CN111569145A - 一种体表创面抗菌修复的液体敷料及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体表创面抗菌修复的液体敷料及其制备方法、应用，其不仅可以应用于医疗护理的专业医疗领域还可应用于日常家庭护理范畴。其成分组成包括纯天然抗菌肽、β葡聚糖、纯净水、丁二醇、羊膜间充质干细胞外泌体。天然抗菌肽能显著抑制创面微生物感染且促进创面的再生修复，羊膜间充质干细胞外泌体促进皮肤再生，对皮肤的副作用小，能有效的应用在轻中度痤疮上。本发明对人体安全无害，使用方便，运输储存方便，不会对环境造成二次污染且对创面皮肤具有促进修复及周围皮肤的护理。

Description

一种体表创面抗菌修复的液体敷料及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种体表创面抗菌修复的液体敷料及其制备方法、应用，属于医疗器械领域。

背景技术

皮肤是人体抵御外界微生物入侵的第一道天然防线体，皮肤的完整性和伤口修复愈合能力会直接影响健康和美观。

抗菌肽是一种小分子多肽，它是生物天然的免疫成分，能有效的抵御外界微生物的入侵，具有广谱的杀菌作用，许多学者和专家研究指出，其在细菌真菌和病毒上有显著的作用；并且抗菌肽对正常细胞无伤害，且能有效促进损伤皮肤的修复和再生及免疫调节作用，是免疫***保持稳定性，有效平衡炎症反应。

羊膜间充质干细胞具有自我修复能力，分泌多种对皮肤有用的生长因子，能有效调控皮肤组织周围生长因子的生理代谢。

痤疮是一种常见的毛囊皮脂的慢性炎症性皮肤疾病，其诱导因素较多，包括激素分泌异常，微生物感染及过度的免疫反应等；对痤疮的治疗上普遍的是抗生素的治疗，抗激素治疗及抑制炎症反应的治疗方法等。这些方法或多或少会造成副作用，包括激素和抗生素使用过度引发的感染及副作用导致更严重的皮肤病。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的是提供一种体表创面抗菌修复的液体敷料，利用抗菌肽促进创面的修复再生及消灭痤疮的微生物污染，从而制备痤疮治疗的液体敷料。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种体表创面抗菌修复的液体敷料，包括如下质量百分比的原料组分：

抗菌肽 0.5％～5％，

β葡聚糖 40％～80％，

己二醇 2％～6％，

其余为，浓度在50-90ug/ml之间的羊膜间充质干细胞外泌体。

针对现有技术存在的不足，本发明的第二目的是提供一种体表创面抗菌修复的液体敷料的制备方法，该方法制备的液体敷料利用抗菌肽促进创面的修复再生及消灭痤疮的微生物污染的特性，实现治疗痤疮的效果。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种制备如上技术方案所述液体敷料的方法，所述羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。

进一步，所述的羊膜间充质干细胞外泌体制备方法具体为：

用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养；每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

针对现有技术存在的不足，本发明的第三目的是提供上述技术方案中的液体敷料在轻中度痤疮的治疗和/或预防方面的应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、此液体敷料对不同微生物的抑菌作用；

2、此液体敷料对病毒的杀伤效果；

3、此液体敷料在轻中度痤疮中具有较好的疗效。

附图说明

图1为不同浓度抗菌肽对病毒抑制作用的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例，对本发明进行详细描述。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

液体敷料：

采用的材料：自主研发的抗菌肽，β葡聚糖，丁二醇均为药用级，羊膜间充质干细胞外泌体，水为蒸馏水。

实施例1

液体敷料制备方法：组分包括

1)抗菌肽为修复剂和抗菌剂，质量比在0.5％～5％

2)β葡聚糖为保湿修复剂质量比在40％～80％

3)己二醇保湿剂，质量比在2％～6％

4)其余为：羊膜间充质干细胞外泌体，浓度在50-90ug/ml。

羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。具体方法：用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

实施例2抗菌肽对细菌的抑制作用

采用材料：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌、痤疮丙酸杆菌，TA-XJ麦氏比浊仪(北京天安联合科技有限公司)，高压灭菌锅、离心机、培养箱、显微镜、超净台、酶标仪。

本实验中抗菌肽最小抑菌浓度检测采用微量稀释法，检测菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌、绿脓杆菌、痤疮丙酸杆菌。

1)方法：

①LB液体培养基配制：2.5gLB培养基干粉，加100ml蒸馏水，121℃，20分钟高压灭菌，4度储存。

②菌液配制：将各菌种复苏，涂布于HM固体培养基上,放置38℃恒温培养过夜，挑单个菌落培养在新鲜的液体LB培养基中，37℃恒温过夜培养。将LB液体培养基中的5种菌分别用麦氏比浊仪分别将菌的浓度调整为10⁵CFU/ml备用。

③不同浓度抗菌肽溶液配制：将已知浓度的抗菌肽用纯化水溶解0.222um滤膜过滤，再用新鲜配制的LB液体培养基对其进行倍比稀释为浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256ug/ml；

④抑菌实验：在分别将配好的不同浓度抗菌肽LB液体培养基与空白LB培养基分别100ul加入96孔板内，每个浓度3次重复，一孔包的LB液体培养基为阴性对照，单纯的菌液为阳性对照，37度恒温培养箱培养16-18h。置于酶标仪于600nm处测其吸光度。

2)数据处理：在含有抗菌肽作用组的吸光度值与阳性对照吸光度值小于10％时，认为该浓度有抑菌作用。

表1不同浓度抗菌肽对不同细菌的抑制效果

3)结果：抗菌肽在2ug/ml的浓度下对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌、绿脓杆菌有明显的抑制作用。

实施例3抗菌肽对真菌的抑制作用

实验材料：

白色念珠菌，SDB培养基，恒温培养箱，

1)方法：

①沙氏液体培养基配制：5g沙氏液体培养基粉加入100ml蒸馏水，121℃，15分钟高压灭菌，4℃保存备用。

②沙氏固体培养基配制：5g沙氏液体培养基粉加入100ml蒸馏水，121℃，15分钟高压灭菌，4℃保存备用。

③菌液配制：将白色念珠菌复苏，涂布于沙氏固体培养基上,放置30度℃恒温培养过夜，挑单个菌落培养在新鲜用麦氏比浊仪将菌的浓度调整为10⁵CFU/ml备用。

④不同浓度抗菌肽溶液配制：将已知浓度的抗菌肽用纯化水溶解0.22um滤膜过滤，再用新鲜配制的沙氏液体培养基对其进行倍比稀释为浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256ug/ml；

⑤抑菌实验：在分别将配好的不同浓度抗菌肽沙氏液体培养基与空白LB培养基分别100ul加入96孔板内，每个浓度3次重复，一孔的沙氏液体培养基为阴性对照，单纯的菌液为阳性对照，30度恒温培养箱培养16-18h。置于酶标仪于600nm处测其吸光度。

2)数据处理：在含有抗菌肽作用组的吸光度值与阳性对照吸光度值小于10％时，认为该浓度有抑菌作用。

表2不同浓度抗菌肽对真菌的抑菌实验

3)结果：抗菌肽在2ug/ml的浓度下对白色念珠菌有明显的抑制作用。

实施例4抗菌肽对病毒的抑制作用

实验材料：人流感病毒283C-1，MDCK细胞，DMEM培养基，0.25EDTA胰酶，小牛血清，CO2培养箱，DMSO，MTT，微量振荡器。

1)方法：

①MDCK细胞培养：将MDCK细胞复苏种瓶加入10％小牛血清的DMEM培养基中，

②不同浓度抗菌肽溶液配制：用DMEM培养基将已知浓度的抗菌肽配置成40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.313ug/ml，放入4℃备用。

③接种病毒：将MDCK细胞培养于96孔板中，待细胞培养到70％的状态，弃去培养基，每孔加入流感病毒100ul，吸附1.5小时，弃上清，再分别将不同浓度的抗菌肽溶液每孔加入100ul，每孔重复3次；再设置加入DMEM培养基和病毒组为阳性对照，只加培养基的为阴性对照。37℃，CO2培养箱培养72小时。

④MTT检测抗病毒能力：72小时后，弃培养液，每孔加入含0.5mg/mlMTT的DMEM培养基，培养1.5小时，弃上清，再加入150ulDNEM，室温下将培养板置于微量振荡器上振荡10分钟，待结晶完全溶解后，与酶标仪上再490nm处测OD值，计算对病毒抑制率。

2)数据处理：病毒抑制率＝(抗菌肽处理组—染毒组细胞OD值)/(正常组细胞OD值—染毒组细胞OD值)

表3不同浓度抗菌肽对病毒的抑菌率

3)结果：浓度为0.625实验组对病毒有抑制作用，浓度越大抑制作用越强。(见图1)

实施例5

一种体表创面修复抗菌的液体敷料，包括以下组分

抗菌肽质量比1.5％

β葡聚糖质量比65％

己二醇质量比3％

其余为羊膜间充质干细胞外泌体，浓度55ug/ml。

羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。具体方法：用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

将实施例5中的液体敷料直接作用于患者

①一般资料：入选人员标准：选择20-40岁志愿者，为轻度(一级)痤疮患者，

标准：皮损主要为粉刺，总数不超过30个，少有脓包和丘疹寻常，男女不限。

②治疗方法：患者每晚洁面，干燥后，均匀涂抹制备的液体敷料，次晨，清洁面部，治疗期间不可使用其他治疗痤疮的药物。

③疗效观察和评判标准：痊愈，皮损消退＞90％或完全消失，仅留下色素沉着；显著，皮损消退60％～90％；有效，皮损消退30％～59％；无效，皮损消退小于30％或增多。总有效率为痊愈率加显效率。初诊及治疗第2、4、6、8周，复诊记录皮损数和不良反应。

表4患者使用本液体敷料的周期及疗效情况

实施例6

一种体表创面修复抗菌的液体敷料，包括以下组分

抗菌肽质量比2％

β葡聚糖质量比70％

己二醇质量比3％

其余为羊膜间充质干细胞外泌体，浓度70ug/ml。

羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。具体方法：用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

将实施例6中的液体敷料直接作用于患者

①一般资料：入选人员标准：选择20-40岁志愿者，为轻中度(二级)痤疮患者，标准：皮损总数31-59个，可有中等数量脓包和丘疹，男女不限。

②治疗方法：患者每晚洁面，干燥后，均匀涂抹制备的液体敷料，次晨，清洁面部，治疗期间不可使用其他治疗痤疮的药物。

③疗效观察和评判标准：痊愈，皮损消退＞90％或完全消失，仅留下色素沉着；显著，皮损消退60％～90％；有效，皮损消退30％～59％；无效，皮损消退小于30％或增多。总有效率为痊愈率加显效率。初诊及治疗第2、4、6、8周，复诊记录皮损数和不良反应。

表5患者使用本液体敷料的周期及疗效情况

实施例7

一种体表创面修复抗菌的液体敷料，包括以下组分

抗菌肽质量比3％

β葡聚糖质量比75％

己二醇质量比3％

其余为羊膜间充质干细胞外泌体，浓度80ug/ml。

羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。具体方法：用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

将实施例7中的液体敷料直接作用于患者

①一般资料：入选人员标准：选择20-40岁志愿者，均为寻常痤疮患者，男女不限，痤疮严重程度分级：轻度(一级)，皮损主要为粉刺，总数不超过30个，少有脓包和丘疹；轻中度(二级)，皮损总数31-59个，可有中等数量脓包和丘疹；中度(三级)，皮损60-100个，可广泛分布脓包和丘疹，偶见炎性损伤，少量结节；重度(四级)，皮损100以上，伴有结节和囊肿且3个以上，主要为结节，囊肿或痤疮。

②治疗方法：患者每晚洁面，干燥后，均匀涂抹制备的液体敷料，次晨，清洁面部，治疗期间不可使用其他治疗痤疮的药物。

③疗效观察和评判标准：痊愈，皮损消退＞90％或完全消失，仅留下色素沉着；显著，皮损消退60％～90％；有效，皮损消退30％～59％；无效，皮损消退小于30％或增多。总有效率为痊愈率加显效率。初诊及治疗第2、4、6、8周，复诊记录皮损数和不良反应。

表6患者使用本实施例的液体敷料的疗效情况

结论：本液体敷料，对不同程度的痤疮患者疗效不同，对于轻度患者治疗有效率高达90％，在轻中度患者中有效率可达70％以上，中度患者效果不明显。

以上数据可见，此液体敷料对轻度及轻中度患者有的显著的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种体表创面抗菌修复的液体敷料，其特征在于：包括如下质量百分比的原料组分：

抗菌肽 0.5％～5％，

β葡聚糖 40％～80％，

己二醇 2％～6％，

其余为，浓度在50-90ug/ml之间的羊膜间充质干细胞外泌体。

2.一种制备如权利要求1所述的体表创面抗菌修复的液体敷料的方法，其特征在于：所述羊膜间充质干细胞外泌体制备方法为：从羊膜中分离得到细胞，经过原代和传代细胞培养。

3.根据如权利要求2所述的制备体表创面抗菌修复的液体敷料的方法，其特征在于：所述的羊膜间充质干细胞外泌体制备方法具体为：

用组织剪剪去胎盘外圈绒毛膜，用止血钳将羊膜剥离，取距离脐带较近范围的羊膜，并剪成1cm²的组织块，洗净后，分别用胰蛋白酶消化和胶原酶消化，获得细胞，加入已添加血清替代物、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养；每3天进行换液，待细胞融合达到70-80％时，用胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3-P5代，后更换无外泌体及血清的培养基培养24小时，收集上清，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌体。

4.如权利要求1中所述体表创面抗菌修复的液体敷料用于轻中度痤疮的治疗和/或预防。

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