CN111588856A - 黑茶提取物和p38抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了黑茶提取物和p38抑制剂在协同***中的应用。具体地，本发明提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同***的药物组合物。本发明抑制剂组合能够有效地协同抑制肿瘤(尤其是胰腺癌)的生长，可在靶向***中得到广泛应用。

Description

黑茶提取物和p38抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及黑茶提取物和p38抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用及其相关药物。
背景技术
天然膳食制剂由于其疗效好，副作用少而被越来越多地应用于科学研究和临床实践中。中国茶叶，尤其是绿茶，被广泛报道为一种抗癌物质(Zhang,D. and M.Al-Hendy,etal.(2010)."Green tea extract inhibits proliferation of uterine leiomyomacells in vitro and in nude mice." American Journal of Obstetrics andGynecology 202(3):289.e1-289.e9.)。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)则是其中最有效的成分(Roberts,B.E.and M.L.Duennwald,et al.(2009)."A synergistic small-molecule combination directly eradicates diverse prion strain structures."Nature Chemical Biology 5(12):936-946；Lecumberri,E.and Y.M. Dupertuis,et al.(2013)."Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate(EGCG)as adjuvant incancer therapy." Clinical Nutrition 32(6):894-903)。
肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、***性疾病。癌症相关基因的异常可以引起肿瘤基因组稳定性丧失，进而导致肿瘤细胞出现异常的生物学行为，如逃避凋亡、无限复制的潜能、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等。
目前，外科手术、放疗、化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。外科手术和放射治疗是局部治疗的方法，药物治疗属于全身效应的方法，更多地考虑到了恶性肿瘤能够扩散和转移的特质。
胰腺癌是全球第七大癌症死亡原因，这一疾病通常在癌症晚期被诊断出来，并且其五年生存率极低(大约3％)。
目前，吉西他滨是治疗胰腺癌的主要化疗药物，然而，临床治疗效果不佳以及耐药性的频繁出现，促使人们需要开发更有效的治疗方案。
因此，本领域迫切需要开发新的有效***，尤其是胰腺癌的治疗方法和药物。
发明内容
本发明提供了一种黑茶提取物与p38抑制剂在协同***的用途。
本发明第一方面，提供了一种抑制剂组合的用途，所述抑制剂组合包括黑茶提取物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同***的药物组合物。
在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。
在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水溶性提取物、脂溶性的提取物、或其组合。
在另一优选例中，所述的黑茶提取物包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提取物、酯提取物、或其组合。
在另一优选例中，所述的醇包括C1－C6烷基醇(如乙醇)。
在另一优选例中，所述的酯包括：乙酸乙酯。
在另一优选例中，所述的黑茶提取物含有选自下组的组分：儿茶素类、黄酮类、有机酸类、或其组合。
在另一优选例中，所述的p38来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、乳腺癌、卵巢癌、子***、甲状腺癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括：胰腺癌。
在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括p38的抗体、p38核酸的反义RNA、 siRNA、shRNA以及小分子抑制剂。
在另一优选例中，所述的小分子抑制剂选自下组：EO-1428、PD169316、 SB202190、SB203580、SB239063、SB281832、VX-702、VX-745、ZM336372、RPR 200765A、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。
在另一优选例中，所述的化疗剂包括顺铂、紫杉醇。
在另一优选例中，黑茶提取物与p38抑制剂的质量比为100:1至1:10。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：口服制剂(如片剂、胶囊)、栓剂、和静脉注射液。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括黑茶提取物、p38抑制剂和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的黑茶提取物和p38抑制剂的质量比为1:100至 100:1，较佳地1:20至20:1，更佳地1:10至10:1或1:5至5:1。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包括化疗剂。
本发明第三方面，提供了一种抑制剂组合，所述组合由黑茶提取物和p38 抑制剂构成。
在另一优选例中，所述的p38抑制剂包括阻断通过p38MAP激酶途径的信号传导的任何物质。
在本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入第二方面所述的药物组合物和/ 或本发明第三方面所述抑制剂组合，从而协同抑制肿瘤细胞生长。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：胰腺癌细胞、肺癌细胞、肠癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胆囊癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子***细胞、甲状腺癌细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述方法包括：将肿瘤细胞(每孔2000-4000个细胞，优选每孔2500-3500个细胞，更优选每孔3000个细胞)和黑茶提取物及p38抑制剂一起混合培养0-48小时。
在另一优选例中，混合培养液中黑茶提取物的终浓度为71.79μg/ml。
在另一优选例中，混合培养液中p38抑制剂的终浓度为10μM。
本发明第五方面，提供了一种***的方法，其特征在于，向所需对象施用安全有效量的本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述抑制剂组合。
本发明第六方面，提供了一种抗肿瘤细胞生长的黑茶提取物，所述的黑茶提取物包括：水提取物、醇提取物、水/醇混合溶剂提取物、酯提取物、或其组合。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了黑茶乙酸乙酯提取物抑制胰腺癌细胞的生长。各图如下:
(A)显示了一种黑茶乙酸乙酯提取物的制备流程，其中，黑茶用10倍体积水煎煮提取3次，分别提取2小时、1.5小时和1小时。合并水提取液并减压浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，最后浓缩并干燥；
(B)用不同品种、不同浓度的黑茶乙酸乙酯萃取物或者正丁醇萃取物处理 PANC-1或者SW1990细胞48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P<0.01(Student 氏t测验)；(Control:对照)。
(C)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者 SW1990细胞的免疫印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。
图2显示了乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物是阻滞癌细胞生长最有效的组分。各图如下:
(A)将天尖黑茶乙酸乙酯萃取物溶解在95％乙醇中，按质量比1：2加入HP-20 大孔树脂拌样。干燥后上色谱柱，静态吸附24小时。接下来用蒸馏水，30％乙醇，50％乙醇和95％乙醇(3倍柱体积)依次洗脱；
(B)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的四种洗脱物处理PANC-1或者SW1990细胞 48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P<0.01(Student氏t测验)；
(C)用天尖黑茶水洗脱物的半抑制浓度(IC50)处理PANC-1或者SW1990细胞的免疫印迹分析结果。免疫印迹分析实验中使用相应的抗体。
图3显示了水洗脱物和P38抑制剂协同作用阻滞胰腺癌细胞生长。各图如下：
(A)用P38抑制剂SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度。免疫印迹分析实验使用指明的抗体；
(B)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用所示剂量的天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物处理48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05, **表示P<0.01(Student氏t测验)；
(C)SB203580(10μM处理1小时)预处理PANC-1和SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理不同时间长度，并检测ROS的产生。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P <0.05,**表示P<0.01(Student氏t测验)。
各图中，SB表示P38抑制剂SB203580。
图4显示了水洗脱物导致与细胞生长阻滞相关的基因表达模式改变。各图如下：
(A)用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理SW1990细胞 12小时，27496个探针集的层次聚类分析表明了处理组和对照组的基因表达量；
(B)SB203580(10μM处理1小时)预处理SW1990细胞，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的IC50浓度处理12小时，通过实时荧光定量PCR分析两组之间ID1(左图)和PYCARD(右图)的相对mRNA表达水平。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P <0.01(Student氏t测验)。
图5显示了ID1过表达对水洗脱物导致的癌细胞生长受抑有显著的回复效应。各图如下：
(A)将过表达的ID1质粒转染到SW1990细胞株中，使用相应的抗体进行免疫印迹分析实验；
(B)SB203580(10μM处理1小时)预处理过表达ID1和未过表达ID1的SW1990 细胞后，再用天尖黑茶乙酸乙酯萃取物的水洗脱物的在所示剂量下处理48小时，并进行CCK8实验。以上数值表示平均值±标准差(3次独立实验)，在指定的组别之间*表示P<0.05,**表示P<0.01(Student氏t测验)。
图6显示了对天尖黑茶乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物的LC－MS/MS分析结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了黑茶提取物与p38抑制剂在***方面(尤其是胰腺癌)有良好的协同作用。联合运用黑茶提取物与p38抑制剂能够有效抑制肿瘤的生长，其效果远优于二者的加合作用，而将黑茶提取物与其他癌症相关基因的抑制剂联用，并无良好的协同作用。在此基础上，完成了本发明。
黑茶
黑茶作为中国最受欢迎的茶种之一，主要产于湖南、云南、湖北、广西和四川等省份。黑茶以微生物参与的后发酵生产工艺为特征(Zhang and Zhang et al.,2013)，这一过程会对茶叶的化学组分产生明显的影响(Yue and Chu et al., 2014)。
黑茶属于六大茶类之一，属后发酵茶。黑茶的基本工艺流程是杀青、初揉、渥堆、复揉、烘焙。黑茶一般原料较粗老，加之制造过程中往往堆积发酵时间较长，因而叶色油黑或黑褐，故称黑茶。
有效部位及其制法
本文所用，术语“本发明的提取物”、“本发明的有效部位”和“本发明的抗肿瘤的有效部位”可互换使用，都指提取自黑茶的、具有抗肿瘤作用的提取物。
在本发明中，抗肿瘤的有效部位可用黑茶为原料进行提取。
如本文所用，术语“提取物”或“有效部位”包括水溶性的和/或脂溶性的提取物。该术语还包括醇提物、或水提物。此外，还包括有效部位群，即含有脂溶性有效部位和水溶性有效部位的萃取物或其混合物。
可用于制备本发明的黑茶提取物的方法没有特别限制。可以用常规方法，以黑茶为原料，获得水溶性的和/或脂溶性的提取物。
在本发明的一个优选例中，有效部位的制备通过溶剂提取法、萃取法、和/ 或色谱法进行。
在本发明中，对于溶剂提取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或几种溶剂的混合溶剂。提取次数可以是一次或多次。
在本发明中，对于溶剂萃取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、环己烷、石油醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。萃取次数可以是一次或多次；
在本发明中，对于柱色谱法，其柱色谱没有特别限制，代表性的例子包括 (但并不限于)：活性碳、硅胶、反相硅胶、大孔树脂、葡聚糖凝胶中的一种或几种的组合。
在本发明的一个优选例中，以黑茶为原料，以10倍黑茶体积水(尤其是热水)提取3次，回收，得到水性提取物。
水性提取物经冷却后，以乙酸乙酯萃取，表明该提取物可有效抑制肿瘤细胞的生长。
在本发明的另一个优选例中，以黑茶乙酸乙酯萃取物为原料，以95％乙醇溶解，得到乙醇水溶液提取物并经大孔树脂色谱柱，以蒸馏水和乙醇水溶液为洗脱溶剂，浓缩干燥后得到水洗脱部位和不同浓度乙醇洗脱部位。
对于用乙酸乙酯萃取物提取后的成分，本发明人认为在经过大孔树脂并用蒸馏水和乙醇水溶液洗脱后，似乎仍然会有相应的有效成分。其中，水洗脱部位效果最好。
p38抑制剂
如本文所用，术语“p38抑制剂”、“p38MAPK抑制剂”可互换使用，指阻断通过p38MAP激酶途径的信号传导的任何物质。在本发明的一些实施方案中，p38MAPK抑制剂可通过减少p38MAPK的量、抑制或阻断p38MAPK活化或抑制信号传导途径中的其他分子而起作用。
p38抑制剂的非限制性实例包括(但并不限于)：反义p38MAPK核酸及其片段。p38MAPK抑制剂的其他非限制性实例包括(但并不限于)：结合p38MAPK 的抗体及其片段。p38MAPK抑制剂的其他非限制性实例包括(但并不限于)： EO-1428，PD169316，SB202190，SB203580，SB239063(Legos等，2001，Brain Res.892：70-77；Barone等，2001，Med ResRev.21(2)：129-145)，SB281832， VX-702，VX-745，ZM336372，RPR 200765A(Mclay LM等，2001，Bioorg Med Chem.9(2)：537-554)，和N-(3-叔丁基-1-甲基-5-吡唑基)-N'-(4-(4-吡啶基甲基)苯基)脲(Dumas J，2002，Bioorg Med Chem Lett 12(12)：1559-62)。
如本文所用，术语“p38MAPK活性”是指p38MAPK的磷酸化的能力，包括对以下蛋白的磷酸化能力：乳腺癌1(AIB1)、激活转录因子2(ATF-2)、***受体α(ERα)、***受体β(ERβ)、丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶 2(MAPKAP-K2)、MAPKAP-K3、p38相关/活化蛋白激酶(PRAK)、Menkes铜转运P 型ATP酶(MNK)、丝裂原和应激激活的蛋白激酶(MSK)、核糖体S6激酶B(RSK-B)、信号转导和转录激活因子1(STAT1)、Max/Myc复合物、Ets样转录因子-1(Elk1)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、肌细胞增强因子2(MEF2)及其片段。所述磷酸化可通过本领域已知的任何磷酸化测定法进行测量。磷酸化测定的非限制性实例包括：活性测定(例如凝胶内激酶测定)和免疫测定(例如在免疫组织化学、免疫荧光、Western印迹和ELISA中使用特异性结合磷酸化蛋白的抗体)。
如本文所用，术语“p38MAPK表达”是指通过本领域已知的任何方法测量的p38MAPK基因产物的形成，所述方法包括(但并不限于)：核酸杂交方法、 Northern印迹、原位杂交、聚合酶链反应扩增、报告基因表达等。p38MAPK 基因产物的形成也可以通过任何基于抗体的技术测量，包括免疫组织化学、免疫荧光、Western印迹和ELISA法。
RNAi、siRNA、shRNA
如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解同源mRNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。dsRNA 介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及 RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。
如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标 mRNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。
本文所用的术语“表达盒”是指包含本发明RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的RNAi前体。本文所用的术语“RNAi前体”是指可以在哺乳动物细胞中加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer、Ago2或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。
本文所用的术语“shRNA”是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹 RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer和Ago2等蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。
本文所用的术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约 20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数 miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种 miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA 存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过 Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。
表达载体
如本文所用，术语“表达载体”指的是能将感兴趣的多聚核苷酸序列转移到目标细胞的载体。此类载体能自我复制或结合进宿主细胞染色体(宿主细胞有，例如原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体、和植物个体等)，并可在适合本发明多聚核苷酸转录的位点含有启动子。表达载体可包含结构基因和调控其表达的启动子，此外，还有能在宿主细胞中起作用的各种调控元件。本领域熟知，生物活体(如动物)的表达载体类型及所用调控元件的种类可根据所用宿主细胞的类型而改变。
可用于本发明的病毒载体没有特别限制，可以是任何能够利用病毒具有传送其基因组的特点，将遗传物质带入其他细胞，进行感染的病毒载体。可发生于完整活体或是细胞培养中。包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体。在本发明中，一种优选的表达载体是慢病毒载体。
药物组合物以及给药方式
本发明还提供一种可用于协同***的组合物，它可用于抑制肿瘤生长和/或转移。
本发明药物组合物包括：有效量的黑茶提取物，和有效量的p38抑制剂，以及药学上可接受的载体。
此外，本发明药物组合物还可以包括任选的实体肿瘤化疗剂。所述的化疗剂包括(但不限于)顺铂、紫杉醇、阿霉素等。
通常，可将本发明的黑茶提取物，或p38抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述药物的有效量可随给药的模式和肿瘤的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；肿瘤的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
药盒
本发明提供一种药盒，所述药盒包括：
组分(1)：含有黑茶提取物的制剂；
组分(2)：含有p38抑制剂的制剂；
组分(3)：说明书。
所述的含有黑茶提取物的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。
所述的含有p38抑制剂的制剂选自片剂、胶囊、栓剂、或静脉注射液。
药盒中装有至少两个含有黑茶提取物的单元剂型和至少两个含有p38抑制剂的单元剂型；较佳地各为4-10个。
如本文所用，术语“单元剂型”是指为了服用方便，将组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
本发明提供的说明书中可以有如下描述：所述药盒的使用方法是同时使用含有黑茶提取物的单元剂型和含有p38抑制剂的单元剂型。
本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有黑茶提取物的制剂和含有p38抑制剂的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。
所述的含有黑茶提取物的制剂优选含有黑茶提取物的单元剂型，所述含有 p38抑制剂的制剂优选含有p38抑制剂的单元剂型。
所述步骤优选将至少两个含有黑茶提取物的单元剂型和至少两个含有p38 抑制剂的单元剂型，以及说明书一起放置，形成药盒。
本发明的有益效果：
1.黑茶提取物能够杀伤肿瘤细胞，这为今后进一步细分黑茶提取物中杀伤肿瘤细胞的关键成分提供了理论基础。
2.黑茶提取物和p38抑制剂能够协同作用于抗肿瘤治疗，从而更显著地抑制肿瘤生长的作用。
3.黑茶提取物和p38抑制剂能够协同作用于抗肿瘤治疗，从而提供了天然产物和小分子抑制剂协同作用于抗肿瘤治疗的思路。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
黑茶萃取物的制备
本实施例中使用的三种黑茶——茯砖茶叶、千两茶叶和天尖茶叶产自湖南省益阳市安化县。
参见图1，黑茶茶叶(500g)用10倍体积水煎煮提取3次，分别提取2小时、 1.5小时和1小时。合并水提取液并减压浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，然后浓缩并干燥。最后本发明人得到石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物和剩余水萃取物。萃取物在使用前保存在4度。
天尖黑茶乙酸乙酯萃取物(26g)溶解在95％乙醇中，按质量比1：2加入HP-20 大孔树脂拌样。干燥后上色谱柱(3.7cm×24cm)，静态吸附24小时。接下来用蒸馏水，30％乙醇，50％乙醇和95％乙醇依次洗脱(3个柱体积洗脱)，将所得产物减压浓缩并且干燥。洗脱物在使用前保存在4度。
实施例2
超高效液相色谱(UHPLC)和四极飞行时间质谱仪(Q-TOF MS)分析
这一分析应用UHPLC 1290infinityⅡ型仪器和6554Q-TOF质谱仪(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉)。采用Zorbax RRHD Eclipse plus C18 色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)(安捷伦科技公司)进行色谱分离。流动相以0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱(0～2分钟，10％B；3～30分钟，10％～ 100％B；)，流速每分钟0.4毫升，进样体积5微升，洗脱柱恒温35摄氏度。质谱离子源为电喷雾离子化源(ESI)，正离子模式扫描。质谱参数：雾化气体(N2) 流速每分钟8.0升；雾化气体温度320摄氏度；鞘气温度350摄氏度；鞘气流速 (N2)每分钟11.0升；喷雾电压，4000V；碰撞电压，175V.质谱扫描范围m/z100～1700，所有质谱峰的质量测量都是准确的。一级质谱采用MS模式采集，二级质谱采用autoMS/MS模式采集,二级梯度碰撞能量(CE)+10,+20,+40eV。所有操作、数据采集和分析均由安捷伦相应工作软件监控并运行。利用TCM_database和 Metl in_Metabolities_AM_PCDL数据库进行潜在化合物的搜索。
天尖黑茶为热水提取，大孔树脂水洗脱部分极性较大，该部分可能含有一部分糖(包括一些小分子糖以及大分子多糖)。该部分采用经典的苯酚-硫酸法测定其中的总糖含量。标准曲线为Y＝9.2593X+0.0826(R2＝0.9994)，其中Y为糖浓度(mg/mL)，X为490nm处的紫外吸收度。标准曲线浓度范围为0.004mg/mL～ 0.024mg/mL。结果表明，大孔树脂水洗脱部分总糖含量为5.67％。
实施例3
细胞培养
SW1990和PANC-1细胞在含有抗生素和10％胎牛血清的培养基(DMEM)中培养，细胞培养箱内恒温37度，空气湿润，含有5％二氧化碳。所有细胞株来自美国模式培养物集存库(ATCC)，并常规进行支原体污染检查。细胞株未经过鉴定。
实施例4
细胞增殖和毒性试验
用CCK8实验(Dojindo)检测黑茶组分对SW1990和PANC-1细胞增殖的影响， SW1990或PANC-1细胞以每100微升体积3×103或5×103个细胞铺于96孔板中，细胞被不同浓度的黑茶提取物处理48小时。处理时间结束后，每孔加入10微升 CCK8溶液。在37度，5％二氧化碳的培养箱中培育2小时，用酶标仪在450纳米波长下检测细胞的吸光度。所有实验检测至少进行三次独立重复实验。
实施例5
免疫印迹分析试验
用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂PMSF(A610425,Sangon Biotech)裂解细胞，然后用BCA蛋白试剂盒(Thermo)测定蛋白浓度。等量蛋白样品中加入SDS 样品缓冲液(1％SDS,62.5mM Tris-HCl，pH6.8，10％甘油，5％巯基乙醇，0.05％溴苯酚蓝)煮沸5分钟。蛋白通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用溶于PBST的5％脱脂奶粉室温下封闭PVDF膜2小时，然后用一抗4度孵育过夜。洗涤后，用与辣根过氧化物酶(抗兔或抗鼠)结合的二抗在室温下孵育。使用的抗体有：phospho-MAPKAPK-2(Thr334)(#3041, 1:1000),phospho-JunB(Thr102/Thr104)(#8053,1:1000)和AKT(9272S, 1:1000)抗体均购自Cell Signaling Technology；AKT(phospho-ser473)(11054, 1:1000),ERK1/2(phospho-Thr202)(12082,1:1000)和ERK1/2(29162,1:1000) 抗体均购自SignalwayAntibody。
实施例6
活性氧(ROS)检测试验
将细胞铺于12孔板中，在使用或不使用P38抑制剂SB203580(S1076， Selleck)的情况下，用黑茶提取物的半抑制浓度(IC50)处理细胞不同时间长度。处理结束后，PBS洗涤细胞一次以排除干扰因素。用含有5μM H2DCFDA(HY-D0940,MCE)的新鲜培养基在37度避光孵育细胞30分钟，然后用 0.25％的胰酶(gibco)消化细胞，冷PBS洗一次。最后将细胞悬浮在PBS中，并立即用流式细胞仪(BD Biosciences AccuriC6，USA)进行分析。
实施例7
cDNA基因芯片分析
用天尖黑茶乙酸乙酯提取物-水洗脱物的半抑制浓度(IC50)处理SW1990细胞12小时。用RNeasy mini kit(Qiagen,Germany)提取总RNA。根据TruSeqTM RNA样品准备指南使用TruSeqTM RNA样品准备试剂盒(Il lumina,USA)合成双末端(Paired-end)库。简而言之，使用多聚T低聚吸附磁珠纯化包含mRNA分子的多聚A。纯化后，通过二价阳离子在94摄氏度下孵育8分钟从而将mRNA分散成小片段。利用逆转录酶和随机引物将裂解后的RNA片段转录为第一链cDNA，接下来用DNA聚合酶Ⅰ和RNA酶H合成第二链cDNA。这些cDNA片段经过最终修复过程，添加一个“A”碱基，然后连接适配器。之后用PCR对产物进行纯化和富集，形成最终的cDNA文库。纯化文库被
Figure BDA0001967355710000141
2.0Fluorometer(Life Technologies, USA)量化以及被Agilent 2100bioanalyzer(Agilent Technologies,USA)验证从而确认***片段和计算摩尔浓度。将文库稀释到10pM，通过cBot生成集群，然后在Illumina HiSeq 2500(Illumina,USA)上进行测序。cDNA文库的构建和测序工作在上海生物科技公司进行。
实施例8
RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR
用天尖黑茶乙酸乙酯提取物-水洗脱物的半抑制浓度(IC50)处理SW1990细胞12小时。使用Trizol试剂(Ambion)并根据其说明书从细胞中提取总RNA。用 PrimeScriptTM RTreagent kit with gDNA Eraser(RR047A,TaKaRa)将细胞 RNA逆转录为cDNA。用PowerSYBR Green PCR Master Mix(Thermo)试剂盒进行实时荧光定量PCR检测cDNA样品中的目的mRNA水平。
qPCR引物序列如下：
hACTB:
5'-ACAATGTGGCCGAGGACTTTGA-3'(正向)(SEQ ID No.:1)和
5'-TGTGTGGACTTGGGAGAGGACT-3'(反向)(SEQ ID No.:2)；
hID1:
5'-CTACGACATGAACGGCTGTTA-3'(正向)(SEQ ID No.:3)和
5'-CAACTGAAGGTCCCTGATGTAG-3'(反向)(SEQ ID No.:4)；
hPYCARD：
5'-CTCAAGAAGTTCAAGCTGAAGC-3'(正向)(SEQ ID No.:5)和
5'-TAGGTCTCCAGGTAGAAGCTG-3'(反向)(SEQ ID No.:6)。
实施例9
转染试验
根据说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将不同的质粒转染入SW1990细胞。其中，包括用于表达人源ID1质粒(pLX304-ID1载体)，以及不表达人源ID1质粒的对照质粒(pLX304载体)。
结果
1.黑茶乙酸乙酯提取物抑制胰腺癌细胞的生长
本研究选用了湖南省益阳市安化县生产的茯砖茶、千两茶和天尖茶三种茶叶进行研究，去分析黑茶提取物对胰腺癌细胞的潜在的生理效应及其相关分子机制。
首先根据溶剂萃取法对黑茶组分进行初步分离，最终得到了石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和剩余水部分四种组分(图1A)，其中乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物用于检测对胰腺癌细胞生长的潜在生理效应。
如图1B所示,CCK8分析表明，相较于正丁醇萃取物，三种黑茶的乙酸乙酯萃取物会对人胰腺导管癌细胞系SW1990和PANC-1的细胞生长产生更加显著的抑制作用，并且这种抑制作用会随着剂量的增加而增强。
由计算所得，相较于其他两种类型的茶叶,天尖茶乙酸乙酯萃取物有更小的IC50(半抑制浓度)值，在SW1990和PANC-1细胞分别为85.09μg/ml、141.2μ g/ml。这一结果表明，天尖茶乙酸乙酯萃取物对癌细胞的生长有更强的抑制效应(图1B)，因此利用它进一步地进行后续分析。
免疫印迹法分析结果表明，用乙酸乙酯萃取物处理SW1990和PANC-1细胞显著增加了p38下游底物MAPKAPK2的磷酸化(Campbell and Anderson et al., 2014)，而未增强JNK介导的JunB磷酸化(图1C)。同时，乙酸乙酯萃取物的处理会显著减弱两种细胞株AKT而不是ERK的磷酸化(图1C)。这些结果表明，黑茶乙酸乙酯萃取物通过其对p38和AKT活性的双重作用抑制癌细胞生长(Gao and Xiao et al.,2017；Zou and Blank,2017)。
2.乙酸乙酯萃取物中的水洗脱物是阻滞癌细胞生长最有效的组分
乙酸乙酯萃取物进一步提纯分离为水洗脱组分，30％乙醇洗脱组分，50％乙醇洗脱组分和95％乙醇洗脱组分(图2A)，并检测它们对细胞生长的影响。
有趣的是，发现它们之中的水洗脱物是抑制SW1990和PANC-1细胞生长最有效的组分，IC50值分别是71.79μg/ml和114.4μg/ml(图2B)。
与上述结果一致，水洗脱物处理明显上调MAPKAPK2的磷酸化，同时下调AKT 的磷酸化(图2C)，这揭示：第二次提纯的水洗脱物在乙酸乙酯萃取物诱导癌细胞的生理反应和信号通路改变中起主要作用。
此外，对水洗脱物进行了初步成分分析，并且基于黑茶已经报道的化学成分文献，以及对Agilent TCM_database和Metlin_Metabolities_AM_PCDL数据库的搜索，初步鉴定了主要结构类型为儿茶素类、黄酮类以及有机酸类的17个主要成分(图6)。同时，采用经典的苯酚-硫酸法测定总糖含量，大孔树脂水洗脱物的总糖含量为5.67％(图6)。
3.水洗脱物和P38抑制剂协同作用阻滞胰腺癌细胞生长
基于分析和部分结果，本发明人认为与应激信号刺激相关的p38活化可能是是一个重要的上游效应分子，介导茶萃取物诱导的下游信号，最终导致细胞生长受抑。
在P38抑制剂SB203580缺乏或存在的情况下，水洗脱物作用于SW1990和 PANC-1细胞不同时间长度，其中SB203580的抑制活性通过其对MAPKAPK2磷酸化的作用得以验证(图3A)。
出乎意料的是，功能实验分析表明了SB203580的处理加剧了水洗脱物对 SW1990和PANC-1细胞生长的抑制作用(图3B)。这一观察结果意味着：黑茶提取物导致的P38信号的增强是在此条件下癌细胞维持细胞生长的反馈机制所致。
同时，本发明人检测了水洗脱物和SB203580共处理对SW1990和PANC-1细胞内ROS产生的潜在效应。结果表明，水洗脱物会减少SW1990细胞内ROS的积聚， SB203580处理在一定程度上进一步增强了这一效应(图3C，左图)。
与之相反，本发明人发现水洗脱物会导致PANC-1细胞内ROS的产生增多，而SB203580处理会部分减弱这一效应(图3C，左图)。SW1990与PANC-1细胞在ROS 的产生方面结果不一致，说明水洗脱物与p38抑制剂对胰腺癌细胞生长的协同抑制作用与ROS积聚的改变没有密切联系。
4.水洗脱物导致与细胞生长阻滞相关的基因表达模式改变
接下来，本发明人通过对水洗脱物处理过和未处理的SW1990细胞进行cDNA 基因芯片分析，测定其全基因表达谱。
值得注意的是，许多转录本富含了与抗增殖和凋亡相关的基因(图4A)。
本发明人挑选其中已知功能与细胞生长有关的ID1、PYCARD基因进一步验证其表达量(Maruyama and Kleeff et al.,1999；de Alba,2009；Trevino and Pillai et al.,2012)。
与基因芯片分析结果一致，qPCR分析结果表明水洗脱物处理SW1990细胞会导致ID1的表达下调，同时PYCARD的表达水平上调(图4B)。
另外，本发明人发现在SW1990细胞中加入水洗脱液并且同时进行SB203580 处理，ID1的表达水平会进一步降低。
然而，SB203580处理对水洗脱物处理SW1990细胞导致的PYCARD表达水平变化无显著的叠加效应(图4B)。这些数据表明，ID1可能对水洗脱物和p38抑制剂协同影响癌细胞生长的效应起关键作用。
5.ID1过表达对水洗脱物导致的癌细胞生长受抑有显著的回复效应
基于以上结果，本发明人进一步研究了茶提取物对胰腺癌细胞生长的生理效应。
结果表明，ID1基因在SW1990细胞株中稳定表达(图5A)。如图5B所示，无论是用水洗脱物单独处理，还是用水洗脱物和SB203580同时处理，过表达ID1 明显改善了SW1990细胞的存活率。
这些结果表明，在黑茶提取物和p38失活的共同作用下，ID1是促进胰腺癌细胞生长阻滞的关键下游反应效应物。
讨论
鉴于黑茶作为一种饮料在人群日常生活中的普及性，其对人体健康的益处及相关的具体机制受到越来越多的关注。
已有研究表明黑茶在各个方面都表现出独特的生物活性。黑茶提取物可通过抑制固醇调节元件结合蛋白-1c、脂肪酸合酶和CCAAT/增强子结合蛋白α的基因表达从而减少脂质生成代谢，同时通过上调肝脏过氧化物酶体增殖体激活受体α、肉碱棕榈酰基转移酶1a和低密度脂蛋白受体的基因表达从而促进能量消耗和脂肪分解(Li and Liu et al.,2013)。
此外，黑茶还被证明具有抗氧化剂和一氧化氮清除剂的潜力，其中黑茶提取物对脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞产生一氧化氮的负调控作用就是一个例证(Duh and Yen etal.,2004)。
关于癌症研究方面，一种从黑茶中分离出的新发现的命名为Camellikaempferoside A(kaempferol3-O-[E-p-coumaroyl-(→2)][α -l-arabinopyranosyl-(1→3)][α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β -dglucopyranoside)的酰化黄酮醇糖苷，被发现对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231 细胞具有抗增殖活性(Tian and Liuet al.,2016)。但是，黑茶特定组分对肿瘤发生的精确生理作用及其相关分子机制的***研究还需要更多的努力。
在本发明中，本发明人对黑茶进行了二次提取，发现从乙酸乙酯萃取物中分离出的水洗脱物是抑制胰腺癌细胞生长最有效的成分。
在机理上，本发明人发现黑茶水洗脱物能导致活化的P38增强，同时抑制 P38会对胰腺癌细胞的生长产生叠加性的负调控作用。
此外，基因芯片分析表明水洗脱物处理会导致胰腺癌细胞基因表达模式的改变，后续分析证实其中的ID1(分化抑制蛋白1)(Ling,F.and B.Kang,et al. (2014)."Idproteins:small molecules,mighty regulators."Curr Top Dev Biol 110:189-216.)对黑茶提取物导致的胰腺癌细胞生长阻滞具有关键作用。
天尖黑茶的提取物相较于千两黑茶和茯砖黑茶的提取物对胰腺癌细胞有更强的抑制作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 安化县茶产业茶文化开发领导小组办公室
<120> 黑茶提取物和p38抑制剂在协同抑制肿瘤中的应用
<130> P2018-2524
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
acaatgtggc cgaggacttt ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
tgtgtggact tgggagagga ct 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
ctacgacatg aacggctgtt a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
caactgaagg tccctgatgt ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
ctcaagaagt tcaagctgaa gc 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
taggtctcca ggtagaagct g 21

Claims (10)

1.一种抑制剂组合的用途，其特征在于，所述抑制剂组合包括黑茶提取物和p38抑制剂，并且所述组合用于制备协同***的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的黑茶提取物包括：水溶性提取物、脂溶性的提取物、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的p38来自于哺乳动物，更佳地为啮齿类动物(如小鼠、大鼠)或人。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：胰腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、乳腺癌、卵巢癌、子***、甲状腺癌、或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的p38抑制剂包括p38的抗体、p38核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及小分子抑制剂。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括黑茶提取物、p38抑制剂和药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括化疗剂。
8.一种抑制剂组合，其特征在于，所述组合由黑茶提取物和p38抑制剂构成。
9.如权利要求8所述的抑制剂组合，其特征在于，所述的p38抑制剂包括阻断通过p38MAP激酶途径的信号传导的任何物质。
10.一种体外非治疗性的协同抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤：向肿瘤细胞培养体系中加入如权利要求8所述抑制剂组合和/或权利要求6所述的药物组合物，从而协同抑制肿瘤细胞生长。
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