30％，放射化学纯度大于99％。
实施例4
本实施例用于说明纯化后的18F-HER2 Affibody的体外稳定性分析。
取10μL含1.11MBq(30μCi)的纯化后产物18F-HER2 Affibody加入到200μL生理盐水(或者5％HSA溶液)中，4℃条件下孵育；分别在孵育0h、2h、12h、24h、36h和60h时取出37-74kBq(1-2μCi)样品进行radio-TLC分析；分析方法：分别取2μL含37-74kBq(1-2μCi)放射性活度的18F-HER2 Affibody生理盐水溶液或者18F-HER2 Affibody 5％HSA溶液加至20μL饱和EDTA中混匀，进行radio-TLC分析。取2μL样品滴在距新华一号滤纸底端1cm处，置于生理盐水展开体系中，待完全展开后，取出滤纸并晾干，进行radio-TLC检测，游离18F和18F-HER2affibody的Rf值分别为0.9-1，0-0.1；结果显示18F-HER2 affibody生理盐水溶液或者5％HSA溶液中，4h内均具有良好的稳定性。具体结果见图3。
上述实验说明，HER2亲和体结构具有良好的稳定性。
实施例5
本实施例用于说明纯化后的18F-HER2 Affibody在正常KM小鼠体内药代动力学分析。
准备5只KM小鼠(雌性，5-6周龄，18-20g)，将纯化后的18F-HER2 Affibody用生理盐水稀释成18.5MBq/mL(0.5mCi/ml)，每只小鼠经尾静脉注射3.7MBq(0.1mCi，200μL)标记产物；分别在注射标记产物之后相应的时间点(1min、3min、5min、10min、15min、30min、45min和1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、36h)，使用毛细管经小鼠眼周静脉丛取血，并置于放免管中；取每只尾静脉注射的18F-HER2 Affibody放射性活度的1％即0.037MBq(1μCi，2μL)作为测定参考活度。使用Gamma counter将参考活度同收集的血液样品一起测定，经衰减校正后使用Prism6.0软件进行数据分析，计算每克血样百分注射剂量率，结果用％ID/g±SD表示。具体结果见图4，由图4可以看出，18F-HER2 Affibody具有良好的药代动力学特性。
实施例6
本实施例用于说明18F-HER2 Affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中1h内micro-PET/CT分布。
准备5只HER2阳性N87胃癌动物模型(雌性，5-6周龄，18-20g，肿瘤直径达到0.8-1.0cm)。以3L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将动物模型以俯卧位固定于Micro-PET扫描床的中心，尾静脉注射7.4MBq(0.2mCi，200μL)18F-HER2 Affibody之后，立即采用动态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700keV，扫描时间为1h，扫描过程中以1L/min的异氟烷气体维持麻醉小鼠，采用有序子集最大期望值(ordered subsets expectation maximization，OSEM)软件进行图像重建，并在进行衰减校正后采用MMWKS软件进行图像分析处理。具体结果如图5所示，18F-HER2 Affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中1h内micro-PET/CT分布图像结果显示18F-HER2 Affibody在动物体内具有较好的体内稳定性和药代动力学性质，该分子探针主要通过肾脏代谢，全身组织非特异性摄取较低；随着全身代谢，在20-30min肿瘤组织中出现特异性的放射性累积，且肿瘤组织的放射性摄取逐渐增强。
实施例7
本实施例用于说明18F-HER2 Affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中1h内micro-PET/CT分布。
准备10只HER2阳性N87胃癌动物模型(雌性，5-6周龄，18-20g，肿瘤直径达到0.8-1cm)，随机分为实验组和阻断组，每组各5只。实验组每只经尾静脉注射7.4MBq(0.2mCi，200μL)18F-HER2 Affibody；阻断组共注射0.5mg affibody+7.4MBq(0.2mCi，200μL)18F-HER2Affibody；每组每只动物模型在注射后1h和2h进行micro-PET成像；分别在相应时间进行micro-PET成像前，以3L/min的异氟烷气体麻醉小鼠，将PDX模型以俯卧位固定于micro-PET扫描床的中心，采用静态扫描模式扫描小鼠，能量窗350-700keV，扫描时间为15min，随着探针的代谢和衰变，延长扫描时间，扫描过程中以1L/min的异氟烷气体维持麻醉小鼠，采用有序子集最大期望值(ordered subsets expectation maximization，OSEM)软件进行图像重建，并在进行衰减校正后采用MMWKS软件进行图像分析处理。具体结果如图6所示。18F-HER2Affibody在HER2阳性N-87胃癌模型中micro-PET/CT图像结果显示，18F-HER2 Affibody在1h和2h在肿瘤位置均有较高放射性摄取；经冷affibody阻断之后肿瘤部分放射性摄取明显降低。说明18F-HER2 Affibody对HER2阳性肿瘤具有高度特异性靶向性。
以上实验证明，本发明设计合成的HER2亲和体序列具有良好的体内稳定性、药代动力学性质，其与诊断性或者治疗性放射性核素标记合成的分子探针对HER2分子均具有良好的亲和力和功能活性，有望成为具有良好应用前景的靶向HER2显像用及肿瘤治疗用放射性药物。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 北京市肿瘤防治研究所
<120> HER2亲和体和诊疗核素标记物及其制备方法与应用
<130> BJI2000735BJZL
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg
20 25 30
Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55

Claims (10)

1.一种修饰的HER2亲和体，该修饰的HER2亲和体为双功能偶联剂修饰的HER2亲和体，所述双功能偶联剂为NOTA；所述双功能偶联剂修饰在所述HER2亲和体的N端；在所述HER2亲和体的C端修饰有马来酰亚胺(Mal)结构；
所述HER2亲和体的序列为：
(AEEA)-VDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK[(Acp)-(Acp)]，其中，Acp为6-氨基己酸；
所述HER2亲和体的结构如式I所示：
Figure FDA0002974576950000011
2.一种诊疗核素标记物，该诊疗核素标记物为放射性核素标记的权利要求1所述的修饰的HER2亲和体。
3.根据权利要求2所述的诊疗核素标记物，其中，所述放射性核素为诊断用放射性核素。
4.根据权利要求3所述的诊疗核素标记物，其中，所述诊断用放射性核素为68Ga和/或18F。
5.根据权利要求2所述的诊疗核素标记物，其中，所述放射性核素为治疗用放射性核素。
6.根据权利要求5所述的诊疗核素标记物，其中，所述治疗用放射性核素为90Y、177Lu、225Ac和213Bi中的至少一种。
7.权利要求3或4所述的诊疗核素标记物在制备HER2靶向性的肿瘤PET显像试剂中的应用。
8.权利要求5或6所述的诊疗核素标记物在制备HER2靶向性的肿瘤核素治疗药物中的应用。
9.权利要求3或4所述的诊疗核素标记物的制备方法，所述放射性核素为68Ga，包括以下步骤：
1)采用68Ge-68Ga发生器制备68Ga；
2)采用0.04-0.06M HCl溶液淋洗68Ga至0.8-1.2M NaAc溶液中；
3)将所述修饰的HER2亲和体加入步骤2)所得含68Ga的NaAc溶液中，混匀，在90-100℃反应5-20min；
4)用生理盐水洗脱步骤3)反应体系中的放射性杂质，然后用乙醇洗脱，得到产物68Ga标记的HER2亲和体。
10.权利要求3或4所述的诊疗核素标记物的制备方法，所述放射性核素为18F，包括以下步骤：
1)采用回旋加速器制备18F-；
2)将回旋加速器生产的含有18F-的H2 18O通过QMA离子交换柱，将18F-吸附在QMA柱上；用0.45-0.55mL生理盐水冲洗上述QMA柱，洗脱18F-；
3)取步骤2)得到的0.09-0.11mL含18F-的生理盐水与KHP和AlCl3溶液混合，震荡摇匀后室温放置4-6min，再加入所述修饰的HER2亲和体，在100-120℃反应10-20min，反应液冷却后，将产物加载到C18分离柱上，用生理盐水洗涤，然后用乙醇洗脱，得到产物18F-标记的HER2亲和体。
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