CN111187739A - 一种复合微生物制剂及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其培养方法与应用。本发明采用混合培养技术，将酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母菌种分别经活化、液体菌种培养、复合菌种培养和成品培养，得到复合微生物制剂，该制剂可用于生猪养殖，具有促生长、助消化、抗疾病、增加动物体重、降低饲料消耗等效果。该制备方法提高了微生物的生物量和生理代谢功能；弥补单独培养代谢上的不足，利用共生、偏利共生等促进复合微生物的生长，与传统的纯培养技术相比具有许多明显优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其培养方法与应用。
背景技术
混合培养是指2种或2种以上的微生物培养，是纯培养技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组，却可取得类似效果的新型培养技术。人类对微生物的利用经历了天然混合培养到纯培养两个阶段，纯培养使研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究，从而丰富了我们对微生物形态结构，生理和遗传特性的认识。但是，在长期的实验和生产实践中，人们又发现很多重要生化过程单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。多种微生物混合培养已成为目前微生物制剂研究中的一项重要内容，将几种具有不同功能和具有互生或共生关系的微生物以适当的比例进行混合培养所配制的复合微生物制剂应用于种植、养殖、环保等方面，可以调节生态平衡，保护生态环境。随着现代工农业生产的飞速发展及其产业结构的不断升级，微生物混合培养在推动国民经济增长、改善环境、研制新药物等方面有着巨大的经济和科研价值。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种复合微生物制剂的培养方法，该培养方法以多种微生物按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得最佳应用效果。
本发明的另一目的在于提供上述培养方法培养得到的复合微生物制剂。
本发明的再一目的在于提供上述复合微生物制剂的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种复合微生物制剂的培养方法，包含如下步骤：
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别进行多次活化，得到嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种等质量比接种至液体培养基中，37℃厌氧培养2～3天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种接种，至液体培养基中37℃厌氧培养2～3天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种等质量比接种至液体培养基中，摇床转速150～200r/min、温度30～35℃培养1～2天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种接种至液体培养基中，60℃钨丝灯光照、30～35℃厌氧培养5～7天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种等质量比接种至液体培养基中，摇床转速150～200r/min、温度28～30℃培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至发酵培养基1中，摇床转速150～200r/min、温度30℃培养1～2天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30～35℃下厌氧培养3～5天，得到复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比(质量比)为5:4:3:3:5；总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种按重量百分比5～8％的接种量接种至发酵培养基2中，28～30℃密闭发酵7～15天，获得复合微生物制剂的成品；其中，该步骤发酵培养基不用灭菌；
步骤(1)中所述的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母的菌株分别为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC 6083、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC21790、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CICC 6166、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CICC 24434、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC1.10257、沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)CGMCC 1.8929、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.3973、产朊假丝酵母(Candida utilis)CGMCC2.3047；
步骤(1)中所述的多次活化的具体操作优选为：将冷冻保藏的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母菌株进行三次斜面活化，然后再进行平板纯化培养，最后进行斜面培养，得到嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母菌种；
所述的斜面活化、平板纯化培养或斜面培养的条件优选为：
嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养2～3天，
两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3～5天，
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养1～2天；
沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照30～35℃厌氧培养5～7天；
啤酒酵母或产朊假丝酵母28～30℃好氧培养2天；
步骤(2)①所述的液体培养基(乳酸菌)每一升包含如下组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、碳酸钙20克、番茄汁20mL，土豆汁30mL，胡萝卜汁60mL，维生素C2克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH6.8；
步骤(2)②所述的液体培养基(两歧双歧杆菌)每一升包含如下组分：蛋白胨15.0克、酵母粉2.0克、葡萄糖20.0克、可溶性淀粉0.5克、氯化钠5.0克、5％半胱氨酸10.0mL、西红柿浸出液400.0mL、吐温80 1.0mL、肝提取液80.0mL、弱碱性小分子还原水补至1000ml，pH7.0；
步骤(2)③所述的液体培养基(芽孢杆菌)每一升包含如下组分：葡萄糖30克、酵母膏15克、磷酸氢二钠2克、磷酸二氢钠1克、弱碱性小分子还原水补至1000mL、pH7.2；
步骤(2)④所述的液体培养基(沼泽红假单胞菌)每一升包含如下组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH7.0～7.2；
步骤(2)⑤所述的液体培养基(酵母菌)每一升包含如下组分：红糖50克、酵母膏20克、硫酸铵1克、氯化钾2克、pH自然，弱碱性小分子还原水补至1000mL；
步骤(3)中所述的发酵培养基1包含如下按质量百分比计的组分：
工业用废糖蜜5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、香蕉多糖1％、氯化铵0.1％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％、弱碱性小分子还原水补足100％；
步骤(4)中所述的发酵培养基2包含如下按质量百分比计的组分：工业用废糖蜜5～8％、香蕉多糖0.3％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，弱碱性小分子还原水补足100％；
步骤(4)中所述的密闭发酵的具体操作优选为：
①将培养容器、配制培养基相关的容器清洗干净并用酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)消毒；
②按照配比称取发酵培养基的组分(香蕉多糖、氯化铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁等)加入容器1中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
③按照配比称取工业用废糖蜜加入容器2中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
④将步骤②制得的溶液和步骤③制得的溶液加入到培养容器中，然后加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的80％；
⑤将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种摇匀后，按重量百分比5～8％的接种量(相对于培养基总量)接种至培养容器中；
⑥接种后，在培养容器中加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的100％，搅拌均匀，28～30℃密闭发酵7～15天，获得成品复合微生物制剂；
一种复合微生物制剂，通过上述制备方法得到；
所述的复合微生物制剂在生猪养殖等领域中的应用；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明采用混合培养技术(图1)，各种微生物之间相互提供特定的生长营养物；提高微生物的生物量和生理代谢功能；弥补单独培养代谢上的不足，利用共生、偏利共生等促进复合微生物的生长，与传统的纯培养技术相比具有许多明显优点，具体如下：
(1)产率高：许多纯种培养不能完成或只能微弱进行的过程，利用混合培养往往能得到好的效果。
(2)生长速率高：在混合培养时，一种微生物可能产生另一种微生物的生长因子，或产生另一种微生物更容易利用的碳源或氮源。甚至产生的代谢物会改变培养基的pH，使其更适合于另外一种微生物的生长。
(3)混合培养能够利用更广泛的基质：许多发酵的基质是碳水化合物、蛋白质和脂肪的混合物。混合培养由于含有不同的微生物，所含酶系也相应比纯种培养丰富，因此，可利用的底物范围也将扩大。
(4)混合培养中噬菌体感染的概率大大减少，在纯种培养中，细菌常常因噬菌体感染而导致发酵失败。但混合培养时因抗噬菌体的遗传特性较宽，即使某一菌感染噬菌体，也不会导致发酵失败，其他菌同样可以将发酵进行下去。
(5)混合培养时可以完成许多纯培养难以完成或产率很低的发酵过程。
(6)发酵培养基不需要经过消毒可直接用于复合微生物制剂培养，在培养过程中也不需要搅拌，可节省人力物力，从而提高经济效益。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中涉及的酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母的菌株分别为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC 6083、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC21790、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CICC 6166、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CICC 24434、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC1.10257、沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)CGMCC 1.8929、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.3973、产朊假丝酵母(Candida utilis)CGMCC2.3047；
实施例中的酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)是在水中加入0.1％以下的食盐(氯化钠)输入电解槽中电解，在电解槽的阳极处生成的pH2～3、氧化还原电位1100mV以上，活性氯50-70mg的水溶液，是一种高效、速效、广谱、无毒、无刺激、无残留、安全、环保的消毒剂。
实施例中步骤(1)菌种活化培养(斜面活化、平板纯化培养或斜面培养)过程中，各菌株的培养基为常规培养基；
实施例中，步骤(2)中液体菌种培养过程中，培养基组成如下：
嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌的液体培养基每一升包含如下组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05克、碳酸钙20克、番茄汁20mL，土豆汁30mL，胡萝卜汁60mL，维生素C2克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH6.8；
两歧双歧杆菌的液体培养基每一升包含如下组分：蛋白胨15.0克、酵母粉2.0克、葡萄糖20.0克、可溶性淀粉0.5克、氯化钠5.0克、5％半胱氨酸10.0mL、西红柿浸出液400.0mL、吐温80 1.0mL、肝提取液80.0mL、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH7.0；
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的液体培养基每一升包含如下组分：葡萄糖30克、酵母膏15克、磷酸氢二钠2克、磷酸二氢钠1克、弱碱性小分子还原水1000mL、pH7.2；
沼泽红假单胞菌的液体培养基每一升包含如下组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH7.0～7.2；
啤酒酵母、产朊假丝酵母的液体培养基每一升包含如下组分：红糖50克、酵母膏20克、硫酸铵1克、氯化钾2克、pH自然，弱碱性小分子还原水补至1000mL；
步骤(3)中复合菌种培养过程中，培养基组成如下：
发酵培养基1包含如下按质量百分比计的组分：
工业用废糖蜜5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、香蕉多糖1％、氯化铵0.1％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％、弱碱性小分子还原水补足100％；
实施例1
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别在18×180mm试管斜面中活化，活化三次，之后分别接种于90mm培养皿中进行纯化培养，然后再分别在18×180mm试管斜面中培养，得到酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；其中，培养条件具体为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养2天；两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3天、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养2天；沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照30℃厌氧培养7天；啤酒酵母、产朊假丝酵母28℃好氧培养2天。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧混合培养2天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧培养3天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速200r/min、温度35℃，装液量30mL/250mL混合培养1天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；接着于60℃钨丝灯光照35℃厌氧培养5天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速150r/min、温度28℃，装液量25mL/250mL，混合培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至已灭菌的发酵培养基1中，摇床转速200r/min、温度30℃、装液量30mL/250mL培养1天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30℃下厌氧培养5天，得复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比(重量比)为5:4:3:3:5，总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：
①将培养容器、配制培养基相关的容器清洗干净并用酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)消毒；
②按照配比称取发酵培养基的组分香蕉多糖、氯化铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁加入容器1中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
③按照配比称取工业用废糖蜜加入容器2中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
④将步骤②制得的溶液和步骤③制得的溶液加入到培养容器中，溶解培养基和糖蜜的容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证各种成分都加进培养容器中，然后加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的80％；
⑤将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种摇匀后，按重量百分比5％的接种量(相对于培养基总量)接种至培养容器中，量取菌种容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证菌种全部加入培养容器中；
⑥接种后，在培养容器中加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的100％，搅拌均匀后盖上盖子，28℃密闭发酵15天，获得成品复合微生物制剂；其中，发酵培养基的组分为：工业用废糖蜜5wt％、香蕉多糖0.3wt％、氯化铵0.2wt％、氯化钠0.05wt％、磷酸二氢钾0.1wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锌0.025wt％、硫酸亚铁0.025wt％，余量为弱碱性小分子还原水。
实施例2
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别在18×180mm试管斜面中活化，活化三次，之后分别接种于90mm培养皿中进行纯化培养，然后再分别在18×180mm试管斜面中培养，得到酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；其中，培养条件具体为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养3天；两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3天、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养2天；沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照35℃厌氧培养5天；啤酒酵母、产朊假丝酵母28℃好氧培养2天。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧混合培养3天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧培养2天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL混合培养2天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；接着于60℃钨丝灯光照35℃厌氧培养5天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速200r/min、温度30℃，装液量25mL/250mL，混合培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至已灭菌的发酵培养基1中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL培养2天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30℃下厌氧培养3天，得复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比(重量比)为5:4:3:3:5，总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：
①将培养容器、配制培养基相关的容器清洗干净并用酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)消毒；
②按照配比称取发酵培养基的组分香蕉多糖、氯化铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁加入容器1中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
③按照配比称取工业用废糖蜜加入容器2中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
④将步骤②制得的溶液和步骤③制得的溶液加入到培养容器中，溶解培养基和糖蜜的容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证各种成分都加进培养容器中，然后加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的80％；
⑤将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种摇匀后，按重量百分比6％的接种量(相对于培养基总量)接种至培养容器中，量取菌种容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证菌种全部加入培养容器中；
⑥接种后，在培养容器中加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的100％，搅拌均匀后盖上盖子，30℃密闭发酵10天，获得成品复合微生物制剂；其中，发酵培养基的组分为：工业用废糖蜜6％、香蕉多糖0.3wt％、氯化铵0.2wt％、氯化钠0.05wt％、磷酸二氢钾0.1wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锌0.025wt％、硫酸亚铁0.025wt％，余量为弱碱性小分子还原水。
实施例3
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别在18×180mm试管斜面中活化，活化三次，之后分别接种于90mm培养皿中进行纯化培养，然后再分别在18×180mm试管斜面中培养，得到酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；其中，培养条件具体为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养3天；两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3天、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养2天；沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照35℃厌氧培养5天；啤酒酵母、产朊假丝酵母28℃好氧培养2天。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧混合培养3天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧培养2天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL混合培养1.5天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；接着于60℃钨丝灯光照35℃厌氧培养6天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速200r/min、温度30℃，装液量25mL/250mL，混合培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至已灭菌的发酵培养基1中，摇床转速200r/min、温度30℃、装液量30mL/250mL培养1天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30℃下厌氧培养4天，得复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比(重量比)为5:4:3:3:5，总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：
①将培养容器、配制培养基相关的容器清洗干净并用酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)消毒；
②按照配比称取发酵培养基的组分香蕉多糖、氯化铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁加入容器1中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
③按照配比称取工业用废糖蜜加入容器2中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
④将步骤②制得的溶液和步骤③制得的溶液加入到培养容器中，溶解培养基和糖蜜的容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证各种成分都加进培养容器中，然后加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的80％；
⑤将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种摇匀后，按重量百分比8％的接种量(相对于培养基总量)接种至培养容器中，量取菌种容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证菌种全部加入培养容器中；
⑥接种后，在培养容器中加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的100％，搅拌均匀后盖上盖子，30℃密闭发酵7天，获得成品复合微生物制剂；其中，发酵培养基的组分为：工业用废糖蜜6％、香蕉多糖0.3wt％、氯化铵0.2wt％、氯化钠0.05wt％、磷酸二氢钾0.1wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锌0.025wt％、硫酸亚铁0.025wt％，余量为弱碱性小分子还原水。
实施例4
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别在18×180mm试管斜面中活化，活化三次，之后分别接种于90mm培养皿中进行纯化培养，然后再分别在18×180mm试管斜面中培养，得到酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；其中，培养条件具体为：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养3天；两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3天、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养2天；沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照35℃厌氧培养5天；啤酒酵母、产朊假丝酵母28℃好氧培养2天。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧混合培养3天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL；之后置于37℃下厌氧培养2天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速200r/min、温度35℃，装液量30mL/250mL混合培养1.5天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基中，装液量90mL/100mL，接着于60℃钨丝灯光照35℃厌氧培养6天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量25mL/250mL，混合培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至已灭菌的发酵培养基1中，摇床转速150r/min、温度30℃、装液量30mL/250mL培养2天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30℃下厌氧培养5天，得复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比(重量比)为5:4:3:3:5，总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：
①将培养容器、配制培养基相关的容器清洗干净并用酸性氧化电位水(简称酸化消毒水)消毒；
②按照配比称取发酵培养基的组分香蕉多糖、氯化铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁加入容器1中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
③按照配比称取工业用废糖蜜加入容器2中，然后加入弱碱性小分子还原水，使其充分溶解；
④将步骤②制得的溶液和步骤③制得的溶液加入到培养容器中，溶解培养基和糖蜜的容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证各种成分都加进培养容器中，然后加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的80％；
⑤将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种摇匀后，按重量百分比6％的接种量(相对于培养基总量)接种至培养容器中，量取菌种容器用少量的弱碱性小分子还原水洗涤几次以保证菌种全部加入培养容器中；
⑥接种后，在培养容器中加弱碱性小分子还原水至培养基总体积的100％，搅拌均匀后盖上盖子，30℃密闭发酵9天，获得成品复合微生物制剂；其中，发酵培养基的组分为：工业用废糖蜜8wt％、香蕉多糖0.3wt％、氯化铵0.2wt％、氯化钠0.05wt％、磷酸二氢钾0.1wt％、硫酸镁0.05wt％、硫酸锌0.025wt％、硫酸亚铁0.025wt％，余量为弱碱性小分子还原水。
对比实施例1
(1)菌种活化培养：具体方法同实施例2。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，装液量90mL/100m；之后置于37℃下厌氧培养3天，分别得到嗜酸乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液；
②两歧双歧杆菌种子液：具体方法同实施例2；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL培养2天，分别得到枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液；
④沼泽红假单胞菌种子液：具体方法同实施例2；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，摇床转速200r/min、温度30℃，装液量25mL/250mL，培养2天，分别得到啤酒酵母种子液、产朊假丝酵母种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的八种种子液同时接种到已灭菌的发酵培养基1中，摇床转速200r/min、温度30℃、装液量30mL/250mL培养2天，然后30℃下厌氧培养3天，得复合微生物制剂菌种，其中，嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和啤酒酵母、产朊假丝酵母种子液的接种量比为(重量比)5:5:4:3:3:3:5:5；总接种量为重量百分比10％。
对比实施例2
(1)菌种活化培养：具体方法同实施例2。
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种分别用接种环挑取三环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，装液量90mL/100m；之后置于37℃下厌氧培养3天，分别得到嗜酸乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液；
②两歧双歧杆菌种子液：具体方法同实施例2；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL培养2天，分别得到枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液；
④沼泽红假单胞菌种子液：具体方法同实施例2；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种分别用接种环挑取一环接种于已灭菌的液体培养基(各菌株单独培养)中，摇床转速200r/min、温度30℃，装液量25mL/250mL，培养2天，分别得到啤酒酵母种子液、产朊假丝酵母种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的嗜酸乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液接种到已灭菌的发酵培养基1中，30℃下厌氧培养3天，然后再将步骤(2)制得的枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、啤酒酵母种子液、产朊假丝酵母种子液接种到上述发酵体系中，摇床转速150r/min、温度30℃，装液量30mL/250mL培养2天，得复合微生物制剂菌种，其中，嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和啤酒酵母、产朊假丝酵母种子液的接种量比(重量比)为5:5:4:3:3:3:5:5；总接种量为重量百分比10％。
效果实施例
(1)对比实施例1是8种菌株的种子液同时接种至发酵培养基1中，先好氧培养2天，后厌氧培养3天；对比实施例2则是先将嗜酸乳杆菌种子液、植物乳杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液接种至发酵培养基1中，30℃下厌氧培养3天，然后再将枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、啤酒酵母种子液、产朊假丝酵母种子液接种至发酵体系中，好氧培养2天。实施例2是混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至发酵培养基1中，好氧培养2天，然后再将混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，厌氧培养3天。其他参数均相同。
表1是实施例2以及对比实施例1和2获得的复合微生物制剂菌种中各菌计数结果，从表1中可以看出，对比实施例1中的芽孢杆菌培养后期大量死亡；对比实施例2中芽孢杆菌和酵母菌生长均不好，后期大量死亡；而按照实施例2的接种顺序，细胞均达到了较高的生长量；这表明实施例2的接种顺序是最佳接种顺序。
表1不同接种顺序计数结果(cfu/ml)
(2)为了进一步说明问题，分别检测实施例2步骤(3)复合菌种培养中的细胞生长量、繁殖代数、生长速率常数、世代时间等，并以各菌种(接种量重量百分比10％)纯培养为对照。结果见表2和表3。
表2纯培养和混合培养对比
表3纯培养和混合培养代谢产物产率系数(Yp/s)
由此可见，酵母菌、芽孢杆菌能迅速消耗培养基中的氧气，为乳酸菌、两歧双歧杆菌、沼泽红假单胞菌创造了一个有利于生存的厌氧环境，有利于乳酸菌、两歧双歧杆菌、沼泽红假单胞菌的生长；酵母菌能够将营养物质中的蔗糖分解成果糖和葡萄糖为乳酸菌、两歧双歧杆菌、沼泽红假单胞菌提供碳源；乳酸菌、两歧双歧杆菌靠摄取沼泽红假单胞菌、酵母菌产生的糖类产生乳酸，乙酸等有机酸，降低pH值，抑制有害菌的增殖，防止复合微生物在培养过程被污染；与纯培养相比，混合培养提高了活菌数，减少了纯培养后再混配的环节，减少了污染率，有效地保证了复合微生物制剂质量，而且还提高了原材料、设备和能源的利用率，从而降低生产成本。
本发明制得的复合微生物制剂可用于生猪养殖，具有促生长、助消化、抗疾病、增加动物体重、降低饲料消耗、净化养殖环境的效果，从而生产出安全优质无残留的绿色猪肉食品。猪肉食品营养成分含量检测结果见表4，猪肉食品安全检测结果见表5(参照NY/T2799-2015《绿色食品畜肉》进行检测)
表4猪肉食品营养成分含量检测结果
| 检测项目 | 单位 | 检测结果 | 检测方法 |
| 天冬氨酸 | g/100g | 2.06 | GB/T 5009.124-2016 |
| 苏氨酸 | g/100g | 0.99 | GB/T 5009.124-2016 |
| 丝氨酸 | g/100g | 0.87 | GB/T 5009.124-2016 |
| 谷氨酸 | g/100g | 3.39 | GB/T 5009.124-2016 |
| 脯氨酸 | g/100g | 0.90 | GB/T 5009.124-2016 |
| 甘氨酸 | g/100g | 1.12 | GB/T 5009.124-2016 |
| 丙氨酸 | g/100g | 1.31 | GB/T 5009.124-2016 |
| 缬氨酸 | g/100g | 1.09 | GB/T 5009.124-2016 |
| 蛋氨酸 | g/100g | 0.61 | GB/T 5009.124-2016 |
| 异亮氨酸 | g/100g | 1.02 | GB/T 5009.124-2016 |
| 亮氨酸 | g/100g | 1.78 | GB/T 5009.124-2016 |
| 酪氨酸 | g/100g | 0.78 | GB/T 5009.124-2016 |
| 苯丙氨酸 | g/100g | 1.12 | GB/T 5009.124-2016 |
| 组氨酸 | g/100g | 1.91 | GB/T 5009.124-2016 |
| 赖氨酸 | g/100g | 0.93 | GB/T 5009.124-2016 |
| 精氨酸 | g/100g | 1.45 | GB/T 5009.124-2016 |
| 氨基酸总量 | g/100g | 21.3 | GB/T 5009.124-2016 |
| 蛋白质 | g/100g | 21.0 | GB 5009.5-2016 |
表5猪肉食品安全检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合微生物制剂的培养方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)菌种活化培养：将冷冻保藏的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母分别进行多次活化，得到嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种；
(2)液体菌种培养
①将步骤(1)制得的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化菌种等质量比接种至液体培养基中，37℃厌氧培养2～3天，得到混合乳酸菌种子液；
②将步骤(1)制得的两歧双歧杆菌活化菌种接种至液体培养基中，37℃厌氧培养2～3天，得到两歧双歧杆菌种子液；
③将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌活化菌种等质量比接种至液体培养基中，摇床转速150～200r/min、温度30～35℃培养1-2天，得到混合芽孢杆菌种子液；
④将步骤(1)制得的沼泽红假单胞菌活化菌种接种至液体培养基中，60℃钨丝灯光照、30～35℃厌氧培养5～7天，得到沼泽红假单胞菌种子液；
⑤将步骤(1)制得的啤酒酵母、产朊假丝酵母活化菌种等质量比接种至液体培养基中，摇床转速150～200r/min、温度28～30℃培养2天，得到混合酵母菌种子液；
(3)复合菌种培养：将步骤(2)制得的混合芽孢杆菌种子液和混合酵母菌种子液同时接种至发酵培养基1中，摇床转速150～200r/min、温度30℃、装液量30mL/250mL培养1～2天，然后再将步骤(2)制得的混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液和沼泽红假单胞菌种子液同时接种至上述发酵体系中，30～35℃下厌氧培养3～5天，得复合微生物制剂菌种，其中，混合乳酸菌种子液、两歧双歧杆菌种子液、混合芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液和混合酵母菌种子液的接种量比为5:4:3:3:5；总接种量为重量百分比10％；
(4)成品培养：将步骤(3)制得的复合微生物制剂菌种按重量百分比5～8％的接种量接种至发酵培养基2中，28～30℃密闭发酵7～15天，获得复合微生物制剂的成品；其中，该步骤发酵培养基不用灭菌。
2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母的菌株分别为：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CICC 6083、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC 21790、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CICC 6166、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CICC24434、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC 1.10257、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)CGMCC 1.8929、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.3973、产朊假丝酵母(Candida utilis)CGMCC 2.3047。
3.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的多次活化的具体操作为：将冷冻保藏的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母菌株进行三次斜面活化，然后再进行平板纯化培养，最后进行斜面培养，得到嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母菌种。
4.根据权利要求3所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
所述的斜面活化、平板纯化培养或斜面培养的条件为：
嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌37℃兼性厌氧培养2～3天，
两歧双歧杆菌37℃厌氧培养3～5天，
枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌30℃好氧培养1～2天；
沼泽红假单胞菌60瓦乌丝灯光照30～35℃厌氧培养5～7天；
啤酒酵母或产朊假丝酵母28～30℃好氧培养2天。
5.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(2)①所述的液体培养基每一升包含如下组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温80 1mL、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.05、碳酸钙20克、番茄汁20mL，土豆汁30mL，胡萝卜汁60mL，维生素C 2克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH6.8；
步骤(2)②所述的液体培养基每一升包含如下组分：蛋白胨15.0克、酵母粉2.0克、葡萄糖20.0克、可溶性淀粉0.5克、氯化钠5.0克、5％半胱氨酸10.0mL、西红柿浸出液400.0mL、吐温80 1.0mL、肝提取液80.0mL、弱碱性小分子还原水补至1000ml，pH7.0。
6.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(2)③所述的液体培养基每一升包含如下组分：葡萄糖30克、酵母膏15克、磷酸氢二钠2克、磷酸二氢钠1克、弱碱性小分子还原水1000mL、pH7.2；
步骤(2)④所述的液体培养基每一升包含如下组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、弱碱性小分子还原水补至1000mL，pH7.0～7.2；
步骤(2)⑤所述的液体培养基每一升包含如下组分：红糖50克、酵母膏20克、硫酸铵1克、氯化钾2克、pH自然，弱碱性小分子还原水补至1000mL。
7.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的发酵培养基1包含如下按质量百分比计的组分：
工业用废糖蜜5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、香蕉多糖1％、氯化铵0.1％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％、弱碱性小分子还原水补足100％。
8.根据权利要求1所述的复合微生物制剂的培养方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的发酵培养基2包含如下按质量百分比计的组分：工业用废糖蜜5～8％、香蕉多糖0.3％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，水补足100％。
9.一种复合微生物制剂，其特征在于通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的复合微生物制剂在生猪养殖领域中的应用。
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