CN111560414A - 一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基 - Google Patents

一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵培养技术领域，具体涉及一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，所述发酵培养基中含有碳源，氮源和磷源，还添加了糖蜜作为提供生物素及泛酸的来源，还添加了氯化钙替代氯化钠作为无机盐来源。本发明既能提高去甲基金霉素效价又能降低杂质去甲基四环素含量，并且高效、简单、低成本。

Description

一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基
技术领域
本发明属于发酵培养技术领域，具体涉及一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基。
背景技术
去甲基金霉素是一种四环类抗生素，英文名称为demethylchlortetracycline，特点是作用强度比四环素和土霉素要强，比金霉素要稳定。作为四环类抗生素的成员，去甲基金霉素抑菌的机理就是其可特异地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，进而阻止氨基酰-tRNA与该位置的连接，从而使细菌蛋白质延缓或无法合成。临床用于肺炎、***、淋病、细菌性痢疾及小儿猩红热等。除临床医学使用以外，去甲基金霉素还是合成米诺环素和替加环素的前体，是生物发酵抗生素中重要的一员。去甲基金霉素的产量问题，以及去甲基金霉素发酵过程中杂质去甲基四环素较高的的问题比较突出，但是目前国外和国内现有的发酵培养基只能顾全一方面，而不能对去甲基金霉素产量提高和降低杂质去甲基四环素的问题双管齐下。根据美国专利US3050446(1962年)的报道，添加硫酸铜可以降低杂质去甲基四环素，虽然随着硫酸铜添加量的不断加大，杂质去甲基四环素的含量会随之减少，但去甲基金霉素效价也随之减少，而且硫酸铜属于重离子，对人体健康有一定危害性。根据美国专利US3145154(1964)的报道，在去甲基金霉素发酵培养基中添加D-甲硫氨酸可以降低杂质去甲基四环素的含量。当添加0.5％D-甲硫氨酸到发酵培养基时，杂质去甲基四环素与去甲基金霉素比例从原来不添加时的12％降低到3％，但去甲基金霉素效价却从原来不添加时的5360ug/ml降低到4930ug/ml。从经济方面来看，D-甲硫氨酸价格要比大宗原料昂贵，会大大提高发酵的运行成本。中国专利CN201310575478.2公开了一种利用生产去甲基金霉素的培养基和培养方法，去甲基金霉素发酵周期为180h，发酵效价为13000mg/L,但其去甲基金霉素发酵工艺是三级发酵，并且培养基中含有鱼油等动物源原料，根据兽药GMP要求，其培养基难以在工业上得到应用。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种既能提高去甲基金霉素效价又能降低杂质去甲基四环素含量的高效、简单、低成本的去甲基金霉素发酵培养基。
本发明还提供了一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，所述发酵培养基中含有碳源，氮源和磷源，还添加了糖蜜作为提供生物素及泛酸的来源，还添加了氯化钙替代氯化钠作为无机盐来源。
所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉60g/L、糖蜜0.5-1.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙2-4g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。。
所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜0.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙2g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜1g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙3g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜1.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙4g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
本发明的有益效果为：本发明中首次在去甲基金霉素的发酵培养基中添加糖蜜作为提供生物素及泛酸的来源，因为糖蜜中含有大量的生物素和泛酸。辅酶A羧基转移酶是产生去甲基金霉素前体丙二酸的主要酶，而辅酶A羧基转移酶属于羧酸转移酶的一种以酰基辅酶A为二氧化碳的接受者，而它的主要辅酶是生物素，而泛酸是辅酶A的主要成分，所以提供大量生物素和泛酸可以提高辅酶A羧基转移酶和辅酶A的含量，从而提高前体的产生，从而提高去甲基金霉素的含量。本发明中还首次在去甲基金霉素的发酵培养基中使用氯化钙代替氯化钠添加到去甲基金霉素发酵培养基中，既能提高去甲基金霉素效价又能降低杂质去甲基四环素含量。由于氯化钙是可溶性盐类，钙离子可以完全溶于水中，可被微生物直接利用。钙离子属于第二信使分子，对于微生物，特别是链霉菌具有重要的调节作用，比如钙离子对一些链霉菌有促进气生菌丝生长的作用，激活钙调蛋白的作用。本发明发现钙离子对去甲基金霉素产生菌金黄色链霉菌的前期形态分化和生理分化有这至关重要的影响。在金黄色链霉菌培养初期，钙离子可以促使金黄色链霉菌菌丝形态及体内代谢途径更加有利于后期去甲基金霉素的合成，同时钙离子又可以加强去甲基金霉素基因簌的表达，使后期去甲基金霉素合成酶的活力增强及浓度增高，从而使去甲基金霉素的效价单位得到提升和杂质去甲基四环素的含量降低。在发酵培养基的碳酸钙是不溶于水的无机盐，在前期发酵过程中，金黄色链霉菌无法利用碳酸钙所含的钙离子，无法促进金黄色链霉菌的前期形态分化和生理分化，从而起不到促进后期去甲基金霉素合成的作用。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细描述：
由于种子培养基与培养条件，发酵培养条件都采用业内公开的技术，下面所诉实例中采用统一的种子培养基与培养条件，和发酵瓶培养条件，以便更加直观的表现出本发明发酵培养基的效果。
种子培养基的组分和配比(g/L)：淀粉30、高温豆粉25、蛋白胨10、硫酸铵2、磷酸氢二钾1.5、玉米油10、碳酸钙8、a-淀粉酶0.05g/L、PH自然。
用本公司产去甲基金霉素的金黄色链霉菌的细胞库沙土搭一只茄瓶斜面，待茄瓶斜面成熟之后，取2cm的斜面孢子接入装有40ml种子培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期48小时。取2ml成熟的种子培养液接入10个装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期168小时。待发酵终止后，用高压液相色谱法测定去甲基金霉素和去甲基四环素的含量，并取10个发酵瓶数据的平均值。
实例1
a配制发酵培养基：称取玉米淀粉28g、糖蜜0.2g、高温豆粉14g、玉米油10g、玉米浆6g、碳酸钙2.2g、氯化钙0.8g、硫酸铵0.48g、磷酸二氢钾0.06g、L-赖氨酸盐2g、a-淀粉酶0.002g。先将淀粉糊化，加入淀粉酶，冷却待用，再将其他成分溶于纯化水中，最后将两部分料液合并，定容到400ml，ph调至5.5，平均分装到10个250ml摇瓶中，于121℃灭菌30min，冷却到室温待用。
b取2ml成熟的种子培养液接入10个装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期168小时。待发酵终止后，用高压液相色谱法测定去甲基金霉素和去甲基四环素的含量，并取10个发酵瓶数据的平均值，具体数据见下表：
Figure BDA0002513778580000051
实例2
a配制发酵培养基：称取玉米淀粉28g、糖蜜0.4g、高温豆粉14g、玉米油10g、玉米浆6g、碳酸钙2.2g、氯化钙1.2g、硫酸铵0.48g、磷酸二氢钾0.06g、L-赖氨酸盐2g、a-淀粉酶0.002g。先将淀粉糊化，加入淀粉酶，冷却待用，再将其他成分溶于纯化水中，最后将两部分料液合并，定容到400ml，ph调至5.5，平均分装到10个250ml摇瓶中，于121℃灭菌30min，冷却到室温待用。
b取2ml成熟的种子培养液接入10个装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期168小时。待发酵终止后，用高压液相色谱法测定去甲基金霉素和去甲基四环素的含量，并取10个发酵瓶数据的平均值，具体数据见下表：
Figure BDA0002513778580000052
Figure BDA0002513778580000061
实例3
a配制发酵培养基：称取玉米淀粉28g、糖蜜0.6g、高温豆粉14g、玉米油10g、玉米浆6g、碳酸钙2.2g、氯化钙1.6g、硫酸铵0.48g、磷酸二氢钾0.06g、L-赖氨酸盐2g、a-淀粉酶0.002g。先将淀粉糊化，加入淀粉酶，冷却待用，再将其他成分溶于纯化水中，最后将两部分料液合并，定容到400ml，ph调至5.5，平均分装到10个250ml摇瓶中，于121℃灭菌30min，冷却到室温待用。
b取2ml成熟的种子培养液接入10个装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期168小时。待发酵终止后，用高压液相色谱法测定去甲基金霉素和去甲基四环素的含量，并取10个发酵瓶数据的平均值，具体数据见下表：
Figure BDA0002513778580000062
实例4
a配制发酵培养基：称取玉米淀粉28g、高温豆粉14g、玉米油10g、玉米浆6g、碳酸钙2.2g、硫酸铵0.48g、磷酸二氢钾0.06g、L-赖氨酸盐2g、a-淀粉酶0.002g。先将淀粉糊化，加入淀粉酶，冷却待用，再将其他成分溶于纯化水中，最后将两部分料液合并，定容到400ml，ph调至5.5，平均分装到10个250ml摇瓶中，于121℃灭菌30min，冷却到室温待用。
b取2ml成熟的种子培养液接入10个装有40ml发酵培养基的250ml摇瓶中，培养温度28度，摇床转速200rpm，培养周期168小时。待发酵终止后，用高压液相色谱法测定去甲基金霉素和去甲基四环素的含量，并取10个发酵瓶数据的平均值，具体数据见下表：
Figure BDA0002513778580000071
上述实例1至实例3时利用本发明的发酵液培养基，实例4是用现有技术的发酵培养基，从数据上看，可以明显看出利用本发明的发酵培养基的效价要比现有技术发酵培养基高出40％左右，而且杂质去甲基四环素含量降低至1.5％左右。

Claims (5)

1.一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，所述发酵培养基中含有碳源，氮源和磷源，其特征在于，还添加了糖蜜作为提供生物素及泛酸的来源，还添加了氯化钙替代氯化钠作为无机盐来源。
2.根据权利要求1所述的一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉60g/L、糖蜜0.5-1.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙2-4g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。。
3.根据权利要求2所述的一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜0.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙2g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
4.根据权利要求2所述的一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜1g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙3g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
5.根据权利要求2所诉的一种用于生产去甲基金霉素的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：玉米淀粉70g/L、糖蜜1.5g/L、高温豆粉35g/L、玉米油25g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙5.5g/L、氯化钙4g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸二氢钾0.15g/L。L-赖氨酸盐7g/L、a-淀粉酶0.05g/L。
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