CN112210587B - 一种基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体为一种基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法。本发明从靶标小分子的实验结构出发，通过水合对接获得结合在靶标小分子周围的核苷酸位置；随后将离散的核苷酸组装为完整的核酸适配体；最后采用MST实验检测所设计核酸适配体与靶标小分子的结合能力。本发明已用于毒素小分子冈田酸(OA)的核酸适配体设计中；该毒素是一种分布广泛的海洋生物毒素，会导致腹泻型贝类中毒，因此检测海产品中的OA对于食品安全具有重要意义。通过计算方法设计得到靶向OA的核酸适配体OA‑D1，MST实验验证该核酸适配体与OA的平衡解离常数为75.6 nM；说明该计算设计方法是合理且有效的。

Description

一种基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法
技术领域
本发明属于核酸适配体设计技术领域，具体涉及核酸适配体设计方法。
背景技术
核酸适配体是与特异性靶标产生高亲和力的核糖核酸(RNA)或单链脱氧核糖核酸(ssDNA)，能够通过链内碱基间的氢键作用折叠形成稳定的二级或三级结构(2,3)。核酸适配体一般由几十个核苷酸组成，相对分子质量小、性质稳定、容易制备和修饰，能与离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等靶标结合。与小分子靶标结合的核酸适配体可特异性识别和区分小分子间极微小的差异，通常作为化学和微生物传感器的识别分子，广泛应用于食品和环境监测等领域(4)。
核酸适配体主要由SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment，指数富集配基进化)(2,3)技术筛选得到，其基本原理：首先合成大量的(约1014-17条)随机DNA或RNA寡核苷酸链，然后进行多次循环的筛选富集，选出能与靶分子高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸链。随着循环的进行，所选出的寡核苷酸链与靶分子结合的特异性和亲和力逐渐提高，最终得到与靶分子特异性结合且亲和力最高的一种或几种寡核苷酸链，即为该靶分子的适配体。但是传统的SELEX技术往往存在效率和命中率低的问题(5)。这是由于寡核苷酸库并不能合成所有可能的寡核苷酸链，而且不同类型的寡核苷酸链存在合成速度的差异，这都会影响核酸适配体的筛选。
因此急需提出一种计算设计方法，以特异性地设计靶向靶标小分子的核酸适配体。此核酸适配体可分为两个部分。第一部分直接与靶标小分子相互作用，为核酸适配体-靶标小分子复合物贡献了大部分结合自由能；第二部分为mini-hairpin结构，为形成完整的核酸适配体提供连接作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种采用计算技术设计核酸适配体的方法，以获得特异性的靶向靶标小分子的核酸适配体。
本发明的另一目的是提供由上述设计方法获得的特异性靶向靶标小分子的核酸适配体。
本发明提出的采用计算技术设计核酸适配体的方法，采用分子对接及分子动力学模拟，获得结合在靶标小分子周围核苷酸的位置，从而针对性地设计靶向靶标小分子的核酸适配体，并同时获得核酸适配体-靶标小分子复合物的稳定构象；最后采用MST实验检测所设计的核酸适配体与靶标小分子的结合能力。称本发明方法为基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法，记为SDTA(Single-nucleotide Docking then Assembly)设计方法。
本发明提供的基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法，具体步骤如下。
第一步：进行单核苷酸的水合对接，获得结合在靶标小分子表面的单核苷酸位置；
第一步的目的是获得结合在靶标小分子表面单核苷酸的位置。分子对接能够快速地寻找配体分子合理的去向和构象，使得配体和受体分子的形状和相互作用的匹配最佳(6)。水合对接所用软件为AutoDock分子对接软件包(6)，受体分子为靶标小分子，配体分子为各核苷酸(A,C,G,T)；在首次对接过程中，受体分子为靶标小分子，配体分子为各核苷酸(A,C,G,T)。在接下来的对接过程中，受体分子为靶标小分子及对接后所保留的核苷酸，配体分子仍为各核苷酸。在对接过程中，当作为对接配体的核苷酸不再与靶标小分子接触时，则认为单核苷酸的水合对接阶段结束。分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(Lamarckian Genetic Algorithm, LGA)，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法为半柔性对接，即在对接过程中，受体分子的构象不发生变化，而各核苷酸的构象在一定的范围内变化。为了增加分子对接的准确性，需在对接过程中考虑水的作用，因此所用力场为具有离散可置换水和去溶剂熵的水合对接力场(7)。同时为使核苷酸能够充分搜索构象，对接格子的长宽高均设置为100 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为受体分子的几何中心。
第二步：组装离散的核苷酸，获得与靶标小分子结合的核酸短链；
通过第一步的水合对接，获得了与靶标小分子结合的核苷酸，这些核苷酸呈离散状分布在小分子的周围；通过核苷酸之间的距离关系，将离散的核苷酸组装成为核酸短链，为获得完整的核酸适配体奠定基础；具体做法为：
由于在标准的DNA链中，核苷酸的原子C3’/C4’与相邻核苷酸的原子C4’/C3’之间的距离为5 Å左右。采用此距离作为标准，通过测量核苷酸间C3’/C4’原子之间的距离，确定相邻的核苷酸；同时最大限度地将离散的核苷酸组装在一起，最终组装成为多条孤立的核酸短链。
为了使核酸短链的结构合理化，将对核酸短链进行能量最小化。在此过程中，为了不影响与靶标小分子的相互作用，将固定其侧链原子，只移动主链上原子。能量最小化采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包(1)，AMBER99bsc1力场(8)及SPC水模型对核酸短链***进行建模；在模拟***中，核酸短链置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为10Å；并且***金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；最后使用最速下降法进行(如5,000步)能量最小化，得到结构合理化的核酸短链。
第三步：进行分子动力学模拟，获得核酸短链-靶标适配体复合物的稳定构象；
通过上一步获得结构合理化的核酸短链后，将核酸短链及靶标小分子作为整体，进行分子动力学模拟, 以获得稳定的复合物构象。其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模；在模拟***中，多条核酸短链作为整体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为10 Å；为了与溶液环境保持一致，将***金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟***进行能量最小化；然后采用v-rescale恒温器控制***平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器(9)中对体系进行时间长度不少于50 ns分子动力学模拟。
第四步：采用mini-hairpin(迷你发卡)结构将核酸短链组装为完整的核酸适配体；
在获得与靶标小分子稳定结合的核酸短链构象后，采用mini-hairpin结构作为连接组分，将孤立的核酸短链组装成为完整的核酸适配体。Mini-hairpin结构具有良好的热稳定性，且其核酸序列较短，能够起到稳定的连接作用(10)。Mini-hairpin的茎状结构含为3~4对互补的碱基对，环状结构含有3~4个孤立的碱基。Mini-hairpin的3D结构可通过Rosetta程序中的RNA 3D structure modeling模块(11)获得。为获得结构合理的核酸适配体，将进行能量最小化(对核酸短链进行能量最小化可参见步骤二)，在此过程中，将固定核酸短链上的原子，仅移动mini-hairpin上的原子。
第五步：进行分子动力学模拟，获得核酸适配体-靶标小分子复合物的稳定构象；
在获得结构合理化的核酸适配体后，将核酸适配体及靶标小分子作为整体，进行分子动力学模拟，以获得核酸适配体-靶标小分子复合物的稳定构象。其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；模拟体系采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场以及SPC水模型进行建模；在模拟***中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；同时***阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME(12)和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；通过v-rescale和berendsen耦合(13)维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于100 ns的分子动力学模拟。
第六步：采用MST实验测量适配体与靶标小分子的结合亲和力；
微量热泳动方法(Microscale Thermophoresis, MST)(14)利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的相互作用。对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧光标记于核酸适配体mini-hairpin的环状结构上。因核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，从而导致热泳动后荧光信号值的变化。通过测量不同结合程度下，样品溶液MST过程荧光变化信号，可以拟合得到关于结合反应解离平衡常数Kd值。
本发明的一个实施例中，所述靶标小分子为冈田酸(Okadaic acid, OA)(15)。
本发明还涉及由上述设计方法得到的核酸适配体。包括靶向OA(15)的高亲和性核酸适配体OA-D1。
本发明提供的SDTA设计方法，是通过分子对接方法获得单核苷酸的结合位置，并通过分子动力学模拟将离散的核苷酸组装成完整的核酸适配体，并采用MST实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合能力。核酸适配体通常由SELEX技术筛选所得，但SELEX实验周期长，费用消耗大，并且无法保证筛选的成功率。分子对接可以特异性地识别靶标小分子的结合位点，分子动力学模拟能够获得稳定的复合物构象。因此采用这一计算设计方法，可以特异性地设计靶向靶标小分子的核酸适配体。
附图说明
图1为核酸适配体计算设计方法的流程图。
图2为OA的化学结构式。
图3为离散核苷酸:OA复合物的示意图。
图4为核酸短链:OA复合物的示意图。
图5为随时间变化核酸短链:OA体系的结合能及稳定构象示意图。
图6为核酸适配体OA-D1的序列及其二级结构。
图7为随时间变化OA-D1:OA体系的结合能及稳定构象示意图。
图8为核酸适配体OA-D1的MST实验。
具体实施方式
下面以靶向OA (Okadaic acid)的核酸适配体OA-D1的计算设计方法为例，进一步说明本发明方法具体过程。
第一步：进行单核苷酸的水合对接，获得结合在毒素小分子表面的单核苷酸位置；
第一步旨在获得结合在OA表面单核苷酸的位置。分子对接方法能够快速寻找OA的主要结合位点及各核苷酸(A,C,G,T)在其表面的结合位置。在首次对接中，受体分子为毒素小分子OA，其结构来自于PDB数据库(ID:2I4E)，配体分子为各核苷酸；在其次的分子对接中，受体分子为毒素小分子OA及对接后所保留的核苷酸，配体分子仍为各核苷酸。对接所用软件为AutoDock分子对接软件包；对接算法为拉马克遗传算法(LGA)；对接方法为半柔性对接，即在对接过程中，受体分子的构象不发生变化，而各核苷酸的构象在一定的范围内变化。为了增加对接的准确性，需在对接过程中考虑水的作用，因此对接所用力场为具有离散可置换水和去溶剂熵的水合对接力场。为了确保核苷酸能够充分搜索构象，对接格子的长宽高均被设置为100 Å。格点之间的间隔为0.375 Å，格子中心为各受体分子的几何中心。
第二步：组装离散的核苷酸，获得与毒素小分子结合的核酸短链；
通过第一步的水合对接，能够获得结合在OA表面的离散核苷酸的位置，共有10个核苷酸，如图3所示。因为在标准的DNA链中，核苷酸的原子C3’/C4’与相邻核苷酸的原子C4’/C3’之间的距离为5 Å左右。通过测量核苷酸间C3’/C4’原子之间的距离(< 10 Å)，且最大程度地连接所有离散的核苷酸，这些核苷酸被组装成两条核酸短链，分别命名为SC1(short chain 1)和SC2。按照对接顺序将每个核苷酸进行编号，这两条核酸短链分别为5’-4T-2C-5A-7G-3’和5’-6C-3G-8T-1A-10G-3’。为了使核酸短链的结构合理化，将对其进行能量最小化。在此过程中，核酸短链的侧链原子被固定，仅主链原子能够移动。能量最小化采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对核酸短链***进行建模；在模拟***中，核酸短链置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为10 Å；并且***Na+和Cl-使溶液环境保持中性，并使离子浓度达到0.15 nmol/L；然后使用最速下降法进行5,000步的能量最小化，得到结构合理化的核酸短链，如图4所示。
第三步：进行分子动力学模拟，获得核酸短链-毒素小分子复合物的稳定构象；
通过能量最小化，能够得到结构合理化的核酸短链，随后通过50 ns的分子动力学模拟获得核酸短链-OA复合物的稳定构象。通过分子动力学模拟，复合物的构象发生了变化，说明离散的核苷酸组装成为核酸短链后，为了使其结构合理化，核苷酸与OA的相互作用随后进行调整，最终获得稳定的复合物构象，如图5所示。同时，采用AutoDock中的半经验力场公式计算模拟轨迹中每一帧的自由结合能。由图5A可知，核酸短链:OA复合物体系的自由结合能约为-12 kcal/mol，说明核酸短链与OA具有较强的相互作用。
第四步：采用mini-hairpin结构将核酸短链组装为完整的核酸适配体；
获得核酸短链-OA复合物的稳定构象后，需将核酸短链组装为一个完整的核酸适配体，可采用mini-hairpin结构作为连接组分。Mini-hairpin结构具有良好的热稳定性，且其核酸序列较短，因此能够起到一个稳定的连接作用。为了保证两条核酸短链的孤立性，将采用RNAStructure预测包含不同mini-hairpin序列的二级结构，如图6所示，最终获得的mini-hairpin序列为5’-CGCGTAGCG-3’。随后mini-hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA 3D structure modeling模块进行3D建模(11)。SC1和SC2两条核酸短链的端点碱基分别为4T和10G，这两个核苷酸中P原子之间的距离为19 Å，与互补配对核苷酸中的P原子之间的距离相近。因此采用mini-hairpin连接这两个核苷酸，将核酸短链组装成为完整的核酸适配体。并对此核酸适配体进行能量最小化，获得结构合理化的核酸适配体OA-D1。在此过程中，将固定核酸短链上的原子，仅移动mini-hairpin上的原子。
第五步：进行分子动力学模拟，获得核酸适配体-毒素小分子复合物的稳定构象；
获得完整的核酸适配体OA-D1后，因加入了mini-hairpin结构，需进行分子动力学模拟获得稳定的OA-D1:OA复合物构象(图7B)。由图可知，OA稳定结合在核酸适配体OA-D1的两条核酸短链中间。同时，将计算模拟轨迹中每一帧该复合物的自由结合能。由图7A所示，OA与OA-D1的相互作用非常稳定，复合物体系的平均自由结合能仍为-12 kcal/mol，与核酸短链:OA复合物体系的自由结合能相近，说明mini-hairpin的加入并没有影响核酸适配体与OA的相互作用。
第六步：采用MST实验测量适配体与靶标小分子的结合亲和力；
本实验采用微量热泳动(MST, microscale thermophoresis)实验确定核酸适配体OA-D1与OA的结合能力。MST实验是利用分子的热泳动现象，通过测量温度梯度下，分子耦合时水化层、分子大小和表面电荷等微小变化引发的热泳动变化，进而分析分子之间的相互作用。目前该方法已广泛用于分析蛋白质与蛋白质、蛋白质和核酸、蛋白质与小分子、核酸与核酸、核酸与小分子之间的相互作用。实验中所用的靶标小分子OA购于台湾藻研有限公司，所用核酸适配体以及其余化学试剂均购自上海生工生物工程有限公司。实验所用的设备为德国Nano Temper Technologies的Monolith NT.115分子间相互作用仪。
1、样品准备：本发明用于MST实验的缓冲液为100 mmol/L Tris、30 mmol/LNaCl、4mmol/L MgCl2，维持体系的pH为7.4。缓冲液制备完后用0.2 μm的水相过滤膜过滤以除去溶液中的颗粒物。本实验所用的核酸适配体用缓冲液稀释到280 nmol/L，取200 μL核酸样品置于加热器中95℃加热10分钟，然后冰浴5分钟，最后在室温下静置5分钟。
2、MST实验检测：MST实验用于测量Kd值时，采用梯度稀释的方法，将OA溶液依次稀释成16组。具体操作为：①准备16个PCR管，编号为1到16。向第一个管中加入20 μL的100 μmol/L OA溶液。②第2个到第16个管中分别加入10 μL的缓冲液。③将前一管中的10 μL依次转移到下一管中，并充分混匀，最后从第16管20 μL溶液中吸走10 μL。最终得到16管10 μL且浓度依次减半的OA溶液。④每管中依次加入10 μL的0.28 μmol/L荧光标记的核酸适配体溶液。OA的结合位置为核酸短链中间，因此荧光标记(6-FAM)连接在核酸适配体的mini-hairpin结构的环状的T碱基上。此时体系中OA的初始稀释浓度为50 μmol/L，核酸适配体的浓度为0.14 μmol/L。避光室温孵育2 h后用于MST实验。
确定了核酸适配体OA-D1和OA的浓度之后，将样品置于毛细管中，并依此放入毛细管架的凹槽中，毛细管架装入MST仪器后，关闭仪器舱门。在操作界面上依次填写16个毛细管中OA的终浓度，然后将MST Power设定为40%，再点击操作界面的Start Cap Scan，查看扫描出来的16个毛细管的初始荧光值是否一致(保证荧光标记分子浓度一致)。如果不一致将会影响数据的收集和拟合，一般荧光值的偏差控制在10%之内。通过扫描毛细管中的样品还可以判断分子是否聚集于毛细管表面，当扫描结果为一个光滑的峰形图时，则说明管壁未聚集样品分子。当结果显示正常时，可以点击Start MST Measurement按钮进行MST实验。待实验结束后，将数据导入MO.Affinity Analysis软件进行分析。测量结果如图8所示，OA-D1的Kd值为75.6 nM，说明此核酸适配体与OA具有高亲和性。证明基于毒素小分子OA进行的核酸适配体设计方法是合理且有效的。
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15. Cohen, P., Holmes, C.F. and Tsukitani, Y. (1990) Okadaic acid: anew probe for the study of cellular regulation. Trends Biochem Sci, 15, 98-102.。

Claims (1)

1.一种基于单核苷酸分子对接的核酸适配体设计方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：进行单核苷酸水合对接，获得结合在靶标小分子表面的单核苷酸位置；
其中，水合对接所用软件为AutoDock分子对接软件包，受体分子为靶标小分子，配体分子为各核苷酸(A,C,G,T)；分子对接采用的算法为拉马克遗传算法(LGA)，该算法将遗传算法和局部搜索结合在一起，遗传算法用于全局搜索，局部搜索用于能量优化；对接方法采用的是半柔性对接，即在对接过程中，靶标小分子的构象不发生变化，而各核苷酸的构象在一定的范围内变化；为了增加分子对接的准确性，在对接过程中考虑水的作用，因此所用力场为具有离散可置换水和去溶剂熵的水合对接力场；为了确保核苷酸能够充分搜索构象，将对接格子的长宽高均设置为100 Å；格点之间的间隔为0.375 Å，对接格子的中心为靶标小分子的几何中心；
第二步：组装离散的核苷酸，获得与靶标小分子结合的核酸短链；
由第一步的水合对接，获得了与靶标小分子结合的核苷酸，这些核苷酸呈离散状分布在小分子的周围；通过核苷酸之间的距离关系，将离散的核苷酸组装成为核酸短链，为获得完整的核酸适配体奠定基础；具体做法为：
在标准的DNA链中，核苷酸的原子C-3’与相邻核苷酸的原子C-4’之间的距离为5 Å，或者核苷酸的原子C-4’与相邻核苷酸的原子C-3’之间的距离为5 Å，采用此距离作为标准，通过测量核苷酸间C-3’和C-4’原子之间的距离，确定相邻的核苷酸；同时最大限度地将离散的核苷酸组装在一起，最终组装成为多条孤立的核酸短链；
为了使核酸短链的结构合理化，将对核酸短链进行能量最小化；在此过程中，将固定其侧链原子，只移动主链上原子；能量最小化采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对核酸短链***进行建模；在模拟***中，核酸短链置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为10 Å；并且***金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；最后使用最速下降法进行能量最小化，得到结构合理化的核酸短链；
第三步：进行分子动力学模拟，获取核酸短链-靶标小分子复合物的稳定构象；
在上一步获得结构合理化的核酸短链后，将核酸短链及靶标小分子作为整体，进行分子动力学模拟，以获得稳定的复合物构象；其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；同时采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场及SPC水模型对模拟体系进行建模；在模拟***中，多条核酸短链作为整体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为10 Å；为了与溶液环境保持一致，将***金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；模拟过程采用周期性边界条件，静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；具体过程为：首先利用最陡下降算法对模拟***进行能量最小化；然后采用v-rescale恒温器控制***平衡温度，berendsen压力耦合平衡压强；最后，在md集成器中对体系进行时间长度不少于50 ns分子动力学模拟；
第四步：采用mini-hairpin结构将核酸短链组装为完整的核酸适配体；
在获得与靶标小分子稳定结合的核酸短链构象后，采用mini-hairpin结构作为连接组分，将孤立的核酸短链组装成为完整的核酸适配体；Mini-hairpin的茎状结构含为3~4对互补的碱基对，环状结构含有3~4个孤立的碱基；Mini-hairpin的3D结构通过Rosetta程序中的RNA 3D structure modeling模块获得；为获得结构合理的核酸适配体，将进行能量最小化，在此过程中，将固定核酸短链上的原子，仅移动mini-hairpin上的原子；
第五步：进行分子动力学模拟，获得核酸适配体-靶标小分子复合物的稳定构象；
获得完整的核酸适配体后，将核酸适配体及靶标小分子作为整体，进行分子动力学模拟，获得稳定的复合物构象；其中，靶标小分子的通用AMBER力场参数采用AmberTools自带的Antechamber软件包生成；模拟体系采用GROMACS-5.1.4分子动力学软件包，AMBER99bsc1力场及SPC水模型进行建模；在模拟***中，核酸适配体置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距离为15 Å；为了与溶液环境保持一致，将***金属阳离子和相应的阴离子使溶液环境保持中性，并达到所需的离子浓度；模拟过程采用周期性边界条件；静电和范德华相互作用分别采用PME和Cut-off方法计算，截断距离均为14 Å；所有化学键均受LINCS算法约束；其中，积分时间步长为1~3 fs；通过v-rescale和berendsen耦合维持体系的温度和压强，最后对体系进行时间长度不少于100 ns的分子动力学模拟；
第六步：采用微量热泳动方法MST实验检测核酸适配体与靶标小分子的结合强度；
对于每一组MST实验，设计16个靶标小分子的浓度用于16根毛细管，利用梯度稀释法1:1稀释靶标小分子，其中每根毛细管中核酸适配体的浓度固定；荧光标记于核酸适配体mini-hairpin的环状结构上；核酸适配体与靶标小分子的偶联会影响热泳动的过程，由此导致热泳动之后荧光信号值的变化；通过测量在不同结合程度下，样品溶液MST过程荧光变化信号，可以拟合得到关于该结合反应解离平衡常数Kd值；
其中，所述靶标小分子为冈田酸(OA)；设计得到核酸适配体，记为OA-D1，其序列为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
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