CN112321778B - 一种双蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法，属于医用生物材料技术领域。本发明将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化丝胶蛋白和蓝光引发剂溶于水中，再使用蓝光进行照射，即得双蛋白水凝胶。本发明能通过调节反应液中甲基丙烯酸化明胶和甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度和配比来调节所得双蛋白水凝胶的结构、机械性能、水凝胶特性和降解性，且所得双蛋白水凝胶具有良好的生物性相容性，能够支持干细胞的粘附，用于负载细胞时具有较高的细胞封装率和细胞释放能力，释放的细胞能够保持较高的生物活性，体外释放干细胞长达7天以上，适合于生物医学、组织工程等领域。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种双蛋白水凝胶的制备方法。
背景技术
干细胞由于其多能性、释放生长因子的能力和调节炎症的能力，在治疗多种损伤和疾病方面显示出巨大的潜力。直接将细胞输送到损伤部位并造成最小侵袭的局部注射是通常的输送策略。局部注射是干细胞治疗的主要原因之一。然而，注射方法的低细胞植入效率极大地限制了干细胞疗法的临床推广。细胞保留率低的主要原因之一是缺乏3D基质来支持移植细胞的存活、迁移和发育。
为了解决这个问题，人们已经开发了多种可注射水凝胶***，它们可以提供机械保护，以防止在注射过程中细胞膜被破坏，并在注射后形成稳定的网络，从而促进细胞粘附和生长。然而，目前许多可用的可注射水凝胶存在机械性能差、细胞存活率低或无法精确控制凝胶和水凝胶特性的问题。据广泛报道，天然细胞外基质(ECM)环境通过一系列复杂的物理、机械和生化信号，在影响细胞反应和指导干细胞命运方面发挥着关键作用。因此，为了进一步了解ECM对细胞行为的调控，设计具有精确可调结构、力学性能、生物降解性和细胞相互作用的新材料一直是一项具有挑战性的工作。为此，我们的目标是设计一种可注射的水凝胶平台，允许在生理条件下自发快速凝胶化，并易于控制水凝胶生态位，以适应细胞培养和组织工程应用的不同要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种双蛋白水凝胶的制备方法，不但可以精确调节双蛋白水凝胶的结构、机械性能、水凝胶特性和降解性，而且所得双蛋白水凝胶具有良好的生物性相容性和细胞封装能力，将其用于封装细胞时，细胞存活率高、生长状态好。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将甲基丙烯酸化明胶(即甲基丙烯酰基取代的明胶)、甲基丙烯酸化丝胶蛋白(即甲基丙烯酰基取代的丝胶蛋白)和光引发剂溶于水中，得到溶液，使用波长356～405nm的光对所述溶液进行照射，得到凝胶，即得双蛋白水凝胶；其中，所述溶液中，甲基丙烯酸化明胶的浓度为5～15％，甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度为3～9％，光引发剂的浓度为0.01～0.5％。
本文中，溶液中甲基丙烯酸化明胶的浓度、甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度以及光引发剂的浓度均按如下公式计算而得：
溶质浓度＝溶液中溶质的质量/溶液体积×100％，其中溶液中溶质的质量单位为g，溶液体积的单位为mL。
明胶是胶原的衍生物，因具有良好的胶凝性、生物相容性和生物降解性而经常被用在水凝胶中，然而，基于明胶的水凝胶的机械性能很差，特别是在热稳定性方面，这些问题可以通过明胶的化学或物理交联来克服；丝胶蛋白是天然蚕丝中的一种主要成分，具有较好的水溶性，同时丝胶蛋白的生物相容性能优越，可以促进细胞粘附和增殖，还可以抗氧化和抑制酪氨酸酶活性，这些优点使丝胶蛋白在组织工程和再生医学领域逐渐成为新型天然材料的研究热点。
上述制备方法采用光交联法制备水凝胶，并采用甲基丙烯酸化丝胶蛋白来丰富明胶水凝胶，形成的双蛋白水凝胶为双组分聚合物网络(IPN)水凝胶，具有独特的结构，允许两个独立的网络相互结合，从而在保持所需的原始聚合物性能的同时获得更好的力学性能。
上述制备方法能通过调节所述溶液中甲基丙烯酸化明胶和甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度和配比来调节所得双蛋白水凝胶的结构、机械性能、水凝胶特性(如溶胀性)和降解性，且所得双蛋白水凝胶的结构类似于自然细胞质基质，具有良好的生物性相容性，能够支持干细胞的粘附，用于负载细胞(如脐带间充质干细胞UCMSCs)时具有较高的细胞封装率和细胞释放能力，释放的细胞能够保持较高的生物活性，适合于组织修复和疤痕愈合，如子宫疤痕修复。
优选地，所述溶液中，甲基丙烯酸化明胶的浓度为10％。
优选地，所述溶液中，甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度为6％。
优选地，所述溶液中，光引发剂的浓度为0.1％。
优选地，所述光的波长为405nm。如果所述凝胶要用于封装细胞，采用波长405nm的蓝光对细胞几乎无损伤，且对人体皮肤和眼睛损伤更小。而且相对于紫外光交联，蓝光固化对细胞的毒性更小，固化后细胞活性在90％以上。
优选地，所述光引发剂为LAP。在蓝光作用下，LAP能迅速引发光敏水凝胶材料固化。
优选地，照射时间为10～120s。进一步优选地，所述照射时间为30s。
优选地，在所述溶液中加入细胞后，再进行所述照射。这样得到的双蛋白水凝胶不只是单纯的水凝胶体系，内部还封装有细胞，具有生物活性，并且对细胞具有较高的封装率以及较好的释放能力，释放的细胞能够保持较高的生物活性，适合于将细胞输送到损伤组织，起到组织修复和疤痕愈合的作用，如子宫疤痕修复。
优选地，在所述溶液中加入细胞液后，再进行所述照射，其中所述细胞液与所述溶液的体积比为1：5-15。进一步优选地，所述细胞液与所述溶液的体积比为1：10。
优选地，所述细胞为脐带间充质干细胞。将脐带间充质干细胞封装在双蛋白水凝胶内部，实现了细胞在水凝胶内部存活和正常生长，克服了当前细胞封装存活率低或者细胞在水凝胶内部生长状态差的问题。
优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法包括以下步骤：将明胶溶解于水中后，加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后，装入截留分子量为3500的透析袋中，并用纯水进行透析，然后将截留液冻干，即得所述甲基丙烯酸化明胶。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，明胶与甲基丙烯酸酐的比例为明胶：甲基丙烯酸酐＝1g：0.2～1.0mL。进一步优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，明胶与甲基丙烯酸酐的比例为明胶：甲基丙烯酸酐＝1g：0.6mL。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，反应温度为常温，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，反应时间为6～16h。进一步优选地，反应时间为12h。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，透析时间为5-7日。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，冻干温度为-80℃。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，明胶按明胶：水＝10g：100mL的比例溶解于水中。
优选地，所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白的制备方法包括以下步骤：将蚕茧洗干净后烘干，用Na2CO3溶液浸泡蒸煮，去除固体杂质，得到丝胶溶液，向所述丝胶溶液中加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后，去除固体杂质，装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并用纯水进行透析，然后将截留液冻干，即得所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，所采用的Na2CO3溶液的浓度为0.1mol/L。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，所采用的Na2CO3溶液的体积与蚕茧的质量比为1000mL：20g。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，蒸煮时间为0.5h～2h。进一步优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，蒸煮时间为1h。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，蚕茧与甲基丙烯酸酐的比例为蚕茧：甲基丙烯酸酐＝20g：3～9mL。进一步优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，蚕茧与甲基丙烯酸酐的比例为蚕茧：甲基丙烯酸酐＝20g：6mL。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，反应温度为常温，反应时间为6～24h。进一步优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，反应时间为12h。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，反应在搅拌状态下进行。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，去除固体杂质的处理包括以下步骤：先在3000～10000r/min条件下离心10min，取上清液，再过滤。进一步优选离心转速为8000r/min。
优选地，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，透析处理为每隔3小时换一次水，共透析3-5天。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过调节反应液中甲基丙烯酸化明胶和甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度和配比来调节所得双蛋白水凝胶的结构、机械性能、水凝胶特性(如溶胀性)和降解性，且所得双蛋白水凝胶具有良好的生物性相容性，能够支持干细胞的粘附，用于负载细胞(如脐带间充质干细胞)时具有较高的细胞封装率和细胞释放能力，释放的细胞能够保持较高的生物活性，体外释放干细胞长达7天以上，适合于生物医学、组织工程等领域。
附图说明
图1为明胶(Gel)和甲基丙烯酸化明胶(GelMA，即改性明胶聚合物)的核磁氢谱图；
图2为丝胶蛋白(Ser)和甲基丙烯酸化丝胶蛋白(SerMA，即改性明丝胶蛋白聚合物)的核磁氢谱图；
图3为水凝胶的扫描电镜图，其中，图3-A1和图3-A2为对比例1所得水凝胶的扫描电镜图，图3-B1和图3-B2为是实施例5所得水凝胶的扫描电镜图；
图4为对比例1和实施例5所得水凝胶的降解性能图；
图5为空白对照组、对比例1和实施例5细胞存活率柱状图；
图6为对比例1和实施例5封装干细胞对应的细胞增殖效果柱状图；
图7为实施例5封装干细胞对应的体外细胞释放效果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法包括以下步骤：
(1)制备甲基丙烯酸化明胶(GelMA)
将10g明胶溶解在100mL去离子水中，加入6mL甲基丙烯酸酐，常温下反应12h，反应结束后装入截留分子量3500的透析袋中，用蒸馏水透析5-7日，然后将截留液在-80℃下冻干，即得甲基丙烯酸化明胶(GelMA)；
(2)制备甲基丙烯酸化丝胶蛋白(SerMA)
取20g蚕茧用去离子水洗涤将杂质冲洗干净，于25℃烘干，再用0.1mol/L Na2CO3溶液(1000mL)浸泡煮沸1h，每隔半小时取出煮沸后的溶液并通过神奇滤布过滤除去杂质，得到丝胶溶液；将甲基丙烯酸酐(6mL)用滴定管缓慢滴加到上述丝胶溶液中，室温搅拌12h后，在8000r/min下离心10min，取上清，再采用滤纸过滤除去杂质，之后装入透析袋(截留分子量8000-14000)中用蒸馏水透析3-5天，每隔3小时换一次水，最后冷冻干燥得到甲基丙烯酸化的丝胶(SerMA)；
(3)制备GelMA/SerMA复合水凝胶(即双蛋白水凝胶)
将步骤(1)制备的GelMA、步骤(2)制备的SerMA以及LAP光引发剂溶于去离子水中，得到反应原料溶液，用波长405nm、3W的蓝光对该溶液光照10s，即得GelMA/SerMA复合水凝胶，其中反应原料溶液中，GelMA的浓度为5％，SerMA的浓度为3％，LAP光引发剂的浓度为0.1％。
实施例2
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为5％，SerMA的浓度为6％外，其他均与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为5％，SerMA的浓度为9％外，其他均与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为10％，SerMA的浓度为3％外，其他均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为10％，SerMA的浓度为6％外，其他均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为10％，SerMA的浓度为9％外，其他均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为15％，SerMA的浓度为3％外，其他均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为15％，SerMA的浓度为6％外，其他均与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供了一种双蛋白水凝胶的制备方法。本实施例双蛋白水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA的浓度为15％，SerMA的浓度为9％外，其他均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供了一种水凝胶的制备方法。本对比例水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中不含SerMA外(自然也不包括实施例5中的步骤(2))，其他均与实施例5相同。
对比例2
本对比例提供了一种水凝胶的制备方法。本对比例水凝胶的制备方法除步骤(3)中所得反应原料溶液中不含GelMA外(自然也不包括实施例5中的步骤(1))，其他均与实施例5相同。
表1步骤(3)中所得反应原料溶液中GelMA和SerMA的浓度
| 组别 | GelMA浓度(％) | SerMA浓度(％) |
| 实施例1 | 5 | 3 |
| 实施例2 | 5 | 6 |
| 实施例3 | 5 | 9 |
| 实施例4 | 10 | 3 |
| 实施例5 | 10 | 6 |
| 实施例6 | 10 | 9 |
| 实施例7 | 15 | 3 |
| 实施例8 | 15 | 6 |
| 实施例9 | 15 | 9 |
| 对比例1 | 10 | 0 |
| 对比例2 | 0 | 6 |
效果例1：核磁测试
分别称取50mg实施例1中步骤(1)得到的甲基丙烯酸化明胶和和步骤(2)得到的甲基丙烯酸化丝胶蛋白，将样品分别溶解于适量的氘代重水，然后装入干净的核磁管中，利用核磁共振光谱仪在室温条件下进行核磁结构测定，并采用MestReNova软件进行图谱分析，结果见图1和图2。
从图1和图2核磁对比分析可知，修饰后的明胶和修饰后的丝胶蛋白中都有明显的双键特征峰(δ＝5.5和5.8ppm)，因此我们认为已经成功的制备了双键化的明胶和丝胶蛋白。
效果例2：扫描电镜测试
将对比例1和实施例5所得水凝胶分别冻干，水凝胶的表面真空喷金后扫描电镜拍照，加速电压为5kV，结果见图3。
从图3可知，对比例1(参见图3-A1和图3-A2，其中图3-A1放大500倍，图3-A2放大1000倍)和实施例5(参见图3-B1和图3-B2，其中图3-B1放大500倍，图3-B2放大1000倍)制备的水凝胶呈现三维多孔的网状结构，且与纯明胶水凝胶相比，GelMA/SerMA复合水凝胶的孔径减小，孔密度增大，说明SerMA的加入促进了水凝胶的致密化。
效果例3：溶胀性能测试
将各水凝胶浸泡于pH＝7.4的PBS溶液中，置于37℃培养箱中；在预设的时间点，取出样品，并将样品表面过多的水用滤纸吸除，再进行称重。然后按下面公式计算丝胶蛋白水凝胶的吸水膨胀率(结果见表2)：
其中，Ws为膨胀状态下的重量，单位为g；W0为水凝胶初始重量，单位为g。
表2实施例1～9和对比例1～2制备的水凝胶的溶胀率
由表2可知，本发明制得的GelMA/SerMA复合水凝胶具有很好的溶胀性能，并且该水凝胶的溶胀性能可通过控制光交联反应原料溶液(即步骤(3)中的反应原料溶液)中的GelMA和SerMA的浓度和配比进行调节。
效果例4：压缩性能测试
理想的水凝胶应具有良好的力学性能，以保持其使用时的方便性和完整性。对实施例1～9和对比例1～2制备的水凝胶进行力学性能测试，具体操作如下：将高度与切面直径均为8mm的圆柱形水凝胶样品置于万能材料试验测试仪测量平台上，调节上下平板使与水凝胶刚好接触而不受力，然后以1mm/min压缩速率压缩至水凝胶断裂停止测试。每个样品进行3个平行样测试，测量后进行统计分析比较。结果见表3。
表3实施例1～9和对比例1～2制备的水凝胶的压缩模量
效果例5：降解性能测试
将制备好的水凝胶样品分组，各组分别加入适量pH值＝7.4的PBS溶液中，然后将样品置于37℃培养箱中，每2天用新鲜的PBS溶液更换一次降解液。在不同的时间点，分别取出样品，为了消除水凝胶内的无机盐离子造成的干扰，样品取出后在超纯水中浸泡15min，重复三次，然后在烘箱内将水凝胶降解剩余部分干燥并称重记为Wt。降解速率计算公式如下：
其中，Wt单位为g；W0为水凝胶初始干重，单位为g。
在组织工程中，研究高分子水凝胶材料的降解性能对于组织的修复与再生有关键性的意义。降解太快，不能保证水凝胶结构的稳定性，组织修复的效果尚未达到；降解太慢，则会占据组织再生的空间，影响药物治疗与细胞生长的效果，不利于新组织的再生。图4表示的是水凝胶的降解行为对比曲线，从中可知甲基丙烯酸化丝胶蛋白(SerMA)的加入加快了水凝胶的降解行为，可能是由于甲基丙烯酸化丝胶蛋白中丝胶蛋白自身分子链断裂所致。因而，本研究制备的水凝胶可以通过改变GelMA和SerMA的配比来调节其降解行为。
效果例6：生物相容性检测
将500μL的液态水凝胶(即光交联反应原料溶液)分别滴加到12孔板内，使其铺展均匀，再用405nm、3W光源照10秒，使充分固化。后用DMEM/F12+GlutaMAX细胞培养基浸泡各10分钟后，每孔加入1.5x104个UCMSCs细胞，连续正常培养5天。分别在UCMSCs种植后第1天、第3天和第5天加入CCK-8工作液，在正常细胞培养条件下反应3h后测定OD450nm值，计算细胞存活率。
部分结果见图5，从中可知，实施例5水凝胶组在第1天的细胞存活率与对比例1水凝胶组相当，同时，第5天实施例5水凝胶的细胞存活率与对比例1水凝胶组基本相同，与空白组相比无显著性差异，说明GelMA/SerMA水凝胶具有良好的生物相容性，有利于UCMSCs的生长。
效果例7：细胞封装能力检测
为了测试该水凝胶的细胞封装能力，进行了细胞封装测试。在2mL液态水凝胶(即光交联反应原料溶液)中加入200μLUCMSCs细胞液(含1×106个细胞)，用405nm、3W光源照10秒，使充分固化，每孔加入250μL DMEM/F12+GlutaMAX细胞培养基。培养一定的时间后，孔板上的水凝胶用PBS溶液洗两次，取出其中负载细胞的凝胶，然后均匀地切碎。随后将混合物离心处理，留下上层清液，加入一定量的CCK-8试剂，后续操作与效果例6中一致。
部分结果见图6，从中可知，包裹在水凝胶中的UCMSCs在第1天到第5天具有较高的OD450nm值，表明该水凝胶有较高的细胞负载能力，同时也表明该水凝胶体系具有很低的生物毒性。
效果例7：细胞释放能力检测
由本发明水凝胶有望用于组织修复的细胞递送，进行了细胞输送试验。在2mL液态水凝胶(即光交联反应原料溶液)中加入200μLUCMSCs细胞液(含1×106个细胞)，用405nm、3W光源照10秒，使充分固化，每孔加入250μL DMEM/F12+GlutaMAX细胞培养基。培养一定的时间后，将每孔中的DMEM分别转移到新孔中，并在水凝胶孔中加入250μL DMEM/F12+GlutaMAX细胞培养基。在倒置荧光显微镜下观察后，用IPP 6.0软件计算转移液中的细胞数。分析1～7天释放的细胞数。部分结果见图7。
UCMSCs已被证明具有分化潜能，这在改善组织损伤功能方面很有前途。因此，发明人选择用UCMSCs来测试水凝胶的细胞输送能力。从图7可知，UCMSCs释放曲线呈累积递增单调趋势，提示这些水凝胶能为组织修复提供稳定的细胞供应。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种双蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化丝胶蛋白和光引发剂溶于水中，得到溶液，使用波长356～405nm的光对所述溶液进行照射，得到凝胶，即得双蛋白水凝胶；其中，所述溶液中，甲基丙烯酸化明胶的浓度为5～15％，甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度为3～9％，光引发剂的浓度为0.01～0.5％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶液中，甲基丙烯酸化明胶的浓度为10％，甲基丙烯酸化丝胶蛋白的浓度为6％，光引发剂的浓度为0.1％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光的波长为405nm，所述照射时间为10～120s，所述光引发剂为LAP。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述溶液中加入细胞后，再进行所述照射。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述溶液中加入细胞液后，再进行所述照射，其中所述细胞液与所述溶液的体积比为1：5-15。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述细胞为脐带间充质干细胞。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法包括以下步骤：将明胶溶解于水中后，加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后，装入截留分子量为3500的透析袋中，并用纯水进行透析，然后将截留液冻干，即得所述甲基丙烯酸化明胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，制备所述甲基丙烯酸化明胶时，明胶与甲基丙烯酸酐的比例为明胶：甲基丙烯酸酐＝1g：0.2～1.0mL，反应温度为常温，反应时间为6～16h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白的制备方法包括以下步骤：将蚕茧洗干净后烘干，用Na2CO3溶液浸泡蒸煮，去除固体杂质，得到丝胶溶液，向所述丝胶溶液中加入甲基丙烯酸酐进行反应，反应后，去除固体杂质，装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，并用纯水进行透析，然后将截留液冻干，即得所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，制备所述甲基丙烯酸化丝胶蛋白时，蒸煮时间为0.5h～2h，蚕茧与甲基丙烯酸酐的比例为蚕茧：甲基丙烯酸酐＝20g：3～9mL，反应温度为常温，反应时间为6～24h。
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Non-Patent Citations (2)
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