CN111588913A - 一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用 - Google Patents

一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用，该注射剂的结构如式Ⅰ所示，
Figure DDA0002493652120000011
本发明将巯基改性的天然材料或合成聚合物与含有双键的化合物改性的天然材料或合成聚合物在无其他交联剂的参与下，混合蛋白质类天然高分子材料或其衍生物，负载细胞、药物、蛋白类活性因子等生物活性物质等，在迈克尔加成反应作用下制备得到负载生物活性物质的可注射双交联复合水凝胶注射剂。本发明中的改性方法简单易行且得到的改性物具有良好的生物相容性。这种注射型双交联复合水凝胶具有良好的反应速率可控性，力学性能和生物相容性，为其在注射型水凝胶的应用中奠定了良好的基础，同时也体现出了在骨/软骨缺损填充方面的应用前景。

Description

一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及 其应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体为一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用，该注射剂可用于骨/软骨再生修复，在骨/软骨缺损填充方面具有很好的应用前景。
背景技术
组织工程从提出到现在，已经取得了突飞猛进的发展，不仅在动物体内构建出各种组织工程化的组织，同时在临床上也有广泛的应用，并且得到了持久的疗效。组织工程技术能避免传统自体或者异体组织、器官移植治疗中免疫排斥反应以及供体来源不足的情况，并且有希望实现组织、器官重建从而解决临床上的困难。组织工程的研究包括种子细胞、支架材料以及构建组织和器官的方法和技术。支架材料作为组织工程学的重要因素之一，在再生过程中发挥重要的作用。但早期的支架材料大多使用合成聚合物，虽然具有生物相容性，但这些材料对细胞无益处，没有细胞粘附位点，导致细胞无法正常生长。
透明质酸作为细胞外基质，有较好的生物相容性，含水量高，但结构简单，功能单一，同时降解速度过快，力学性能差，无法满足应用要求。水凝胶是通过单个聚合物链的物理或化学交联形成的聚合物网络，能够吸收大量的水而在水中不溶解，它作为组织工程支架，具有一定的力学支撑，其三维网络结构可以为细胞提供生长环境，同时一定的孔隙结构有利于营养物质，氧气的传输以及代谢产物的排出。同时，细胞间基质具有生物诱导作用，可以定向和诱导组织的特异性修复。例如透明质酸钠具有管理细胞粘附和迁移、调节细胞***和分化等生物学功能，以此制备水凝胶在生物医药领域达到了越来越多的重视。近年来，由于迈克尔加成反应的环境友好性、生物惰性和反应速度可控性，使其广泛的被使用在生物体内原位交联水凝胶的应用中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用，该注射剂的基本化学原理是：在一定条件下，使巯基和马来酰亚胺基团之间的快速化学交联反应，混合不同比例的蛋白质类天然材料及生物活性物质。本发明中的注射剂具有生物相容性好、不产生副产物、稳定性好、使用方便、成本低廉等优点。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：
一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂，其结构如式Ⅰ所示，
Figure BDA0002493652100000031
其中
Figure BDA0002493652100000032
为巯基改性的天然材料或合成聚合物，
Figure BDA0002493652100000033
为含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物,
Figure BDA0002493652100000034
为蛋白质类天然材料或其衍生物，
Figure BDA0002493652100000035
为生物活性物质。
作为优选，所述的天然材料或合成聚合物具有羧基官能团，包括但不限于透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯、聚胱胺酸中的任意一种或几种；蛋白类天然材料或其衍生物包括但不局限于胶原、明胶、丝素蛋白中的任意一种或几种；生物活性物质包括但不局限于细胞、药物、蛋白类活性因子中的一种或几种。
以上所述注射剂的制备方法，包括以下步骤：
将巯基改性的天然材料或合成聚合物与含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物，其中混合不同比例的蛋白类高分子材料或其衍生物，负载细胞、药物、蛋白活性因子等生物活性物质，在迈克尔加成反应作用下进行化学交联，制得所述的负载生物活性物质的可注射双交联复合水凝胶注射剂，其反应式为：
Figure BDA0002493652100000041
其中，所述含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物中的双键基团的接枝率为1％～99％；所述巯基改性的天然材料或合成聚合物中的巯基接枝率为1％～99％。
作为优选，所述所需改性的天然材料或合成聚合物以透明质酸为例，向其中添加的蛋白类高分子材料或其衍生物以胶原蛋白为例，负载的细胞以软骨细胞为例，具体步骤如下：
步骤A.配液：分别配置马来酰亚胺化透明质酸溶液和巯基化透明质酸溶液；
步骤B.迈克尔加成反应：将步骤1中分别配制得到的马来酰亚胺化透明质酸溶液和巯基化透明质酸溶液混合，再加入胶原蛋白溶液和软骨细胞悬液混合均匀，静置，使含有胶原蛋白、软骨细胞的马来酰亚胺化透明质酸溶液与巯基化透明质酸溶液在迈克尔加成反应的作用下形成水凝胶注射剂。
作为优选，巯基改性的透明质酸溶液、马来酰亚胺透明质酸溶液和胶原蛋白溶液是等体积比配置。
作为优选，巯基化透明质酸和马来酰亚胺化透明质酸的用量摩尔比为：1～50:1～50。
所述马来酰亚胺化透明质酸的结构式如式Ⅱ所示，所述巯基化透明质酸的结构式如式Ⅲ所示。
Figure BDA0002493652100000051
作为优选，所述巯基化透明质酸溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为0.1wt％～10wt％。所述马来酰亚胺化透明质酸溶液的pH值为7.0～8.0浓度为0.1wt％～10wt％。所述添加的胶原蛋白溶液的pH值为7.0～8.0浓度为0.1wt％～10wt％。所述软骨细胞悬液的浓度为5×102～5×1010cells/mL。
作为优选，所述透明质酸衍生物溶液与胶原蛋白的体积比控制在1:0.1～0.1:1。
作为优选，所述透明质酸的分子量均为1-6000KDa，胶原蛋白为Ι或者Ⅱ型胶原蛋白。
作为优选，在室温条件下进行迈克尔加成反应。
作为优选，所述巯基化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶解于Mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～2h，然后加入半胱胺盐酸盐在室温下反应10～15h，透析，得到巯基化透明质酸；透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与半胱胺盐酸盐的摩尔比按需求调控。
作为优选，所述马来酰亚胺化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶解于Mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～2h，然后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐，在室温下反应10～15h，透析，得到马来酰亚胺化透明质酸；透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐的摩尔比按需求调控。
作为优选，该水凝胶注射剂可作为促进软骨/骨再生修复的注射剂，也可作为药物/蛋白/基因的载体、或/和生物支架材料的应用。
更进一步优选，所述生物材料为组织工程三维细胞支架。
作为优选，所述组织工程三维细胞支架的制备方法为：
步骤A.将结构式如式Ⅱ所示且马来酰亚胺基团的接枝率为8％～50％的马来酰亚胺化透明质酸用培养基溶解形成浓度为1wt％～5wt％的马来酰亚胺化透明质酸溶液；
将结构式如式Ⅲ所示且巯基含量为10％～70％的巯基化透明质酸用培养基溶解形成浓度为1wt％～5wt％的巯基化透明质酸溶液；
将Ι型胶原蛋白用过完生物滤头的稀醋酸溶解形成浓度为1wt％～5wt％的Ι型胶原蛋白溶液。
步骤B.分别向制得的巯基化透明质酸溶液和马来酰亚胺化透明质酸溶液中加入等体积的Ι型胶原蛋白溶液后混匀，调节pH值至7.0～8.0，然后向其中加入细胞悬液并混合均匀。
进一步地，将调节pH值后的混合溶液立即注射至生物体内的待修复部位形成水凝胶，得到组织工程三维支架；或者注入模具中，静置成胶，而后将所得水凝胶从模具中取出并浸没于培养基中，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养至少1天，得到组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基。
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素和链霉素混合液的浓度为0.8％～1.2％，抗坏血酸的浓度为0.15％～0.25％，胎牛血清的浓度为8％～12％。
其中，作为优选，细胞悬液的加入量为：按照5×105～5×106cells/mL的比例向基于天然材料透明质酸的可注射双交联复合水凝胶混合液中加入细胞悬液。
与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：
(一)、本发明制备得到的注射剂设计科学，操作简便，有良好的可注射性、生物相容性、并且可降解、不产生副产物、稳定性好、成本低廉等，是理想的组织工程生物填充及修复材料。
(二)、本发明的可注射双交联复合水凝胶，以透明质酸为原材料，进行功能化改性，由巯基化透明质酸和马来酰亚胺化透明质酸混合胶原蛋白且在迈克尔加成反应作用下而成。透明质酸和胶原都是细胞外基质的主要成分，该材料具有良好的生物相容性并且可降解。将细胞包裹在水凝胶前驱体溶液中，其可注射性能够填充任意形状的组织缺损部位，同时快速成胶可以防止细胞流失，使手术操作更加简便，可控性强，在组织缺损修复领域和填充中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为测定六组可注射双交联透明质酸基水凝胶的注射挤推力图；
图2为测定六组可注射双交联透明质酸基水凝胶的流变测试曲线图；
图3为六组可注射双交联透明质酸基水凝胶的溶胀性能测试图；
图4为六组可注射双交联透明质酸基水凝胶的降解性能测试图；
图5为六组可注射双交联透明质酸基水凝胶的力学性能测试图；
图6为六组可注射双交联透明质酸基水凝胶内细胞增殖图；
图7为三组水凝胶/细胞复合物的表观形貌变化图；
图8为三组水凝胶/细胞复合物内细胞的FDA/PI和骨架染色图；
图9为三组水凝胶/细胞复合物内细胞CCK-8检测图；
具体实施方式
为了使本发明内容更加便于理解，下面将结合附图和具体实施方式对本发明中所述的工艺做进一步的阐述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂，其结构如式Ⅰ所示，
Figure BDA0002493652100000081
其中
Figure BDA0002493652100000091
为巯基改性的天然材料或合成聚合物，具体为巯基改性的透明质酸，羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯或聚胱胺酸。
Figure BDA0002493652100000092
为含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物,
比如含有双键化合物改性的透明质酸,羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯或聚胱胺酸。
Figure BDA0002493652100000093
为胶原蛋白、明胶或丝素蛋白。
Figure BDA0002493652100000094
为软骨细胞、药物或蛋白类活性因子。
实施例1：
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为100000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向溶解液中加入0.56g半胱胺盐酸盐并调节溶液的pH值至5.0，再向其中加入0.9g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品A1待用。
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为100000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向其中加入0.6g的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐，调节pH值至5.0，加入0.6g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品B1待用。
取0.04g的A1和0.04g的B1样品；再另外取0.02g的A1和0.02g的B1，分别溶于2mL的PBS溶液中，快速混合A1,B1溶液,再向混合液中加入等体积的胶原溶液，室温下得到终浓度为20mg/mL和10mg/mL的混合溶液Ⅰ和II，即水凝胶Ⅰ和II。
实施例2：
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为340000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向溶解液中加入0.56g半胱胺盐酸盐，半胱胺盐酸盐并通过滴加NaOH和HCl调整溶液的pH值到5.0左右，再向其中加入0.9g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品A2待用。
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为340000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向其中加入0.6g的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐，调节pH值到5.0，加入0.6g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品B2待用。
取0.04g的A2和0.04g的B2样品；再另取0.02g的A2和0.02g的B2样品，分别溶于2mL的PBS溶液中，快速混合A2,B2溶液,再向混合液中加入等体积的胶原溶液，室温下得到终浓度为20mg/mL和10mg/mL的混合溶液III和IV，即水凝胶III和IV。
实施例3:
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为1000000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向溶解液中加入0.56g半胱胺盐酸盐，并通过滴加NaOH和HCl调整溶液的pH值到5.0左右，再向其中加入0.9g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品A3待用。
称取0.4g的透明质酸钠(分子量为1000000Da)干粉溶于40mL的PBS溶液中，向其中加入0.6g的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐，调节pH值到5.0，加入0.6g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和0.3g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，保持pH值稳定不变，在室温下反应24h，将反应液透析提纯后冻干，得到样品B3待用。
称取0.04g的A3和0.04g的B3样品；再另取0.02g的A3和0.02g的B3样品，分别溶于2mL的PBS溶液中，快速混合A3,B3溶液,再向混合液中加入等体积的胶原溶液，室温下得到终浓度为20mg/mL和10mg/mL的混合溶液V和VI，即水凝胶V和VI。
测试1：
取实施例1、2、3中分别制备的混合液I、II、III、IV、V和VI。于万能材料试验机下测定各组样品的可注射挤推力，具体测定结果如图1所示。由图1可知，可以发现前驱体溶液浓度对水凝胶的注射挤推力的影响要远大于分子量带来的作用。20mg/mL组别的水凝胶的挤推力分布在24-42N，远高于10mg/mL组别的17-20N。
测试2：
取实施例1、2、3中的混合液I、II、III、IV、V和VI。于旋转流变仪下检测其储能模量G’，损耗模量G”随时间变化曲线如图2所示。由图2可知，1.0M Da 20mg/mL组水凝胶的凝胶时间最短，只需要5秒左右，而在六组中最长的凝胶时间也不超过两分钟。
测试4：
取实施例1、2、3中的混合液I、II、III、IV、V和VI。分别检测其在PBS溶液中的溶胀性能，如图3所示。由图3可知，六组水凝胶中溶胀比最大的是0.1M Da 10mg/mL，其溶胀率可以达到36％，最小的是1.0M Da 20mg/mL组，其溶胀率可以达到23％，该结果表明了此类透明质酸基水凝胶具有较好的溶胀性能。
测试5：
取实施例1、2、3中的混合液I、II、III、IV、V和VI。分别检测其在DTT溶液(A)和透明质酸酶溶液(B)中的降解性能，如图4所示。由图4可知，在0.1mM DTT的还原降解作用下，水凝胶在前4个小时内降解较快，当达到17个小时后其质量趋于稳定。六组水凝胶在透明质酸酶中的总的降解趋势是，随着透明质酸的分子量和前驱体溶液浓度的减小，其降解速率逐渐增大。
测试6：
取实施例1、2、3中的混合液I、II、III、IV、V和VI。分别检测其储能模量G’，损耗模量G”随频率变化曲线如图5所示。由图5可知，1.0M Da 20mg/mL组水凝胶的储能模量(G')在10Hz频率下可以达到13KPa，这是由于水凝胶内部由两种化学交联方式构建骨架网络及透明质酸分子量和浓度升高，分子间作用力升高的效果叠加导致的。
测试7：
取实施例1、2、3中的混合液I、II、III、IV、V和VI，混合软骨细胞培养7天，检测其细胞增殖情况，如图6所示。由图6可知，对于0.1M Da，10mg/mL组的水凝胶，细胞均匀分布在水凝胶中，在7天时细胞明显的出现出聚集生长的状态，以成簇生长的形式存在于凝胶内部；对于1.0M Da，20mg/mL组的水凝胶，在7天时也能观察到细胞聚集生长的现象，但是成团的密度没有0.1M Da，10mg/mL组的强，出现这种现象的原因可能是低分子凝胶内部孔径大，利于细胞的增殖迁移。
综合测试结果，分子量为100000Da，浓度为10mg/mL组水凝胶溶液II，包裹软骨细胞进行共培养，其在软骨组织工程中的应用较好。
实施例4：
本实施例公开了组织工程三维细胞支架的制备方法，具体步骤为：
步骤A.将实施例1中的马来酰亚胺化透明质酸(即样品A1)用培养基溶解形成浓度为10wt％的马来酰亚胺化透明质酸溶液；
将实施例1中的巯基化透明质酸(即样品B1)用培养基溶解形成浓度为10wt％的巯基化透明质酸溶液；
将Ι型胶原蛋白用过完生物滤头的稀醋酸溶解形成浓度为10wt％的Ι型胶原蛋白溶液。
步骤B.将制得的巯基化透明质酸溶液和马来酰亚胺化透明质酸溶液快速混合，然后加入Ι型胶原蛋白溶液后混匀(即马来酰亚胺化透明质酸溶液、巯基化透明质酸溶液和Ι型胶原蛋白溶液的体积比为1:1:1)，调节pH值至7.4，最后向其中加入细胞悬液并混合均匀。
其中，细胞悬液的加入量为：按照5×105～5×106cells/mL的比例向基于天然材料透明质酸的可注射双交联复合水凝胶混合液中加入细胞悬液。
将调节好pH值后的混合溶液分别入模具中，静置成胶，而后将所得水凝胶从模具中取出并浸没于培养基中，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养至少1天，培养期间定期每三天更换一次培养基。结果表明，得到组织工程三维细胞支架。
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1％，抗坏血酸的质量浓度为0.2％，胎牛血清的质量浓度为10％。本实施例中青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。
分别培养3天、7天、14天、21天后取出三维细胞支架，首先用数码相机拍照，观察培养不同时间后凝胶块降解情况，如图7所示。然后使用PBS缓冲液清洗3遍，将清洗后的三维细胞支架浸没于含有5μg/mL FDA和1μg/mL PI的染液中染色1min。同时，将清洗后的三维细胞支架浸没于含有鬼笔环肽染液中染色3h，然后用PBS缓冲液清洗3次，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察三维支架中的细胞的生长状态和细胞骨架，如图8所示。接下来用CCK-8试剂进行定量检测其凝胶块内部细胞的增殖情况，结果如图9所示。其中，对照组是纯透明质酸水凝胶和纯胶原水凝胶。
从以上附图可以看出，，随着时间的增加，细胞增殖情况明显，并且在后期出现成团生长，结果表面，该水凝胶有利于应用于组织工程三维细胞支架。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂，其特征在于该注射剂的结构如式Ⅰ所示，
Figure FDA0002493652090000011
其中
Figure FDA0002493652090000012
为巯基改性的天然材料或合成聚合物，
Figure FDA0002493652090000013
为含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物,
Figure FDA0002493652090000014
为蛋白质类天然材料或其衍生物，
Figure FDA0002493652090000015
为生物活性物质。
2.如权利要求1所述的注射剂，其特征在于：所述巯基改性的天然材料或合成聚合物和含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物中的天然材料或合成聚合物均具有羧基官能团，包括但不限于透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯、聚胱胺酸中的任意一种或几种；所述的蛋白类天然材料或其衍生物包括但不限于胶原、明胶、丝素蛋白中的任意一种或几种；所述的生物活性物质包括但不局限于细胞、药物、蛋白类活性因子中的一种或几种。
3.如权利要求1所述注射剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将巯基改性的天然材料或合成聚合物与含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物分别配置成溶液，再将分别配置的溶液与蛋白类高分子材料或其衍生物，负载细胞、药物或蛋白活性因子，在迈克尔加成反应作用下进行化学交联，制得所述的负载生物活性物质的可注射双交联复合水凝胶注射剂；其反应式为：
Figure FDA0002493652090000021
其中，所述含有双键化合物改性的天然材料或合成聚合物中的双键基团的接枝率为1％～99％；所述巯基改性的天然材料或合成聚合物中的巯基接枝率为1％～99％。
4.如权利要求3所述注射剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤A.配液：分别配置马来酰亚胺化透明质酸溶液和巯基化透明质酸溶液；
步骤B.迈克尔加成反应：将步骤A中分别配制的马来酰亚胺化透明质酸溶液和巯基化透明质酸溶液混合，然后加入胶原蛋白溶液和软骨细胞悬液混合均匀，静置；使含有胶原蛋白、软骨细胞的马来酰亚胺化透明质酸溶液与巯基化透明质酸溶液在迈克尔加成反应的作用下形成水凝胶；
巯基化透明质酸和马来酰亚胺化透明质酸的摩尔比为：1～50:1～25。
5.如权利要求4所述注射剂的制备方法，其特征在于，
所述马来酰亚胺化透明质酸的结构式如式Ⅱ所示，所述巯基化透明质酸的结构式如式Ⅲ所示。
Figure FDA0002493652090000031
6.如权利要求4所述注射剂的制备方法，其特征在于，所述巯基化透明质酸溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为0.1wt％～10wt％；
所述马来酰亚胺化透明质酸溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为0.1wt％～10wt％；
所述胶原蛋白溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为0.1wt％～10wt％；
所述软骨细胞悬液的浓度为5×102～5×1010cells/mL。
7.如权利要求4所述注射剂的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的分子量均为1-6000KDa；所述的胶原蛋白为Ι型或Ⅱ型胶原蛋白；总透明质酸衍生物溶液与总胶原蛋白的体积比为在1:0.1～0.1:1；迈克尔加成反应的温度为室温。
8.如权利要求4所述的注射剂的制备方法，其特征在于，所述巯基化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶解于Mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～2h，然后加入半胱胺盐酸盐在室温下反应10～15h，透析，得到巯基化透明质酸；透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与半胱胺盐酸盐的摩尔比按需求调控。
9.如权利要求4所述注射剂的制备方法，其特征在于，所述马来酰亚胺化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶解于Mes缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～2h，然后加入N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐，在室温下反应10～15h，透析，得到马来酰亚胺化透明质酸；透明质酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐的摩尔比按需求调控。
10.如权利要求1或权利要求2所述注射剂可作为促进软骨/骨再生修复的注射剂，也可作为药物/蛋白/基因的载体、或/和生物支架材料的应用。
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