CN111632075A - 一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法，属于干细胞技术领域。一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，包括以下质量份成分：30～50份干细胞外泌体提取物、10～20份占芭花提取液、10～20份金缕梅提取物、10～20份洋甘菊提取物。其制备方法简单，将各原料按质量份比例混合均匀即可。本发明通过添加干细胞外泌体及占芭花、洋甘菊、金缕梅、海藻酸盐等成分，加速创面止血，促进损伤组织修复、皮肤再生；同时抗炎抑菌、止痒、保湿。具有产品效果好、见效快、使用方便、对皮肤黏膜无刺激性，安全可靠，不留瘢痕的特点。

Description

一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法。

背景技术

外泌体，是细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制产生并通过主动分泌作用排除细胞外的囊性小泡，其本质是脂质双分子层。外泌体内含有miRNA以及各种分子蛋白，参与调解细胞各项生理功能。外泌体能够借助携带的蛋白质和miRNA等生物活性物质用用街道干细胞的治疗效力，在多种疾病的治疗中发挥作用。研究表明，外泌体具有抑制炎症，促进皮肤细胞增殖和血管再生，减少肌成纤维细胞积累的作用，通过旁分泌方式修复损伤，给皮肤损伤治疗提供了新方法。

皮肤创伤是日常生活碰到的伤害，特别是不同程度的皮肤烧烫伤。这类创伤皮肤愈合过程慢，如果处理不当容易造成感染，而且容易形成瘢痕，影响美观，给人们带来极大的困扰。现有一些治疗烧烫伤、外伤等的产品，大多数只是起到镇痛消炎的效果，皮肤损伤愈合慢，后期容易留疤。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种不留瘢痕、抗菌消炎、见效快的促进皮肤创面愈合的外泌体制剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，包含以下质量份原料：干细胞外泌体提取物30～50份、占芭花提取液10～20份、金缕梅提取液10～20份、洋甘菊提取液10～20份。

干细胞外泌体提取物中的外泌体可促进正常和创面的成纤维细胞的生长和迁移，并作用于内皮细胞从而诱导血管的生成，此外，外泌体内含有多种调节信号，传递到细胞后能够激活相应的信号通路(如AKT、ERK1/2和STAT3等)，从而诱导多种营养因子(如bFGF、IGF、VEGF等)表达，促进损伤组织修复。

占芭花提取液、洋甘菊提取液和金缕梅提取液等天然植物精华，内含多种芳香醇类化合物，具有抗炎抑菌、止痒、保湿和抗氧化的功效。

优选的，所述皮肤创面愈合的外泌体制剂，包含以下质量份原料：干细胞外泌体提取物40份、占芭花提取液15份、金缕梅提取液15份、洋甘菊提取液15份、尿囊素0.5份、海藻酸盐0.05份。

优选配比的外泌体制剂，在兼顾抗炎、止痒、保湿功效的同时具有极佳的创面修复效果。

优选的，所述干细胞外泌体提取物包括间充质干细胞外泌体和间充质干细胞培养上清液。

优选的，所述干细胞外泌体提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按照GMP进行细胞培养，获得间充质干细胞；

(2)将步骤(1)所得的间充质干细胞超声破碎，获得间充质干细胞外泌体；

(3)收集步骤(1)中间充质干细胞的上清液，获得干细胞培养上清液外泌体；

(4)将步骤(2)所得的间充质干细胞外泌体与步骤(3)所得的干细胞培养上清液外泌体分别溶于生理盐水，等体积混合搅拌均匀及获得干细胞外泌体提取物。

优选的，所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂还包括下述质量份的组分：尿囊素0.2～1份、海藻酸盐0.05～1份、PEG-40氢化蓖麻油1～5份、透明质酸0.05～0.1份、丁二醇1～5份、羟苯甲酯0.1～0.3份、羟乙基纤维素0.1～1份、EDTA-二钠0.05～0.1份、去离子水4～33份。

海藻酸盐具有吸收大量液体的能力，可以在伤口表面形成一层稳定的藻酸钠网状凝胶，使创面维持一个湿润的环境，从而有利于伤口的愈合和皮肤的再生，而且可以加速创面止血；尿囊素具有促进细胞生长，加快伤口愈合的功效，是一种很好的治疗皮肤损伤的活性剂成分。

优选的，所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂还包括下述质量份的组分：尿囊素0.5份、海藻酸盐0.05份、PEG-40氢化蓖麻油5份、透明质酸0.05份、丁二醇4份、羟苯甲酯0.1份、羟乙基纤维素0.5份、EDTA-二钠0.05份、去离子水4.75份。

优选的，所述海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸铵中的至少一种。

优选的，所述占芭花提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取占芭花鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到占芭花提取液。

优选的，所述金缕梅提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取金缕梅鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到金缕梅提取液。

优选的，所述洋甘菊提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取洋甘菊鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即可制得洋甘菊提取液。

上述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

S1按比例取尿囊素、海藻酸盐、透明质酸、EDTA-二钠、在去离子水中溶解，搅拌混合均匀；

S2向步骤S1所得溶液中按比例加入丁二醇、羟苯甲酯、羟乙基纤维素，搅拌混合均匀；

S3向步骤S2所得溶液中加入占芭花提取液、金缕梅提取液、洋甘菊提取液、PEG-40氢化蓖麻油，搅拌混合均匀；

S4向步骤S3所得溶液中加入干细胞外泌体提取物，搅拌混合均匀即可制得成品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其包含干细胞外泌体提取物作用于皮下成纤维细胞，注重对成纤维细胞增殖修复和周围血管微环境改善；通过添加占芭花提取物，金缕梅提取物等天然植物成分及营养物质，起到良好的抗炎抑菌、保湿、美白等皮肤调理作用，从而达到促进皮肤损伤修复的效果，见效快，使用后不留瘢痕。

(2)本发明使用的所有原料均为食品级，不含抗生素和激素，不会产生毒副作用。

附图说明

图1为对损伤皮肤使用本发明外泌体制剂15日前后对比图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的，技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，包括以下质量份的原料：干细胞外泌体提取物30份、占芭花提取液10份、金缕梅提取物10份、洋甘菊提取物10份、尿囊素0.2份、海藻酸盐0.05份、PEG-40氢化蓖麻油5份、透明质酸0.05份、丁二醇4份、羟苯甲酯0.1份、羟乙基纤维素0.1份、EDTA-二钠0.1份和去离子水33份。

上述干细胞外泌体提取物的制备方法包括下步骤：

(1)按照GMP进行细胞培养，使用细胞工厂设备扩增间充质干细胞，待到细胞融合率达95％以上时即可收获得到3×10⁸的间充质干细胞；

(2)将步骤(1)所得的间充质干细胞超声破碎，按1×10⁸细胞数量加入100ml生理盐水中，在4℃、300×g条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清；然后在4℃、2500×g条件下离心30min去除细胞凋亡小体，收集上清；接着在4℃、13000×g条件下离心1h去除血小板杂质，收集上清；最后在4℃、100000×g条件下离心70min即可得到破碎后间充质干细胞外泌体；

(3)将步骤(1)所述的间充质干细胞在4℃、2000×g条件下离心10min去除细胞碎片，收集上清；接着在4℃、13000×g条件下离心1h去除血小板杂质，收集上清；最后在4℃、100000×g条件下离心70min即可制得干细胞培养上清液；

(4)将步骤(2)所得的间充质干细胞外泌体与步骤(3)所得的干细胞培养上清液外泌体分别溶于生理盐水，等体积混合搅拌均匀，使终蛋白溶液的浓度为50mg/ml，获得干细胞外泌体提取物。

上述占芭花提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取占芭花鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到占芭花提取液；

上述金缕梅提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取金缕梅鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到金缕梅提取液；

上述洋甘菊提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取洋甘菊鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即可制得洋甘菊提取液。

上述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂的制备方法包括以下步骤：

S1按比例取尿囊素、海藻酸盐、透明质酸、EDTA-二钠、在去离子水中溶解，搅拌混合均匀；

S2向步骤S1所得溶液中按比例加入丁二醇、羟苯甲酯、羟乙基纤维素，搅拌混合均匀；

S3向步骤S2所得溶液中按比例加入占芭花提取液、金缕梅提取液、洋甘菊提取液、PEG-40氢化蓖麻油，搅拌混合均匀；

S4向步骤S3所得溶液中按比例加入干细胞外泌体提取物，搅拌混合均匀即可制得成品。

实施例2：

一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，包括以下质量份的原料：干细胞外泌体提取物30份、占芭花提取液20份、金缕梅提取物20份、洋甘菊提取物20份、尿囊素0.3份、海藻酸盐0.08份、PEG-40氢化蓖麻油2份、透明质酸0.08份、丁二醇1份、羟苯甲酯0.1份、羟乙基纤维素0.5份、EDTA-二钠0.05份和去离子水4份。

按照实施例1中的制备方法制得干细胞外泌体提取物、占芭花提取液、北美金缕梅提取物和洋甘菊提取物。

上述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂的制备方法包括以下步骤：

S1按比例取尿囊素、海藻酸盐、透明质酸、EDTA-二钠、在去离子水中溶解，搅拌混合均匀；

S2向步骤S1所得溶液中按比例加入丁二醇、羟苯甲酯、羟乙基纤维素，搅拌混合均匀；

S3向步骤S2所得溶液中按比例加入占芭花提取液、金缕梅提取液、洋甘菊提取液、PEG-40氢化蓖麻油，搅拌混合均匀；

S4向步骤S3所得溶液中按比例加入干细胞外泌体提取物，搅拌混合均匀即可制得成品。

实施例3：

一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，包括以下质量份的原料：干细胞外泌体提取物50份、占芭花提取液10份、金缕梅提取物10份、洋甘菊提取物10份、尿囊素1份、海藻酸盐1份、PEG-40氢化蓖麻油1份、透明质酸0.1份、丁二醇5份、羟苯甲酯0.3份、羟乙基纤维素1份、EDTA-二钠0.1份和去离子水11份。

按照实施例1中的制备方法制得干细胞外泌体提取物、占芭花提取液、北美金缕梅提取物和洋甘菊提取物。

上述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂的制备方法包括以下步骤：

S1按比例取尿囊素、海藻酸盐、透明质酸、EDTA-二钠、在去离子水中溶解，搅拌混合均匀；

S2向步骤S1所得溶液中按比例加入丁二醇、羟苯甲酯、羟乙基纤维素，搅拌混合均匀；

S3向步骤S2所得溶液中按比例加入占芭花提取液、金缕梅提取液、洋甘菊提取液、PEG-40氢化蓖麻油，搅拌混合均匀；

S4向步骤S3所得溶液中按比例加入干细胞外泌体提取物，搅拌混合均匀即可制得成品。

实验例1：理化指标

性状：本品为略呈淡黄色、透明澄清、略带稠度的乳液。

质量检测：随机抽样于4～25℃温度下保存，在保存后的1、3、6、9及12个月，分别从观察颜色、澄明度、气味各方面感官评价均未发生有明显变化，表明本品拆封使用后在12个月内性质是稳定的。

皮肤斑贴试验检测：选用合格斑贴材料，将样品和空白对照组均贴于受试者的前臂曲侧，持续24h。去除斑贴器后间隔30min，待压痕消失后观察皮肤反应，斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。皮肤不良反应分级标准见表1。通过斑贴试验结果可以表明产品中的成分没有造成过敏之类的不良反应。

表1皮肤不良反应分级

实验例2：皮肤损伤愈合效果试验

一般性资料：

以2019年1月～2019年12月间在使用本制剂的受试者60例为观察对象，随机分为试验组30例(男性17例，女性13例)和对照组30例(男性15例，女性15例)。两组间年龄、性别及烧烫伤部位、面积等资料比较差异均无显著性意义(P>0.05)。

方法：

试验组：(1)清创及创面清洁：以1：2000氯已定溶液清洗并移除创面异物，如有水疱，先将水疱引流，然后用0.9％生理盐水冲洗创面。(2)取本品适量直接涂于创面，视创面大小及部位可覆以无菌纱布并适当包扎，也可直接暴露。每日早晚使用2次。分别于第1、3、7、15日观察创面愈合情况(中途得到治愈者可停止使用)。

对照组：清创方法同上，晾干后取适量碘伏直接涂于创面，视创面大小及部位可覆以无菌纱布并适当包扎，也可直接暴露。同样地，每日早晚使用2次。分别于第1、3、7、15日观察创面愈合情况(中途得到治愈者可停止使用)。

观察指标：

(1)烧烫伤疗效综合判定标准。痊愈：烧烫伤创面完全或基本愈合，临床症状完全消失。显效：烧烫伤创面90％以上愈合，多数临床症状消失。有效:烧烫伤创面部分愈合，部分临床症状有改善。无效：烧烫伤创面及临床症状均未见改善。

(2)创面愈合率计算：分别在第1、3、7、15日将创面大小描印于透明薄膜上，测算其面积，然后计算伤口愈合率。从而客观评价作用效果。其中公式：创面愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。

(3)温哥华瘢痕量表(Vancouver scar scale，VSS)评分：主要用于评定患者增生性瘢痕，包括瘢痕色泽、柔软度、血管分布以及厚度4个维度，总分15分，瘢痕越严重者分值越高。

本次治疗数据采集严格按照统计学原则并用软件SPSS17.0分析处理，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结果：

1、两组总体疗效比较

表2两组受试者总体疗效比较

上表结果表明，试验组受试者的治疗总显效率为93.34％，高于对照组患者的治疗总显效率，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2、两组痊愈时间比较

表3两组受试者痊愈时间比较

从表3可以看得出，试验组均能明显缩短痊愈患者所需的时间，与对照组比较，差异有统计学意义：P<0.05。

3、两组创面一般性观察

表4两组受试者第1，3，7，15日愈合情况

4、两组创面愈合率比较

表5两组创面愈合率比较

	试验组	对照组
			第1天	(3.28±2.77)％	0
第3天	(33.75±1.51)％	(16.73±3.57)％
			第7天	(70.86±2.62)％	(39.94±2.61)％
第15天	(95.36±2.50)％	(52.63±3.61)％

上表结果表明，在各时点试验组与对照组创面愈合率相比差异均有显著性，且各时间点间相比均有显著性差异。

5、两组创面愈合后瘢痕形成率评分

表6两组治疗后VSS评分比较(分)

组别	例数	色泽	柔软度	血管分布	厚度
						试验组	30	1.42±0.18	1.38±0.16	1.64±0.18	1.50±0.17
对照组	30	1.85±0.21	2.25±0.24	2.01±0.25	1.92±0.22

两组受试者在治疗15天后，试验组受试者创面皮肤色泽、柔软度、血管分布以及厚度评分均显著低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

6、使用后创面前后对比实例

图1A为烫伤后皮肤损伤情况，图1B为使用本发明产品15天后皮肤损伤愈合效果。可见在使用本发明的产品后皮肤愈合效果极好，无瘢痕，表面光滑。

综上所述，本产品具有很好的烧伤创面愈合治疗效果，使用时感觉温和舒适不油腻，用后2周即可看出明显疗效。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，包含以下质量份原料：干细胞外泌体提取物30～50份、占芭花提取液10～20份、金缕梅提取液10～20份、洋甘菊提取液10～20份。

2.根据权利要求1所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，包含以下质量份原料：干细胞外泌体提取物40份、占芭花提取液15份、金缕梅提取液15份、洋甘菊提取液15份。

3.根据权利要求1或2所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，所述干细胞外泌体提取物包括间充质干细胞外泌体和间充质干细胞培养上清液。

4.根据权利要求3所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，所述干细胞外泌体提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照GMP进行细胞培养，获得间充质干细胞；

(2)将步骤(1)所得的间充质干细胞超声破碎，获得间充质干细胞外泌体；

(3)收集步骤(1)中间充质干细胞的上清液，获得干细胞培养上清液外泌体；

(4)将步骤(2)所得的间充质干细胞外泌体与步骤(3)所得的干细胞培养上清液外泌体分别溶于生理盐水，等体积混合搅拌均匀及获得干细胞外泌体提取物。

5.根据权利要求1所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，还包括下述质量份的组分：尿囊素0.2～1份、海藻酸盐0.05～1份、PEG-40氢化蓖麻油1～5份、透明质酸0.05～0.1份、丁二醇1～5份、羟苯甲酯0.1～0.3份、羟乙基纤维素0.1～1份、EDTA-二钠0.05～0.1份、去离子水4～33份。

6.根据权利要求5所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，还包括下述质量份的组分：尿囊素0.5份、海藻酸盐0.05份、PEG-40氢化蓖麻油5份、透明质酸0.05份、丁二醇4份、羟苯甲酯0.1份、羟乙基纤维素0.5份、EDTA-二钠0.05份、去离子水4.75份。

7.根据权利要求5或6所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，所述海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸铵中的至少一种。

8.根据权利要求1所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂，其特征在于，所述占芭花提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取占芭花鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到占芭花提取液；

所述金缕梅提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取金缕梅鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即得到金缕梅提取液；

所述洋甘菊提取液的制备方法，包括以下步骤：

(1)取洋甘菊鲜花，第一次加入18倍量的65％乙醇，提取1.5小时；第二次加10倍60％乙醇，提取1.5小时；第三次加8倍60％乙醇，提取1.5小时；(2)将3次提取的提取液分别用纱布过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至占芭花重量的5倍，即可制得洋甘菊提取液。

9.根据权利要求1～8任意一项所述促进皮肤创面愈合的外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1按比例取尿囊素、海藻酸盐、透明质酸、EDTA-二钠、在去离子水中溶解，搅拌混合均匀；

S2向步骤S1所得溶液中按比例加入丁二醇、羟苯甲酯、羟乙基纤维素，搅拌混合均匀；

S3向步骤S2所得溶液中按比例加入占芭花提取液、金缕梅提取液、洋甘菊提取液、PEG-40氢化蓖麻油，搅拌混合均匀；

S4向步骤S3所得溶液中按比例加入干细胞外泌体提取物，搅拌混合均匀即可制得成品。

10.一种权利要求1～8所述的促进皮肤创面愈合的外泌体制剂在制备皮肤损伤修复产品、创面修复产品或医疗美容产品中的应用。

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