CN117180494B - 可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多糖类生物材料及高分子化合物的组合物领域,涉及一种可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶及其制备方法,所述可注射多糖水凝胶是由交联的改性重组III型人源化胶原蛋白和交联的巯基化透明质酸组成的水凝胶,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联反应形成,所述交联的巯基化透明质酸由巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下自交联形成,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸形成了互穿的双交联网络结构。本发明提供的可注射多糖水凝胶可在加速创面愈合的基础上减少新生组织纤维化瘢痕的产生,改善伤口敷料的修复能力。
Description
技术领域
本发明属于多糖类生物材料及高分子化合物的组合物领域,涉及可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大、最外露、最脆弱的组织,在保持体温和提供有关外部环境的重要感官信息方面起着至关重要的作用。当皮肤组织出现损伤时,其修复过程会经历以下四个不同的阶段:止血、炎症、增殖以及重塑/熟化。由于大面积的伤口容易引发皮肤组织出现纤维化瘢痕增生,即功能性组织被非功能性疤痕组织所取代,因而目前这类伤口的修复仍然是一项艰巨的挑战。此外,纤维化瘢痕增生几乎是所有重要器官在损伤恢复过程中都会出现的现象。瘢痕的形成是皮肤损伤后纤维化的一种表现形式,代表了一种延迟的进化适应,主要是为了加快损伤愈合。瘢痕缺乏典型皮肤的固有特征,如毛发和腺体,因此瘢痕会导致皮肤的体温调节和屏障功能受损,从而对皮肤结构和功能的整体恢复带来不利影响。
透明质酸(hyaluronan, HA)是由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺单元交替通过β-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键连接在一起的非硫酸化的线性阴离子多糖,是皮肤、软骨和玻璃体细胞外基质的重要成分,HA含有多个可与细胞表面受体结合的抗原,如RHAMM、CD44、CD168等,在细胞迁移、细胞信号传导、血管生成、伤口愈合等多个细胞进程中发挥着不可替代的作用。HA具有优异的组织相容性、吸水性、抗炎活性以及低免疫原性,易化学修饰且可在体内生物降解,但存在着细胞黏附性差,降解快、力学性能弱等缺点,这些缺点限制了HA在实际中的应用。针对上述问题,可在制备HA水凝胶这类多糖水凝胶时,通过采用不同的交联方式、通过化学修饰或者复合其它材料的方式来优化HA的性能。
胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的另一种重要成分,也是皮肤组织的重要组成部分。其中,III型胶原蛋白(Col III)是皮肤细胞外基质中含量第二多的胶原蛋白,为皮肤提供弹性和支撑力。现有研究表明,Col III在胶原纤维的合成过程中起着至关重要的作用,它能加速胶原纤维的形成并调节其结构和功能特性。因此,Col III被认为是皮肤组织再生的有效候选生物材料之一。然而,大多数胶原蛋白都来自于动物,在应用时可能会导致免疫原反应,并且不同批次的产品的性能也难以达到高度一致。相对而言,通过真菌发酵在微生物中进行基因工程生产的携带人类基因的重组III型人源化胶原蛋白(rhCol III),在结构和功能上与内源性胶原蛋白更加相似。这不但有利于降低了免疫原性反应的风险,而且可以提高批次之间产品性能的稳定性,还适合大规模生产。
现有技术中,有将rhCol III用戊二醛交联,使戊二醛的醛基通过与胶原的氨基酸残基反应形成交联结构,进而使rhCol III形成凝胶,最终制备得到多孔支架材料的报道。也有利用1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)将rhCol III交联,通过BDDE的环氧基团在碱性条件下形成醚键连接的交联结构的报道。但上述方法仍然存在一些问题:一方面,交联制备的多孔支架材料呈固态,用于皮肤修复时,固态的支架材料难以与伤口部位良好贴合,特别是应用于复杂形状的伤口时,更是难以全方位地覆盖和贴合复杂形状伤口,在应用于伤口修复时具有较大的局限性;另一方面,交联剂的残留会导致一定程度的细胞毒性,进而影响材料的生物活性,对于伤口愈合的促进效果还有待提高;再一方面,交联过程需要碱性环境或在提高反应温度的条件下长时间进行,应用不够便捷。因此,如何有效结合rhCol III和HA在皮肤修复伤口愈合等方面的特点,在满足生物降解性能的基础上,提供可促进伤口愈合并能有效减轻纤维化瘢痕增生、无生物毒性,并且对不规则伤口适用性良好的伤口敷料,在皮肤修复材料领域仍然是一项很大的挑战,也是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶及其制备方法,以在加速创面愈合的基础上减少新生组织纤维化瘢痕的产生,改善伤口敷料的修复能力。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,该可注射多糖水凝胶是由交联的改性重组III型人源化胶原蛋白和交联的巯基化透明质酸组成的水凝胶,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联反应形成,所述交联的巯基化透明质酸由巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下自交联形成,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸形成了互穿的双交联网络结构;该可注射多糖水凝胶中,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸的质量比为(10~20):1。
上述技术方案中,所述可注射多糖水凝胶中,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白的含量优选为100~225 mg/mL,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白的含量进一步优选为150~200 mg/mL,交联的巯基化透明质酸的含量优选为10~20 mg/mL。
上述技术方案中,所述具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白中,光交联基团的接枝率优选为65%~100%。
进一步地,上述技术方案中,可行的具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白包括甲基丙烯酸酐改性的重组III型人源化胶原蛋白。具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白参照现有技术进行制备即可。
甲基丙烯酸酐改性的重组III型人源化胶原蛋白是由甲基丙烯酸酐与重组III型人源化胶原蛋白的氨基通过酰化反应形成的,反应后甲基丙烯酸酐占据了重组III型人源化胶原蛋白上大部分的氨基官能团位点。一种可行的甲基丙烯酸酐改性的重组III型人源化胶原蛋白的制备方法如下:
上述技术方案中,所述巯基化透明质酸中,巯基的接枝率优选为10%~40%,优选的巯基化透明质酸的结构如式(I)所示,巯基化透明质酸中的巯基官能团可介导分子间的共价偶联,巯基可以使透明质酸与其他含有巯基的化合物或生物分子反应,形成共价连接,
(I)。
巯基化透明质酸参照现有技术进行制备即可,一种可行的巯基化透明质酸的制备方法为:
将透明质酸用水溶液溶解,向所得透明质酸溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺,调节所得混合液的pH至4.75~5,活化1~3 h,加入半胱胺酸盐酸盐,搅拌反应12~24 h;透析去除未反应的原料,干燥,即得。在制备巯基化透明质酸的过程中,通过调整透明质酸与N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的比例关系,以及透明质酸的分子量,可以调整巯基化透明质酸中的巯基接枝率。
上述技术方案中,所述交联的巯基化透明质酸由巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下,通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成。
上述技术方案中,所述可注射多糖水凝胶由含有具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白、巯基化透明质酸和光引发剂的凝胶前驱液经光引发交联形成,所述凝胶前驱液的pH值为7.2~7.8,在光引发交联的同时凝胶前驱液会发生自交联反应。优选地,所述凝胶前驱液中,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白的浓度为100~225 mg/mL,巯基化透明质酸的浓度为10~20 mg/mL。进一步优选地,所述凝胶前驱液中,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白的浓度为150~200 mg/mL,巯基化透明质酸的浓度为10~20mg/mL。
本发明还提供了一种上述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
将具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白、巯基化透明质酸和光引发剂溶于水中,充分混合均匀并调节pH值至7.2~7.8,得到凝胶前驱液,施加光照条件引发具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白发生交联反应,同时巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下自交联,待凝胶前驱液转变为凝胶状态,即得可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶。
上述制备方法的技术方案中,所述凝胶前驱液中,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白的浓度优选为100~225 mg/mL,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白的浓度进一步优选为150~200 mg/mL,巯基化透明质酸的浓度优选为10~20 mg/mL。
上述制备方法的技术方案中,所述凝胶前驱液中,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白与巯基化透明质酸的质量比优选为(10~20):1。
上述制备方法的技术方案中,所述凝胶前驱液中,光引发剂的浓度为0.5 wt%~2wt%。进一步地,可行的光引发剂可以是能用蓝光引发交联反应的光引发剂,例如可以是苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP),但可行的光引发剂并不局限于LAP,具体可根据实际应用需求进行选择。
本发明所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶具有优异的促进皮肤伤口愈合、减轻纤维化瘢痕和抗氧化能力以及良好的生物相容性,且在体内可降解。本发明对该可注射多糖水凝胶进行了理化性质表征,体外细胞增殖与迁移实验,成血管实验,溶血实验,动物全层缺损皮肤修复实验以及减轻纤维化瘢痕实验,结果表明:
(1)理化实验表明:该可注射多糖水凝胶具有呈三维网络结构的高分子网络,冷冻干燥后具有相互贯通的多孔结构;该可注射多糖水凝胶具有良好的力学性能,储能模量最大可达25 KPa;该可注射多糖水凝胶具有良好的吸水能力,能在3 h内达到最大溶胀程度的85%以上,具有较好的平衡溶胀性能,这有利于对血液、渗出液等的快速吸收以及在伤口部位维持稳定的形态;该可注射多糖水凝胶还具有优异的体内降解性能,在PBS缓冲液环境下7天可降解约50%~60%,有利于适应不规则伤口在变形、恢复过程中的变化。
(2)体外细胞增殖实验表明:该可注射多糖水凝胶具有优异的生物相容性,与共培养的第1天相比,在共培养的第7天,细胞的增殖程度可以达到共培养第1天的8倍以上。
(3)体外细胞迁移实验表明:该可注射多糖水凝胶具有优异的促细胞迁移能力,24h后最高可以实现约85%的细胞迁移率。
(4)溶血实验表明:该可注射多糖水凝胶具有优异的血液相容性,溶血率低于0.007%。溶血率低于国际标准化组织(ISO)10993-4规定的溶血率阈值2%。
(5)动物皮肤修复实验表明:该可注射多糖水凝胶具有优异的促进皮肤愈合的能力,对大鼠全层皮肤缺损进行修复时,在修复的第5天,伤口面积可减小至原伤口面积的约27.3%,而此时采用现有敷料的3M组的伤口面积约为原伤口面积的75.6%。
(6)减轻纤维化瘢痕实验表明:该可注射多糖水凝胶具有促进胶原沉积,提高创面位置的I型胶原与III胶原比例的能力,对大鼠全层皮肤缺损修复13天,创面位置的I型胶原与III胶原比例达到了16.32%,该比例接近天然无瘢痕组织的I型胶原与III胶原比例(25.2%)而此时采用现有敷料的3M组的创面位置I型胶原与III胶原比例仅为2.2%。
(7)细胞实验表明:与未引入交联的巯基化透明质酸的交联的改性重组III型人源化胶原蛋白水凝胶相比,所述可注射多糖水凝胶具有更好的生物相容性,以及更优异的促细胞迁移能力和成血管能力。
基于以上实验结果,本发明所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶可以作为创面修复材料、减轻纤维化瘢痕材料、抗氧化材料、负载细胞、药物或其他生物活性物质的医用材料应用。
本发明还提供了上述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶在创面修复中的应用,应用时,将含有具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白、巯基化透明质酸和光引发剂的凝胶前驱液注射至待修复的创面处,在施加光照(例如蓝光照射)使凝胶前驱液转变成凝胶状态将待修复的创面处完全覆盖,形成的水凝胶即可在待修复的创面处发挥创面修复作用。所述待修复的创面可以是待修复的皮肤创面。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果:
1.本发明提供了一种可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,该可注射多糖水凝胶是由交联的改性重组III型人源化胶原蛋白和交联的巯基化透明质酸组成的水凝胶,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸形成了互穿的双交联网络结构。本发明通过引入巯基化透明质酸,一方面可以缓解以重组III型人源化胶原蛋白为基础的皮肤修复材料降解过快的问题,另一方面可以提高单独的重组III型人源化胶原蛋白基皮肤修复材料的生物相容性、促细胞迁移能力和成血管能力,有效改善了现有重组胶原基皮肤修复材料在创面修复时存在的容易引起纤维化瘢痕的问题。
2.本发明提供的可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶中,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白和交联的巯基化透明质酸共同形成了互穿双网络结构,二者的相互配合可增加水凝胶中交联的重组III型人源化胶原蛋白的稳定性,有利于改性重组III型人源化胶原蛋白更长效地发挥促进与创面愈合相关细胞的生长、促进巨噬细胞产生有利于创面愈合的活性因子,促进皮肤创伤组织的微血管再生等作用,为皮肤细胞的生长提供更长效的有利环境;同时,交联的巯基化透明质酸的引入还增强了材料的促细胞迁移能力和成血管能力。这些因素的综合作用使得本发明的可注射多糖水凝胶具有优异的创面修复能力。
3.本发明提供的可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,通过对重组III型人源化胶原蛋白进行改性赋予了其光固化特性,在应用时,可先将凝胶前驱液体注射至待修复的创面部位,再施加适当的光照条件让凝胶前驱液凝胶化,这样可有效拓宽该多糖水凝对不同形态的创面的适用性,特别是可以适用于复杂的不规则伤口的修复,可有效解决现有固态皮肤修复材料难以有效贴合伤口和难以适用于不规则伤口修复的问题。
附图说明
图1是实施例1制备的rhCol III-MA与采用的原料rhCol III的傅里叶红外光谱。
图2是实施例1制备的rhCol III-MA与采用的原料rhCol III的核磁共振氢谱。
图3是实施例2制备的HA-SH与采用的原料HA的傅里叶红外光谱。
图4是实施例2制备的HA-SH与采用的原料HA的核磁共振氢谱。
图5是各水凝胶在冷冻干燥后的扫描电镜图。
图6是各水凝胶在冷冻干燥后的溶胀曲线。
图7的(A)(B)两图分别是各水凝胶的储能模量和损耗模量测试结果。
图8是各水凝胶的降解曲线。
图9是各水凝胶的蛋白质浓度测定结果。
图10是各水凝胶的抗ROS情况测试结果,其中,(A)图为ROS荧光图像,(B)图为荧光强度定量测试结果。
图11是细胞在各水凝胶中的增殖情况。
图12是细胞在各水凝胶中培养不同时间后的激光共聚焦扫描电镜图。
图13是对各水凝胶和商用明胶进行溶血实验的测试结果。
图14是细胞划痕实验测试结果,其中,(A)图是倒置显微镜观察结果,(B)图是迁移率计算结果。
图15是细胞成血管实验测试结果,其中,(A)图是激光共聚焦显微镜观察结果,(B)图是成血管面积率计算结果。
图16是rhCol III-HS1和rhCol III-MA1的细胞增殖情况、细胞迁移和成血管能力测试结果,其中,(A)图是培养3天后的激光共聚焦扫描显微镜观察结果,(B)图是培养3天后的细胞增殖情况测试结果,(C)图是倒置显微镜观察结果,(D)图是迁移率计算结果,(E)图是激光共聚焦显微镜观察结果,(F)图是成血管面积率计算结果。
图17是大鼠全层皮肤缺损修复实验的测试结果,其中的(A)(B)(C)图分别为伤口大体观图、伤口愈合过程中的形态和面积变化情况以及伤口愈合率计算结果。
图18是Masson染色结果。
图19是天狼星红染色结果。
图20是羟脯氨酸测定结果。
图21是I型胶原与III型胶原的比例(I/III胶原比例)的测定结果。
图22的(A)(B)(C)(D)图分别是TGFB1、COL1A1、COLXIA1、ACTA2基因表达测定结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶及其制备方法作进一步说明。有必要指出,以下实施例只用于对本发明作进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施,仍属于本发明的保护范围。下述各实施例中采用的青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供,ROS试剂盒由碧云天公司提供。
实施例1
本实施例中,制备甲基丙烯酸酐改性的重组III型人源化胶原蛋白(rhCol III-MA),步骤如下:
(1)将重组III型人源化胶原蛋白(rhCol III)加入Na2CO3-NaHCO3缓冲液中,并在室温下搅拌至溶液澄清透明,得到rhCol III溶液。将甲基丙烯酸酐(MA)加入rhCol III溶液中,在搅拌条件下于在40 ℃反应4 h。
该步骤中,所述Na2CO3-NaHCO3缓冲液,其中Na2CO3的浓度为8 mg/mL、NaHCO3的浓度为14.7 mg/mL;rhCol III溶液的浓度为130 mg/mL,rhCol III溶液与MA的体积比为30:1。
(2)将步骤(1)所得反应液转入2000 Da的透析袋中,在超纯水下透析72 h,透析过程中频繁更换超纯水,透析结束后将所得产物冷冻干燥,得到rhCol III-MA。
本实施例制备的rhCol III-MA与采用的原料rhCol III的傅里叶红外光谱及核磁共振氢谱如图1~2所示,由图1可知:相比于原料rhCol III,rhCol III-MA显示了不同的信号,包括酰胺I带在1627 cm−1处的C=O拉伸振动,酰胺II带在1542 cm−1处的N-H变形振动,以及在1053 cm−1处的C=C-H的平面弯曲振动。由此可见,这证实了酰胺化反应的发生,成功地引入了C=C双键,MA的C=C、C=O被成功地修饰在了rhCol III的分子链上。由图2可知,rhColIII-MA在5~6 ppm处出现了新的特征峰,判断其为双键特征峰,说明MA成功枝接在了rhColIII上。基于核磁共振氢谱计算本实施例制备的rhCol III-MA中的MA的接枝率,约为67%。在实际应用中,通过调整rhCol III与MA的比例关系,可以调整rhCol III-MA中的MA的接枝率在65%~100%之间。rhCol III-MA的结构如下式所示:
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实施例2
本实施例中,制备巯基化透明质酸(HA-SH),步骤如下:
(1)将透明质酸(HA)加入去离子水中,在室温下搅拌至HA完全溶解,得到HA浓度为4 mg/mL的HA溶液。然后将N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶解于HA溶液中,得到第一混合液;第一混合液中,NHS的浓度为575 mg/mL,EDC的浓度为2400 mg/mL。用0.1 mol/L的NaOH水溶液调节第一混合液的pH值至4.75,在冰浴条件下搅拌2 h。
(2)向经过步骤(2)处理的第一混合液加入半胱胺酸盐酸盐(CAS号:156-57-0)得到第二混合液,并搅拌反应12 h,第二混合液中,半胱胺酸盐酸盐浓度为1420 mg/mL。
(3)将步骤(2)所得反应液置于8000~12000 Da的透析袋中,用pH值为3.5的盐酸溶液透析72 h,透析结束后将所得产物冷冻干燥,得到HA-SH。
本实施例制备的HA-SH与采用的原料HA的傅里叶红外光谱以及核磁共振氢谱如图3~4所示,由图3可知,HA在1441 cm−1和1040 cm−1处的峰对应于C=O的对称拉伸和HA的C-O-C拉伸振动,HA-SH在1646 cm−1处的峰为羧酸盐C=O的特征峰。由图4可知,HA-SH在2.8 ppm处出现了新的特征峰,判断其为S-H特征峰,说明巯基成功枝接在了透明质酸上。基于核磁共振氢谱计算本实施例制备的HA-SH中的巯基的接枝率,约为20%。通过调整制备HA-SH时HA与半胱胺酸盐酸盐的比例关系以及HA的分子量,可以调整HA-SH中的巯基的接枝率在10%~40%之间。HA-SH的结构如下式所示:
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实施例3
本实施例中,制备可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,步骤如下:
(1)将实施例1制备的rhCol III-MA与实施例2制备的HA-SH溶解于超纯水中,充分混合均匀,然后加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)并充分混匀,除去其中的气泡,调节所得混合液的温度至37 ℃、pH值至7.4,得到凝胶前驱液,该凝胶前驱液中,LAP的浓度为0.5 wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为200 mg/mL和10 mg/mL。
(2)用蓝光(365 nm)照射凝胶前驱液,至凝胶前驱液固化,得到可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,记作rhCol III-HS1。
(3)按照步骤(1)~(2)同样的操作进行制备,不同之处仅在于:控制步骤(1)的凝胶前驱液中,LAP的浓度为0.5 wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为100 mg/mL和10 mg/mL,将制备得到的水凝胶记作rhCol III-HS2。
对比例1
本对比例中,制备纯胶原水凝胶(rhCol III-MA1),步骤如下:
(1)将实施例1制备的rhCol III-MA溶解于超纯水中,得到浓度为210 mg/mL的rhCol III-MA溶液。
(2)向步骤(1)所得rhCol III-MA溶液中加入光引发剂LAP并充分混匀,除去其中的气泡,调节所得混合液的温度至37 ℃、pH值至7.4,得到凝胶前驱液,该凝胶前驱液中光引发剂LAP的浓度为0.5 wt%。
(3)将步骤(2)所得凝胶前驱液经过蓝光(365 nm)照射固化,得到纯胶原水凝胶,记作rhCol III-MA1。
对比例2
本对比例的操作与实施例3的步骤(1)~(2)基本相同,不同之处仅在于:控制步骤(1)的凝胶前驱液中,LAP的浓度为0.5 wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为20 mg/mL和10 mg/mL,将制备得到的水凝记作rhCol III-HS3。
对比例3
(1)将rhCol III与实施例2制备的HA-SH溶解于超纯水中,充分混合均匀,然后加入光引发剂LAP并充分混匀,除去其中的气泡,调节所得混合液的温度至37 ℃、pH值至7.4,得到凝胶前驱液,该凝胶前驱液中,LAP的浓度为0.5 wt%,rhCol III与HA-SH的总浓度为210 mg/mL,rhCol III与HA-SH的浓度分别为200 mg/mL和10 mg/mL。
(2)用蓝光(365 nm)照射凝胶前驱液,至凝胶前驱液固化,将得到的水凝胶记作rhCol III-HS4。
实施例4
本实施例中,将rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4冷冻干燥,喷金处理后置于扫描电子显微镜下观察,结果如图5所示,由图5可知,四者在冷冻干燥后均具有三维网络结构和相互贯通的孔隙结构,但rhCol III-HS4在冷冻干燥后的孔结构与rhCol III-HS1、rhCol III-HS2和rhCol III-HS3在冷冻干燥后的孔结构有很大的不同,主要体现在孔尺寸具有较大差异上,相对而言,rhCol III-HS1、rhCol III-HS2和rhCol III-HS3在冷冻干燥后的孔结构和尺寸更有利于实现营养物质的快速渗透和细胞的生长。
实施例5
本实施例中,测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的溶胀率。
将rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4冷冻干燥,称重,浸没于超纯水中,置于室温吸水溶胀,每隔一段时间取出称重,计算溶胀率,溶胀率=(Wt-Wo)/Wo×100%,其中,Wo为置于超纯水之前(冷冻干燥之后)的重量,Wt为在超纯水中浸没一段时间后取出称重时的重量。
根据不同时间点的溶胀率绘制溶胀曲线,结果如图6所示,由图6可知,冷冻干燥之后的rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4在3 h的溶胀时间内均能基本达到平衡溶胀,这有利于对血液、渗出液等的快速吸收以及在伤口部位维持稳定的形态。rhCol III-HS4的溶胀率最大,说明通过引入光交联基团将rhCol III交联,可以抑制水凝胶的溶胀。
实施例6
本实施例中,测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的力学性能。
采用动态热机械分析法(DMA)测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的储能模量和损耗模量,结果如图7的(A)(B)两图所示。由图7可知,通过引入光交联基团将rhCol III交联可改善水凝胶的储能模量和损耗模量,但总体而言,这些水凝胶的力学性能均可满足作为伤口修复材料应用的需求。
实施例7
本实施例中,测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3、rhCol III-HS4的生物降解性能。
将rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4冷冻干燥,称重,浸没于pH=7.4的PBS缓冲液中,放置在20 ℃的恒温条件下进行降解,每隔一段时间取出,冷冻干燥后称重,计算质量保留率,质量保留率=Wt/Wo×100%,其中,Wo为置于PBS缓冲液之前的重量,Wt为降解一段时间后取出冷冻干燥后的重量。
根据不同时间点的质量保留率绘制降解曲线,结果如图8所示。由图8可知,rhColIII-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4均具有生物降解性能,相对于rhCol III-HS4,rhCol III-HS1、rhCol III-HS2和rhCol III-HS3的降解速度更慢,说明引入光交联基团将rhCol III交联可以延长rhCol III发挥作用的时效,这有利于组织的再生修复。
实施例8
本实施例中,对rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4进行蛋白质浓度测定。
将各水凝胶浸没在pH值为7.4的PBS缓冲液中24 h,然后吸出PBS缓冲液进行蛋白质浓度测定。按照说明使用贝奥天美生物公司的增强型BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白质浓度,绘制标准曲线计算蛋白质含量。
结果如图9所示,rhCol III-HS1、rhCol III-HS2和rhCol III-HS3在PBS缓冲液中稳定性良好,浸泡24 h后,PBS缓冲液中蛋白质的浓度分别为0.13、0.11和0.08 mg/mL。相比之下,rhCol III-HS4在PBS缓冲液中浸泡24 h后,PBS缓冲液中蛋白质的浓度高达14.7 mg/mL,表现出了明显的质量损失。这主要是由于在rhCol III-HS4中,rhCol III在HA-SH交联网络中呈不规则分布,这会导致rhCol III在膨胀和吸水后从水凝胶网络中迅速释放,因而在实际的修复中难以长时间发挥修复作用。
实施例9
本实施例中,测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的抗活性氧(ROS)性能。
分别将rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4与L929细胞用培养基共培养,使用24孔板,每孔种植1×104个L929细胞,培养12 h后,采用100 μmH2O2刺激细胞24 h,然后分别用水凝胶孵育24 h。所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液和胎牛血清得到的,DMEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1%,胎牛血清的质量浓度为10%。
采用ROS试剂盒分析ROS强度,评估各水凝胶抗ROS的能力,结果如图10所示,图10中,PC为阳性对照、NC为阴性对照,图10的(A)图为ROS荧光图像,图10的(B)图为荧光强度定量测试结果。由图10可知,rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4均具有一定的抗ROS效果,其中rhCol III-HS1的抗ROS性能最佳。
实施例10
本实施例中,测试rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的生物相容性。
将相同尺寸的rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4用紫外光照射灭菌。将L929细胞用胰酶消化,以每个水凝胶(rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4)样品加入5×103个L929细胞的密度共培养,加入培养基后置于培养箱中在37 ℃、5%的CO2的条件下培养,培养期间,每隔一天更换一次培养基。
所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液和胎牛血清得到的,DMEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1%,胎牛血清的质量浓度为10%。
培养1、3、7天后取出各水凝胶,使用CCK-8法测试各凝胶中细胞增殖的情况,结果如图11所示。培养1、3、7天后,取出各水凝胶,用PBS缓冲液清洗细胞2遍,对清洗后的细胞用含有二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)的PBS溶液中染色约1 min,通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细胞的生长状态和分布情况,结果如图12所示。
由图11、12可知,L929细胞在各水凝胶中的生长情况良好,尤其是在rhCol III-HS1中的增殖更快,增殖更加明显,且未出现团聚生长的现象,说明rhCol III-HS1的细胞相容性较rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的细胞相容性更好,即当rhColIII-MA与HA-SH的质量比适当时,可有效促进细胞在水凝胶上的铺展和增殖。
实施例11
本实施例中,对rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4和商用明胶(Gel)进行溶血实验。
用肝素涂层试管收集健康兔子的新鲜血液,然后离心分离出红细胞(RBC)。用组织破碎机分别将rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4和商用明胶破碎,并用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释到所需浓度。分别将稀释后的rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4和商用明胶与等体积的RBC在37 ℃混合1h。离心后收集上清液(其吸光度表示为A),在540 nm波长处测量其吸光度。阴性对照(其吸光度表示为An)和阳性对照(其吸光度表示为Ap)样品分别用pH值为7.4的PBS缓冲液和0.1%的Triton-X100溶液制备。溶血率的计算公式为:溶血率(%)=(A - An)/(Ap - An)×100%。
溶血实验的结果如图13所示,由图可知,所有实验组的溶血率都保持在0.007%以下,远低于国际标准化组织(ISO)10993-4规定的2 %的溶血率阈值。
实施例12
本实施例中,对rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4进行细胞划痕实验。
用无血清的培养基培养,在24孔板中每孔种植2×105个L929细胞,培养12 h后,用无菌移液管头处理创面,PBS缓冲液冲洗3次,然后分别用水凝胶(rhCol III-HS1、rhColIII-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4)孵育。以未添加水凝胶的情况作为对照(Control)。分别于孵育0 h和24 h后在倒置显微镜下对细胞进行拍照,计算迁移率,以迁移率来反应创面愈合率,迁移率 = (A0-A24)/A0×100%,其中A0为孵育0 h时的创面面积,A24为孵育24 h后的创面面积。结果如图14所示,其中的(A)(B)两图分别为倒置显微镜观察结果和迁移率计算结果。
由图14可知,rhCol III-HS1的创面恢复效果明显更好,说明当rhCol III-MA与HA-SH的质量比适当时,可以有效促进创面愈合。
实施例13
本实施例中,对rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4进行HUVECs细胞成血管实验。
将相同尺寸的rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4用紫外光照射灭菌,将HUVECs细胞用胰酶消化,使用基质胶铺满孔板底部,以每个水凝胶(rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4)样品加入3×104个HUVECs细胞的密度加入细胞,置于培养箱中在37 ℃、5%的CO2的条件下培养。以未添加水凝胶的情况作为对照(Control)。6 h后进行FDA染色后采用激光共聚焦显微镜观察结果,采用Image J计算成血管面积率(在图中用血管面积(%)表示),结果如图15的(A)(B)两图所示。
由图15可知,rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3和rhCol III-HS4的成血管效果显著优于对照组,并且rhCol III-HS1的成血管能力优于rhCol III-HS2、rhColIII-HS3和rhCol III-HS4。
实施例14
本实施例中,测试实施例3制备的rhCol III-HS1和对比例1制备的rhCol III-MA1的细胞增殖情况、细胞迁移和成血管能力。
1.将相同尺寸的rhCol III-HS1和rhCol III-MA1用紫外光照射灭菌,将L929细胞用胰酶消化,以每个水凝胶(rhCol III-HS1和rhCol III-MA1)样品加入5×103个L929细胞的密度共培养,之后补充培养基,置于培养箱中在37 ℃、5%的CO2的条件下培养,培养期间,每隔一天更换一次培养基。
所述培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液和胎牛血清得到的,DMEM培养基中青霉素和链霉素混合液的质量浓度为1%,胎牛血清的质量浓度为10%。
培养1、3、7天后,取出各水凝胶,用PBS缓冲液清洗细胞2遍,对清洗后的细胞用含有FDA和PI的PBS溶液中染色约1 min,通过激光共聚焦扫描显微镜观察细胞的生长状态和分布情况,其中培养3天后的结果如图16的(A)图所示。培养1、3、7天后取出各水凝胶,使用CCK-8法测试各凝胶中细胞增殖的情况,其中培养3天后的结果如图16的(B)图所示。
2.用无血清的培养基培养,使用24孔板,每孔种植2×105个L929细胞,培养12 h后,用无菌移液管头处理创面,PBS缓冲液冲洗3次,然后分别用水凝胶(rhCol III-HS1和rhCol III-MA1)孵育。分别于孵育0 h和24 h后在倒置显微镜下对细胞进行拍照,计算迁移率,以迁移率来反应创面愈合率。图16的(C)(D)两图分别为倒置显微镜观察结果和迁移率计算结果。
3.将相同尺寸的rhCol III-HS1和rhCol III-MA1用紫外光照射灭菌,将HUVECs细胞用胰酶消化,使用基质胶铺满孔板底部,以每个水凝胶(rhCol III-HS1和rhCol III-MA1)样品加入3×104个HUVECs细胞的密度加入细胞,置于培养箱中在37 ℃、5%的CO2的条件下培养。6 h后进行FDA染色后采用激光共聚焦显微镜观察结果,采用Image J计算成血管面积率(在图中用血管面积(%)表示),结果如图16的(E)(F)两图所示。
由图16可知,相对于rhCol III-MA1,L929细胞在rhCol III-HS1中的增殖速度更快,增殖更加明显,二者的增殖速度具有显著差异。相对于rhCol III-MA1,rhCol III-HS1的创面愈合率明显更好。相对于rhCol III-MA1,rhCol III-HS1的成血管能力明显优于rhCol III-MA1,成血管面积率明显更高。由以上实验结果可知,在rhCol III-MA1的基础上引入HA-SH可以有效促进细胞的增殖,并有效促进细胞的迁移,进而有利于促进创面愈合,还能有效改善前者的成血管能力,这对于促进创面愈合是十分有利的。
实施例15
本实施例中,测试和比较rhCol III-HS1、rhCol III-HS2、rhCol III-HS3、rhColIII-HS4,以及现有的商用3M™Tegaderm™透明敷料作为皮肤修复材料的应用效果。
采用雄性SD大鼠(5~6周龄)。大鼠在手术前被饲养一周以适应环境,所有手术器械都经过高温高压灭菌处理。将大鼠随机分为5组,即rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhCol III-HS4组和商用3M™Tegaderm™透明敷料组(简称3M组)。
手术时先用异氟烷麻醉大鼠并将其背部朝上固定在手术台上,将大鼠背部备毛干净,用穿孔器在其背部的两侧各造直径为10 mm的圆形全层皮肤缺损。将用于制备rhColIII-HS1的凝胶前驱液滴加在rhCol III-HS1组大鼠的伤口处,将用于制备rhCol III-HS2的凝胶前驱液滴加在rhCol III-HS2组大鼠的伤口处,将用于制备rhCol III-HS3的凝胶前驱液滴加在rhCol III-HS3组大鼠的伤口处,将用于制备rhCol III-HS4的凝胶前驱液滴加在rhCol III-HS4组的大鼠伤口处。3M组不向大鼠伤口处滴入任何材料。使用蓝光手电照射各组大鼠伤口处30 s,之后用3M敷料绕各组大鼠的腰腹部一圈固定。术后将大鼠饲养在适宜的环境中,在第0、5、9、和13天牺牲大鼠,记录大鼠皮肤在第0、5、9、13天时伤口大体观和面积,并计算伤口修复率。rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhColIII-HS4组和3M组在每个时间点同时进行3个缺损实验。
本实施例的测试结果如图17所示,其中的(A)(B)(C)图分别为伤口大体观图、伤口愈合过程中的形态和面积变化情况以及伤口愈合率(治疗后伤口面积/初始面积×100%)计算结果。由图17可知,在第5天,rhCol III-HS1组的创面面积仅为原伤口面积的约27.3%,3M组的创面面积为原伤口面积的约75.6%,rhCol III-HS2组的创面面积仅为原伤口面积的约37%,rhCol III-HS3组的创面面积为原伤口面积的约48.7%,rhCol III-HS4组的创面面积为原伤口面积的约35%。说明rhCol III-HS1组加速伤口愈合的能力最佳。
实施例16
本实施例中,取实施例15中的rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhCol III-HS4组和3M组创面处的组织样品进行胶原检测实验。
将实施例15中rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhColIII-HS4组和3M组的大鼠牺牲,取伤口处的组织进行组织切片、脱蜡复水,之后分别进行Masson染色、天狼星红染色和羟脯氨酸测定。以正常SD大鼠背部皮肤组织(天然样品组织)作为对照(Nature)。Masson染色和天狼星红染色结果分别如图18和19所示,羟脯氨酸测定结果如图20所示,I型胶原与III型胶原的比例(I/III胶原比例)的测定结果如图21所示。
由图18~21可知,rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhColIII-HS4组的胶原沉积均大于3M组,其中rhCol III-HS1组的I/III胶原比例更接近天然样品组织,且远远高于3M组,说明rhCol III-HS1在促进胶原沉积的同时改善了新生成的胶原的比例,同时未造成胶原的过度沉积,可以避免胶原的过渡沉积而引发的瘢痕产生。
实施例17
本实施例中,取实施例15中的rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhCol III-HS4组和3M组的组织样品进行PCR检测实验。
将实施例15中rhCol III-HS1组、rhCol III-HS2组、rhCol III-HS3组、rhColIII-HS4组和3M组的大鼠牺牲,取伤口处的组织提取RNA,分别进行ACTA2、TGFB1、COL1A1、COLXIA1基因表达测定,结果如图22所示。
图22的(A)(B)(C)(D)图分别为TGFB1、COL1A1、COLXIA1、ACTA2基因的表达情况。由图22可知,rhCol III-HS1组的TGFB1基因表达最高,TGFB1基因表达的升高有助于伤口的早期愈合,加快随后的组织修复,还有利于促进血管的逐步生长。同时,伤口愈合过程会引起基质力学的改变,这归因于组织过度收缩导致硬度增加,进而诱发细胞纤维化。这种现象会增加伤口附近的机械张力,导致成纤维细胞过度增殖。而现有研究表明,ACTA2基因可能在组织过度收缩中起着关键作用,ACTA2基因的过度表达可诱导基质因长时间或极端的细胞收缩而***,导致萎缩和硬度增加,最终形成过度的疤痕组织。这种网络在吸收伤口附近的液体后可增强抗肿胀能力,确保在伤口愈合过程中逐渐稳定降解,它还能缓解因伤口组织压缩而导致的伤口周围机械张力的增加。由图22可知,rhCol III-HS1组的ACTA2基因表达下调,ACTA2基因的表达量最低,这有助于防止组织过度收缩,进而促进无疤痕皮肤愈合。
实施例18
本实施例中,制备可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,操作与实施例3的步骤(1)~(2)基本相同,不同之处仅在于:控制步骤(1)的凝胶前驱液中,LAP的浓度为1wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为225 mg/mL和15 mg/mL。
实施例19
本实施例中,制备可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,操作与实施例3的步骤(1)~(2)基本相同,不同之处仅在于:控制步骤(1)的凝胶前驱液中,LAP的浓度为2wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为150 mg/mL和12 mg/mL。
实施例20
本实施例中,制备可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,操作与实施例3的步骤(1)~(2)基本相同,不同之处仅在于:控制步骤(1)的凝胶前驱液中,LAP的浓度为0.5wt%,rhCol III-MA与HA-SH的浓度分别为200 mg/mL和20 mg/mL。
Claims (5)
1.可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,其特征在于,该可注射多糖水凝胶是由交联的改性重组III型人源化胶原蛋白和交联的巯基化透明质酸组成的水凝胶,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白由具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白经光引发交联反应形成,所述交联的巯基化透明质酸由巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下自交联形成,所述交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸形成了互穿的双交联网络结构;该可注射多糖水凝胶中,交联的改性重组III型人源化胶原蛋白与交联的巯基化透明质酸的质量比为(10~20):1;交联的改性重组III型人源化胶原蛋白的含量为100~225 mg/mL,交联的巯基化透明质酸的含量为10~20 mg/mL;
所述具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白中,光交联基团的接枝率为65%~100%;所述巯基化透明质酸中,巯基的接枝率为10%~40%,巯基化透明质酸的结构如式(I)所示,
(I)
该可注射多糖水凝胶由含有具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白、巯基化透明质酸和光引发剂的凝胶前驱液经光引发交联形成,所述凝胶前驱液的pH值为7.2~7.8。
2.根据权利要求1所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶,其特征在于,所述具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白为甲基丙烯酸酐改性的重组III型人源化胶原蛋白。
3.权利要求1或2所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白、巯基化透明质酸和光引发剂溶于水中,充分混合均匀并调节pH值至7.2~7.8,得到凝胶前驱液,施加光照条件引发具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白发生交联反应,同时巯基化透明质酸在pH值为7.2~7.8的条件下自交联,待凝胶前驱液转变为凝胶状态,即得可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶。
4.根据权利要求3所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶的制备方法,其特征在于,凝胶前驱液中,具有光交联基团的重组III型人源化胶原蛋白的浓度为100~225mg/mL,巯基化透明质酸的浓度为10~20 mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述可减少纤维化瘢痕产生的可注射多糖水凝胶的制备方法,其特征在于,凝胶前驱液中,光引发剂的浓度为0.5 wt%~2 wt%。
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