CN110123842A

CN110123842A - 一种外泌体缓释体系及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110123842A
Application number: CN201810136419.8A
Authority: CN
Inventors: 杨云龙; 汪泱
Original assignee: Shanghai Sixth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Aikesong Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN110123842B

Abstract

本发明涉及一种基于透明质酸与膜蛋白CD44结合作用实现CD44阳性外泌体缓释的外泌体体系及其构建方法与应用。本发明将CD44阳性外泌体有效的结合到由透明质酸构建的材料中，进而实现外泌体的长久释放。本发明提供的方法可以有效解决外泌体在体内驻留时间短的问题，提高外泌体的治疗效率。

Description

一种外泌体缓释体系及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种外泌体缓释体系及其构建方法与应用。

背景技术

外泌体是真核细胞内部多泡内含体与细胞膜融合形成的释放到细胞外的纳米级囊泡，直径为30–100nm。人体内，几乎所有的细胞都会分泌外泌体；同时，各种体液以及血液中都有外泌体的分布。外泌体包含母体细胞的基因、蛋白质以及磷脂等物质，可以与受体细胞的细胞膜融合，并将这些物质传递给受体细胞，进而对受体细胞施加影响。另外，外泌体表面继承了部分母体细胞的膜蛋白，具有识别特异性细胞的能力。不同细胞来源的外泌体中内含物质以及表面膜蛋白的种类有很大的差异，因此，这些外泌体表现出丰富的功能。目前为止大量的研究报道证实外泌体在机体的生理过程中发挥着举足轻重的作用。例如，外泌体可以作为免疫反应的促进者，并发挥着抗原呈递者的作用；外泌体在程序化的细胞凋亡、血管再生、炎症以及凝血中发挥着功能。外泌体还与疾病息息相关。部分癌肿瘤细胞分泌的外泌体可以向周边细胞传递致癌基因。例如，人类的恶性胶质瘤细胞通常会表达缩短并且致瘤的内皮生长因子受体EGFRvIII，而EGFRvIII可以通过外泌体向周边缺乏EGFRvIII的胶质瘤细胞进行传递，导致致癌因子向目标细胞的传递；同样，外泌体还在病原体在细胞之间的传递过程中发挥着作用。而外泌体与相关疾病之间的关系也为这些疾病的诊断提供了新的依据。

与此同时，外泌体丰富的功能使其在疾病的治疗中得到了广泛的研究与应用，其中使用最广泛就是干细胞来源外泌体。近年来，众多研究报道证实干细胞主要通过旁分泌机制促进组织损伤的修复与再生，而外泌体作为干细胞旁分泌机制的主要承担者包含了大量母体细胞的基因以及蛋白等物质，因此干细胞来源外泌体同样具备一定的干细胞治疗的潜力。2006年，J.Ratajczak等人证实胚胎干细胞来源的外泌体可以将胚胎干细胞中的mRNA以及蛋白转入造血祖细胞，引起造血祖细胞的重新编程。他们的研究也奠定了干细胞来源外泌体可以通过向受体细胞传递自身物质进而改变细胞命运的基础。研究显示包括多能干细胞、间充质干细胞等细胞分泌的外泌体具有促进细胞增殖、迁移、抑制细胞炎症反应、细胞保护等功能。而干细胞外泌体对细胞的积极影响在宏观上促进了组织损伤的修复、再生以及抑制组织的进一步病变。目前，干细胞来源的外泌体已经被证实在在肾脏、肝脏、心脏、运动***的损伤以及多种组织的缺血性损伤中有良好的治疗效果。与干细胞治疗相比，干细胞来源外泌体的使用避免了干细胞移植面临的安全性风行，且其使用、储存和运输更加便捷。因此，基于干细胞外泌体的治疗方法具有很大潜力替代干细胞治疗。目前，基于干细胞外泌体的治疗技术已经开始向临床应用进行转化。外泌体在疾病治疗中的另一应用方式是作为药物的纳米载体，实现疾病的治疗。外泌体是机体分泌的天然纳米物质传递载体。与人工合成的纳米药物载体相比，外泌体具有独特的优势：首先外泌体的物质均由细胞分泌，避免了人工合成的载体材料的生物毒性等问题；其次，外泌体的外膜由细胞膜而来，更容易与细胞膜融合，有效的向细胞内部递送药物；再次，不同细胞的外泌体表面分布着种类丰富的表面蛋白，这些蛋白赋予外泌体多样的功能，例如免疫豁免、特异性识别等。同时，外泌体表面可以通过分子生物学或者物理、化学手段进行表面修饰，赋予外泌体更多的功能。例如，未成熟的树突细胞来源的外泌体具有低免疫原性，因此被广泛用作药物的纳米载体。Lydia Alvarez-Erviti等人通过分子生物学手段将神经细胞靶向基团RVG修饰到树突细胞外泌体的膜蛋白Lamp2b上，并利用这些外泌体负载BACE1的siRNA，验证了这些外泌体在艾滋海默症治疗中的潜力。Yanhua Tian等人同样通过分子生物学手段将肿瘤靶向性基团iRGD修饰到树突细胞表面，并负载阿霉素，提高了外泌体负载药物***的疗效。

目前为止，外泌体在疾病治疗中主要的给予方式是静脉注射或者局部注射。但是相关的研究报道显示，静脉注射的外泌体进入哺乳动物体内主要富集在肝脏与脾脏，并被迅速代谢，在体内的滞留时间不超过24小时；局部注射的外泌体同样存在滞留时间短的问题。该问题严重影响了外泌体的治疗效率。目前的研究报道中，外泌体要实现对疾病有效的治疗必须通过大量多次的注射，以维持其有效浓度，造成治疗成本的提高。鉴于此，如何实现外泌体在作用部位长久的驻留与释放是实现外泌体治疗的关键问题，可是目前并没有有效的方法解决上述问题。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种外泌体缓释体系及其构建方法与应用。

本发明提出一种基于透明质酸与膜蛋白CD44结合作用实现CD44阳性外泌体缓释的方法。CD44是一类细胞膜表面糖蛋白，分布极其广泛，包括干细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等众多种类细胞表面都有分布。CD44的结构中含有透明质酸的结合域，可以结合到透明质酸分子链上。因此，CD44阳性的外泌体可以有效的结合到由透明质酸构建的材料中，进而实现外泌体的长久释放。本发明提供的方法可以有效解决外泌体在体内驻留时间短的问题，提高外泌体的治疗效率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：提供一种基于透明质酸与CD44膜蛋白相互作用的外泌体缓释体系的构建方法，主要包括以下步骤：

1)、通过一定方法分离提取CD44阳性的外泌体，并与生物相容性介质混合，制备成一定浓度的外泌体悬液；

2)、将一定分子量的透明质酸或透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中；

3)、将步骤1)与步骤2)中的溶液充分混合均匀；

4)、利用步骤3)中的混合溶液通过一定方法制备负载CD44阳性外泌体的缓释体系，所述缓释体系包括溶液、水凝胶、多孔支架或者膜材。

在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，所述CD44阳性的外泌体主要包括干细胞来源外泌体(如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞等)、树突细胞来源外泌体、肿瘤细胞来源外泌体等。

在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，所述CD44阳性的外泌体的分离提取方法主要包括超速离心法、超滤法、体积排阻色谱法以及免疫磁珠法，优选为超速离心法。

在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，所述CD44阳性的外泌体在外泌体悬液中的浓度范围为1×10⁵/mL–1×10¹³/mL，优选为1×10¹⁰/mL–1×10¹²/mL。

在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，所述生物相容性介质包括蒸馏水、生理盐水、生理缓冲液以及细胞培养基。

在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述透明质酸的数均分子量范围为1KDa–6000KDa。

在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述透明质酸修饰物的数均分子量范围为5KDa–6000KDa。

在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述透明质酸修饰物选自以下物质中的一种或几种：丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、甲基丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、端基功能化聚乙二醇修饰的透明质酸、氧化多醛基透明质酸、邻苯二酚类基团修饰的透明质酸、氨基衍生物修饰的透明质酸、巯基衍生物修饰的透明质酸、马来酰亚胺衍生物修饰的透明质酸等。

在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，所述生物相容性介质包括蒸馏水、生理盐水、生理缓冲液以及细胞培养基。

在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，所述缓释体系为溶液时，制备负载CD44阳性外泌体的缓释溶液的具体方法为：

将步骤1)与步骤2)中的溶液充分混合均匀，得到透明质酸溶液。其中，透明质酸或明质酸修饰物的质量浓度范围为0.001％-20％，优选为0.1％-8％。

在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，所述缓释体系为水凝胶时，负载CD44阳性外泌体的缓释水凝胶包括负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶和负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶。

其中，制备负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶的具体方法为：

将一定浓度的透明质酸修饰物与光引发剂充分溶解于生物相容性介质中，然后与外泌体悬液充分混合，利用一定波长的光源照射一定时间，制备负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶。

该方法中，透明质酸修饰物主要包括丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、甲基丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸；透明质酸修饰物的质量浓度范围为0.5％-10％，优选为2％-5％；光引发剂包括I2959、TPO或EosinY，其对应的激发波长分别为365nm，365nm，524nm；光源照射时间范围为10s–30min，优选为1min–10min。

其中，制备负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶的具体方法为：

将一定浓度的透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中，并与CD44阳性外泌体悬液充分混合；将水凝胶的另一组分溶液溶解于相同的生物相容性介质中，将两组溶液分别加入到双组份注射器的针筒中，进行注射成型，即得到负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶。

该方法中，透明质酸修饰物包括：

A、氧化多醛基透明质酸，其对应的另一组分包括H₂N(CH2)_nNH₂(n为正整数，n≥1)、水溶性壳聚糖、端基为氨基的单链聚乙二醇或多臂聚乙二醇、明胶、聚赖氨酸、胶原等；

B、邻苯二酚类基团修饰的透明质酸，其对应的另一组分包括高碘酸钠、过氧化氢等小分子氧化剂；

C、氨基衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分包括戊二醛、京尼平、端基为醛基的单链聚乙二醇或多臂聚乙二醇等；

D、巯基衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分为马来酰亚胺、乙烯基修饰的水溶性高分子，包括水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、海藻酸、葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、单链或多臂聚乙二醇、聚甲基丙烯酸等；

E、马来酰亚胺衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分为巯基修饰的水溶性高分子，包括水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、海藻酸、葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、单链或多臂聚乙二醇、聚甲基丙烯酸等。

在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，所述缓释体系为膜材时，负载CD44阳性外泌体的缓释膜材的制备方法为：

将透明质酸或透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中，然后与外泌体悬液混合，再同另一水溶性高分子材料的生物相容性介质充分混合；将上述溶液均匀涂抹在底板上，然后将底版置于一定温度的干燥箱中，直至液体挥发完全，将底板上的膜材取下。

上述方法中，水溶性高分子包括壳聚糖、海藻酸、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、硫酸软骨素及它们的修饰物等；

蛋白以及多肽，包括胶原、明胶、聚氨基酸及它们的修饰物等；

人工合成高分子材料，包括聚乙二醇、多臂聚乙二醇、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酰胺、聚吡咯烷酮及它们的修饰物。

上述方法中，干燥温度的范围为4℃–80℃，优选为40℃。

上述方法中，底板可以采用聚四氟乙烯材质。

本发明第二方面：提供基于上述发明第一方面给出的构建方法得到的基于透明质酸与CD44膜蛋白相互作用的外泌体缓释体系。

负载CD44阳性外泌体的缓释体系包括溶液、水凝胶、多孔支架或者膜材。

其中，负载CD44阳性外泌体的缓释溶液为：

CD44阳性外泌体、透明质酸或透明质酸修饰物、生物相容性介质混合后所得的混合溶液，其中，透明质酸或明质酸修饰物的质量浓度范围为0.001％-20％，优选为0.1％-8％。

其中，负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶为：

透明质酸修饰物、光引发剂、CD44阳性外泌体、生物相容性介质混合后，光照后所得物。

透明质酸修饰物主要包括丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、甲基丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸；透明质酸修饰物的质量浓度范围为0.5％-10％，优选为2％-5％；光引发剂包括I2959、TPO或EosinY，其对应的激发波长分别为365nm，365nm，524nm；光源照射时间范围为10s–30min，优选为1min–10min。

其中，负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶为：

透明质酸修饰物、CD44阳性外泌体、生物相容性介质混合后得到水凝胶体系一；另一组分溶液溶解于相同的生物相容性介质中得到水凝胶体系二，水凝胶体系一与水凝胶体系二注射成型后所得物。

透明质酸修饰物包括：

其中，负载CD44阳性外泌体的缓释膜材为：透明质酸或透明质酸修饰物、CD44阳性外泌体、水溶性高分子材料、生物相容性介质混合后，涂抹、干燥后所得的膜材。

其中，水溶性高分子包括壳聚糖、海藻酸、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、硫酸软骨素及它们的修饰物等；

本发明第三方面：提供基于上述发明第二方面给出的基于透明质酸与CD44膜蛋白相互作用的外泌体缓释体系的应用，包括以下应用：

1、在制备关节炎治疗相关药物上的应用；

2、在制备皮肤修复相关药物上的应用；

3、在制备冻结肩治疗相关药物上的应用；

4、在制备治疗脑部缺血性损伤相关药物上的应用；

5、作为组织修复材料的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1)本发明公开了一种CD44表达阳性外泌体的控制释放方法，能够有效克服当前外泌体治疗中外泌体难以在体内长时间驻留并在作用部位持久有效发挥功能的问题，为外泌体治疗提供了一种全新的方法。

2)人体内大部分细胞都会表达CD44膜蛋白，因此大部分细胞分泌的外泌体都是CD44阳性，因此本发明的方法的使用范围非常广泛；

3)本方法的实施包含着负载外泌体的材料的构建，这些材料非常适合作为组织修复的材料使用，本方法非常适合在再生医学领域进行应用。

4)本方法中使用的材料制备方法简单，成本低廉，适用范围非常广泛。

附图说明

附图1：外泌体从光交联透明质酸水凝胶释放的曲线图。

附图2：外泌体从透明质酸-明胶膜材释放曲线及其与羧甲基纤维素-明胶膜材释放情况对比。

附图3：活体成像荧光强度随时间变化图。

附图4：老鼠关节炎治疗效果的ICRS组织学评分。

附图5：老鼠的肩关节活动度。

附图6：老鼠的肩关节囊厚度。

附图7：不同时间点，裸鼠肿瘤的体积。

附图8：特定时间下，老鼠背部伤口面积。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

负载骨髓间充质干细胞来源外泌体(BMSC-Exos)透明质酸溶液的制备

BMSC-Exos的提取：取5瓶T75的细胞生长面积为60％-70％的第5代的人骨髓间充质干细胞，更换15mL的无血清培养基继续培养2天。收集这些培养基，并分装于10管50mL的离心管中。分别在300g、2,000g、10,000g的转速下各离心20min，取出培养基中的细胞、细胞碎片以及细胞器等杂质。随后100,000下离心1h，并吸去上清液，每管保留200μL左右的下层液体。通过透射电镜和表面蛋白的免疫印迹对外泌体进行鉴定。

随后，将200μL的外泌体分散于1ml的生理缓冲液中。通过纳米粒子分析仪测得外泌体悬液中外泌体的浓度为1×10¹¹/mL。准确称取0.1g透明质酸(分子量：1300KDa)，充分溶解于9mL的生理缓冲液中。将外泌体悬液与透明质酸溶液充分混合，涡旋震荡10–20s，得到负载骨髓间充质干细胞来源外泌体的透明质酸溶液。

实施例2：

负载诱导多能干细胞来源外泌体(iPS-Exos)的光交联水凝胶外泌体缓释体系的构建

人诱导人多能干细胞(iPSCs)的培养和外泌体的提取与鉴定

在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将iPSC移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCell Vancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO₂，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD数均分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD数均分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求以PBS定容至一定体积，得到外泌体悬液iPS-Exos，分装保存至-80℃。

iPS-Exos的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

将上述提取的诱导多能干细胞来源外泌体(iPS-Exos)，分散于1mL的生理盐水中。通过纳米粒子分析仪测得提取的外泌体的浓度为1×10¹²/mL。按照文献的方法合成甲基丙烯酸酯修饰的透明质酸(HAMA，数均分子量250KDa)。准确称取100mg的HAMA和1mg的I2959溶解于9mL的生理盐水中，将该溶液与1mL的iPS-Exos悬液均匀混合分散。取500μL混合液，加入到聚四氟乙烯模具中，利用365nm的LED光源照射3min，制备iPS-Exos的缓释水凝胶。利用流变仪测得该水凝胶的剪切模量为3KPa。

将上述制备的负载iPS-Exos的水凝胶材料浸泡在2mL生理缓冲液中，并放置于37℃的恒温环境中。每天收集浸泡凝胶的缓冲液，同时加入2mL新鲜的缓冲液。利用纳米粒子分析仪测定缓冲液中外泌体的浓度，进而测定iPS-Exos的释放情况。实验结果显示(附图1)，在1个月的检测期限内，可以检测到外泌体近似线性的释放；一个月后，外泌体的释放效率为总量的60％。该实验结果证实，本发明的方法可以实现CD44表达阳性外泌体长久有效的释放。

实施例3：

负载胚胎干细胞来源外泌体(ES-Exos)的透明质酸膜材的构建

将实施例2提取的诱导多能干细胞来源外泌体(iPS-Exos)，分散于1mL的蒸馏水中，通过纳米粒子分析仪测得外泌体悬液的浓度为1×10¹⁰/mL。准确称取数均分子量为130KDa的透明质酸0.05g和明胶0.05g溶解于9mL的蒸馏水中，并与iPS-Exos悬液混合。然后取500μL上述溶液均匀涂抹在聚四氟乙烯底板上，将底板置于40℃的恒温干燥箱中，干燥24h，得到负载iPS-Exos的透明质酸-明胶膜材。

进一步，按照同样的方法制备与上述膜材相同的负载iPS-Exos的羧甲基纤维-明胶膜。将二张膜分别浸泡于2mL的生理缓冲液中。间隔一定时间测定生理缓冲液中的外泌体含量。实验结果显示(附图2)，在2天的释放时间里，90％的外泌体从羧甲基-明胶膜中释放到周围的液体中，而只有30％左右的外泌体从透明质酸-明胶膜中释放。该结果充分证明，利用本发明的方法可以有效的实现CD44阳性外泌体的缓释。

实施例4：

负载BMSC-Exos的透明质酸溶液在大鼠关节腔中的驻留情况

取5uL的DiI荧光染料的工作液，加入到2mL的BMSC-Exos悬液中，37℃下孵育15min。随后，利用体积排阻色谱柱分离DiI标记的外泌体。参照实施例1的方法构建负载DiI标记的BMSC-Exos的透明质酸溶液。

取10只SD大鼠，随机平均分成两组。向第一组大鼠的膝关节腔内注射200μL负载DiI标记的BMSC-Exos的透明质酸溶液，向第二组大鼠的膝关节腔内注射200μL含等量DiI标记的外泌体悬液。利用小动物活体成像仪在特定时间点检测每只大鼠关节腔内的荧光发射光子数。实验结果显示(附图3)，单纯注射外泌体组中关节腔内荧光发射光子数衰减的很快，3天内基本检测不到任何荧光发射；而注射负载外泌体的透明质酸溶液组关节腔内荧光衰减缓慢，7天时依旧可以检测到荧光发射。该结果证明本发明的方法可以在体内有效的实现外泌体的缓释。

实施例5：

利用负载BMSC-Exos的透明质酸溶液治疗大鼠的骨性关节炎

取20只SD大鼠，利用交叉韧带截断法建立大鼠的骨关节炎模型。同时，参照实施例1中的方法制备10mL负载BMSC-Exos的透明质酸溶液。将上述SD大鼠等分成四组，第一组关节腔内注射500μL负载BMSC-Exos的透明质酸溶液，第二组关节腔内注射500μL等量BMSC-Exos的悬液；第三组关节腔内注射500等浓度的透明质酸溶液；第四组关节腔内注射500μL的生理盐水。

注射4周后，处死上述每组中的老鼠，提取膝关节样本。对样本进行固定脱钙、切片以及H&E染色处理，观察每组中每只老鼠的膝关节软骨的情况，并依据国际软骨学会的软骨修复组织学评分标准进行组织学评分。实验结果显示(附图4)，负载BMSC-Exos的透明质酸溶液处理的老鼠膝关节部位的组织学评分显著高于其他两组，且这些老鼠的膝关节部位的软骨退化情况较弱；而单纯注射外泌体或透明质酸的老鼠膝关节部位的组织学评分相似，这两组中膝关节软骨层出现较明显的缺失，软骨基质分泌异常，但是软骨退化情况要稍好于对照组。上述结果显示，本发明的方法可以有效实现外泌体在关节腔的缓释，进而提高外泌体的治疗效率。

实施例6：

利用负载iPS-MSC-Exos的透明质酸溶液预防大鼠的冻结肩

取5瓶T75的生长面积为60％-70％的iPS诱导分化的间充质干细胞(iPS-MSC)，更换成15mL无血清的MSC培养基培养2天。收集这些培养基，并通过300g和2000g的离心出去培养基中的细胞以及细胞碎片。随后，利用100KDa的超滤管将上述培养基浓缩至5mL。最后，将上述浓缩液分成5分，分别加入到qEV体积排阻色谱柱中，收集3min以后的流动相1mL，得到iPS-MSC-Exos。最后利用透射电镜和表面蛋白免疫印迹对提取的外泌体进行鉴定。

取200μL上述外泌体悬液分散于1mL的生理缓冲液中。参照实施例1的方法制备负载iPS-MSC-Exos的透明质酸溶液。取20只SD大鼠，利用肌腱缝合线固定大鼠的肘关节和肩胛骨，构建冻结肩动物模型。构建动物模型后，将上述SD大鼠等分成四组，第一组关节腔内每周注射200μL负载BMSC-Exos的透明质酸溶液；第二组关节腔内每周注射200μL等量BMSC-Exos的悬液；第三组关节腔内每周注射200μL等浓度的透明质酸溶液；第四组关节腔内注射200μL的生理缓冲液。连续注射5周后，提取每只老鼠的肩关节样本。首先测试上述各组老鼠中，每只老鼠的肩关节活动度。实验结果显示(附图5)，注射负载外泌体的透明质酸溶液的老鼠的肩关节活动度为130度左右，基本接近正常老鼠的肩关节活动度；单纯注射外泌体组的肩关节活动度为110度左右；而单纯注射透明质酸的肩关节活动度与对照组接近。随后，提取关节囊样本，利用透射电镜观察关节囊的厚度。透射电镜的实验结果显示(附图6)，注射负载外泌体的透明质酸溶液组的关节囊厚度明显比其他组薄。综合上述实验结果，本发明的方法可以有效的预防冻结肩的发生，同时，利用透明质酸负载并缓释外泌体可以显著提升外泌体治疗的效果。

实施例7：

负载包裹紫杉醇(PTX)的ES-Exos的透明质酸水凝胶的抗癌效果评价

配制5μM的PTX的生理缓冲液溶液，并用该溶液分散新鲜提取的ES-Exos，置于37℃下孵育2h。随后，利用生理缓冲液进行三次超滤洗涤，并用体积排阻色谱柱纯化负载PTX的ES-Exos。通过高效液相色谱测得外泌体包裹PTX的浓度为2μM。

取0.5g的数均分子量为4000KDa的透明质酸，配制成0.1％的水溶液，参照文献的方法制备氧化多醛基的透明质酸。取该透明质酸0.2g溶解于5mL生理缓冲液中，同时取0.2g的水溶性壳聚糖(羧甲基壳聚糖)溶解于4mL的生理缓冲液中，并加入上述包裹PTX的ES-Exos悬液1mL，充分混合。将上述两个溶液分别加入到双组份注射器的两个针筒中。

取36只裸鼠，向腋下植入人乳腺癌细胞和基质胶的混合物，培养2周，形成皮下肿瘤。将老鼠随机等分成3组：第一组向老鼠皮下肿瘤部位边缘注射0.2mL的上述负载包裹PTX的ES-Exos氧化透明质酸-壳聚糖水凝胶前体溶液，并原位成胶；第二组向老鼠皮下肿瘤部位边缘注射0.5mL含等量PTX和ES-Exos的生理缓冲液；第三组直接注射生理缓冲液。在第2、7、14、28天时每组分别取出三只老鼠，提取出肿瘤组织，测定肿瘤的体积。实验结果显示(附图7)，第2天时注射PTX外泌体组的肿瘤体积要小于注射负载外泌体的水凝胶组；而到第7天时，水凝胶组对肿瘤的抑制效果明显优于外泌体组；第28天时，水凝胶组的肿瘤组织体积显著小于其他两组。上述实验结果证明本发明的方法可以有效实现载药CD44阳性外泌体的缓释，延长其在体内驻留时间，提高治疗效率。

实施例8：

利用负载iPS-Exos的透明质酸-明胶膜治疗大鼠的皮肤损伤

参照实施例3中的方法构建负载iPS-Exos的透明质酸-明胶膜。取15只SD大鼠，在老鼠的背部皮肤部位构建左右对称的4个直径为2cm的圆形皮肤缺损创面。在每只老鼠的第一个皮肤创面部位覆盖负载iPS-Exos的透明质酸-明胶膜，并进行缝合固定；第二个的皮肤创面部位涂抹0.2mL含等量iPS-Exos的外泌体生理盐水悬液；第三个皮肤创面部位涂抹0.2mL的生理盐水。在修复期内，每隔两天测量大鼠皮肤创面的面积，并计算愈合效率。实验结果显示(附图8)，利用负载iPS-Exos的透明质酸-明胶膜处理的皮肤创面的愈合速度明显优于其他两组。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、分离提取CD44阳性外泌体，并与生物相容性介质混合，制备成外泌体悬液；

2)、将透明质酸或透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中；

3)、将步骤1)与步骤2)中的溶液充分混合均匀；

4)、利用步骤3)中的混合溶液制备负载CD44阳性外泌体的缓释体系，所述缓释体系包括溶液、水凝胶、多孔支架或者膜材。

2.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述CD44阳性外泌体包括干细胞来源外泌体、树突细胞来源外泌体、肿瘤细胞来源外泌体。

3.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述CD44阳性外泌体在外泌体悬液中的浓度范围为1×10⁵/mL–1×10¹³/mL，优选为1×10¹⁰/mL–1×10¹²/mL。

4.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述透明质酸修饰物选自以下物质中的一种或几种：丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、甲基丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、端基功能化聚乙二醇修饰的透明质酸、氧化多醛基透明质酸、邻苯二酚类基团修饰的透明质酸、氨基衍生物修饰的透明质酸、巯基衍生物修饰的透明质酸、马来酰亚胺衍生物修饰的透明质酸。

5.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述缓释体系为溶液时，制备负载CD44阳性外泌体的缓释溶液的具体方法为：

将步骤1)与步骤2)中的溶液充分混合均匀，得到透明质酸溶液。其中，透明质酸或明质酸修饰物的浓度范围为0.001％-20％，优选为0.1％-8％。

6.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述缓释体系为负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶时，其制备方法为：将透明质酸修饰物与光引发剂充分溶解于生物相容性介质中，然后与外泌体悬液充分混合，利用光源照射，制备负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶；

透明质酸修饰物主要包括丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸、甲基丙烯酸酯类基团修饰的透明质酸；透明质酸修饰物的浓度范围为0.5％-10％，优选为2％-5％；光引发剂包括I2959、TPO或EosinY，其对应的激发波长分别为365nm，365nm，524nm；光源照射时间范围为10s–30min，优选为1min–10min。

7.根据权利要求6所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述缓释体系为负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶时，其具体方法为：将透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中，并与CD44阳性外泌体悬液充分混合；将水凝胶的另一组分溶液溶解于相同的生物相容性介质中，将两组溶液分别加入到双组份注射器的针筒中，进行注射成型，即得到负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶；

透明质酸修饰物包括：

A、氧化多醛基透明质酸，其对应的另一组分包括H₂N(CH2)_nNH₂(n为正整数，n≥1)、水溶性壳聚糖、端基为氨基的单链聚乙二醇或多臂聚乙二醇、明胶、聚赖氨酸、胶原；

C、氨基衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分包括戊二醛、京尼平、端基为醛基的单链聚乙二醇或多臂聚乙二醇；

D、巯基衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分为马来酰亚胺、乙烯基修饰的水溶性高分子，包括水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、海藻酸、葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、单链或多臂聚乙二醇、聚甲基丙烯酸；

E、马来酰亚胺衍生物修饰的透明质酸，其对应的另一组分为巯基修饰的水溶性高分子，包括水溶性壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、海藻酸、葡聚糖、肝素、硫酸软骨素、单链或多臂聚乙二醇、聚甲基丙烯酸。

8.根据权利要求1所述的一种外泌体缓释体系的构建方法，其特征在于，所述缓释体系为膜材时，负载CD44阳性外泌体的缓释膜材的制备方法为：

将透明质酸或透明质酸修饰物溶解于生物相容性介质中，然后与外泌体悬液混合，再同另一水溶性高分子材料的生物相容性介质充分混合；将上述溶液均匀涂抹在底板上，然后将底版置干燥箱中，直至液体挥发完全，将底板上的膜材取下；

所述水溶性高分子选择以下物质中的一种或几种：

壳聚糖、海藻酸、葡聚糖、羧甲基纤维素、肝素、硫酸软骨素及它们的修饰物；

蛋白以及多肽，包括胶原、明胶、聚氨基酸及它们的修饰物；

9.一种外泌体缓释体系，其特征在于，其为基于透明质酸与CD44膜蛋白相互作用的外泌体缓释体系，包括溶液、水凝胶或者膜材，

负载CD44阳性外泌体的缓释溶液为：CD44阳性外泌体、透明质酸或透明质酸修饰物、生物相容性介质混合后所得的混合溶液，其中，透明质酸或明质酸修饰物的浓度范围为0.001％-20％，优选为0.1％-8％；

负载CD44阳性外泌体的缓释光交联水凝胶为：透明质酸修饰物、光引发剂、CD44阳性外泌体、生物相容性介质混合后，光照后所得物；

负载CD44阳性外泌体的缓释原位注射水凝胶为：透明质酸修饰物、CD44阳性外泌体、生物相容性介质混合后得到水凝胶体系一；另一组分溶液溶解于相同的生物相容性介质中得到水凝胶体系二，水凝胶体系一与水凝胶体系二注射成型后所得物；

负载CD44阳性外泌体的缓释膜材为：透明质酸或透明质酸修饰物、CD44阳性外泌体、水溶性高分子材料、生物相容性介质混合后，涂抹、干燥后所得的膜材。

10.如权利要求9所述外泌体缓释体系的应用，其特征在于，包括以下应用：

1)、在制备关节炎治疗相关药物上的应用；

2)、在制备皮肤修复相关药物上的应用；

3)、在制备冻结肩治疗相关药物上的应用；

4)、在制备治疗脑部缺血性损伤相关药物上的应用；

5)、作为组织修复材料的应用。