CN102132159B - 鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或SuperPAPPen划线隔开。本发明采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的抗体，取病毒靶器官制备待检样品液，将待测样品液与固定有病原抗体的芯片孵育，再加荧光标记的特异性单抗探针，通过CCD扫描仪读取结果。该方法能同时检测多种样品或同一样品不同组织中淋巴囊肿病毒。

Description

鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及海水养殖动物病原检测技术的改进，具体涉及一种用于检测鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)的免疫检测芯片或微阵列及其制备方法与应用，其属于免疫学、病毒学及生物芯片交叉技术领域。

背景技术

鱼类淋巴囊肿病是一种慢性病毒病，患病鱼的表皮、鳍和尾部等处出现菜花样囊肿，影响其商品价值或导致鱼死亡。淋巴囊肿病的病原为淋巴囊肿病毒(LCDV)，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)。淋巴囊肿病流行地区较广，呈世界性分布，目前已知至少42科125种以上的海水、咸水和半咸水鱼类可被LCDV感染。自1997年牙鲆淋巴囊肿病在我国首次大规模暴发以来，我国山东、河北、广东、浙江等省养殖的石斑鱼、真鲷、美国红鱼、许氏平鲉、军曹鱼等均发生过此病，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。与其他的病毒病一样，鱼类淋巴囊肿病毒病缺乏有效的治疗药物。LCDV感染具有潜伏期长的特点，使LCDV极易随着亲鱼与鱼苗在不同地区间的交流而传播，因此，养殖生产中急需LCDV的快速准确检测技术，以期达到早发现早预防的目的。

国内外检测鱼类病毒的方法大致包括电镜技术，PCR法，DNA探针原位杂交法，免疫荧光抗体技术，免疫组织化学技术，酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹技术等。但这些检测技术局限性大，灵敏度、特异性、准确性多不能兼顾，不能用于多样品同时并行检测。因此，建立一种适用于鱼类淋巴囊肿病毒的简便、快速、准确、多样品并行处理的检测诊断技术势在必行，而新发展起来的蛋白芯片技术为其提供了强有力的技术平台，微量化的反应既可节约昂贵的试剂又可结合动力学的快速分析，在蛋白质水平上提供了一个廉价快速的测试手段，在诊断领域具有相当广阔的应用前景。另外，鱼类淋巴囊肿病毒单克隆抗体的成功研制，为利用单克隆抗体建立鱼类淋巴囊肿病的免疫芯片检测诊断技术奠定了基础。

发明内容

针对上述现状，本发明的目的是提供一种能同时检测多种样品或同一样品不同组织中淋巴囊肿病毒的免疫检测芯片，用于海水养殖鱼类中LCDV的快速、灵敏、准确的检测，以及进出口鱼类中LCDV的检疫。

本发明的另一个目的是提供上述鱼类LCDV免疫检测芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述免疫检测芯片在养殖鱼类LCDV检测中的应用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其结构包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线隔开。A液：渗透压小于360mOsm/kg的低渗液；B液：吐温-磷酸盐缓冲液(PBST)；C液：Cy3标记的鼠抗LCDV的单克隆抗体(单抗)探针，探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的特异性抗LCDV单抗(简称：LCDV单抗B和单抗C)，杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，保藏日期：2004年12月14日。LCDV与该两株单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于病毒囊膜上。

本发明以现有技术的实际特点：其一，鱼类体内有免疫球蛋白-IgM的形成，但血清中IgM的标记程序较为复杂；其二，对海水养殖动物疾病的诊断是一个群体的概念，可以通过对多个个体的检测达到对群体做出诊断的目的。因此，本发明根据这些特点，采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的抗体，取待检个体病毒靶器官制备待检样品液，直接将待测样品液与固定有病原抗体的芯片孵育，再加荧光标记的特异性单抗探针，通过CCD扫描仪读取结果。

鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗体的制备及纯化

从患淋巴囊肿病的牙鲆体表肿瘤中提取LCDV，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗LCDV抗体。

复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株(LCDV单抗B和单抗C)，注射一定数量的杂交瘤细胞入小鼠腹腔生产腹水，得到大量高浓度、高特异性、高效价的鼠抗LCDV单抗。

取亲和层析纯化后的LCDV单抗B和单抗C，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠抗LCDV单抗的抗体(兔抗鼠Ig的抗体)。

使用Amersham Phamacia Biotech公司的亲和层析柱(HiTrap Protein G SepharoseColumn)纯化所得抗体。

(2)Cy3标记的单克隆抗体探针的制备

按照Amersham Phamacia Biotech公司的产品说明书，使用荧光素Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗LCDV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。

(3)载玻片的预处理

将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温作用1h，双蒸水冲洗，晾干。

(4)琼脂糖凝胶基片的制备

配制1.2％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2mL琼脂糖溶液铺覆在60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，玻片在37℃下过夜干燥；使用前用0.02mol/L NaIO₄溶液室温下活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。

(5)抗体的固定

①用pH7.4的含50％甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释兔抗LCDV抗体使其浓度为0.5～0.0001mg/mL；稀释兔抗鼠Ig的抗体使其浓度为0.1mg/mL。

②用点样仪将此抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，点样量为50～70nL，点直径为500～600μm。每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗LCDV抗体，第四列所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。

③在载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片。

本发明的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的应用，所述该应用步骤如下：

(1)用于检测的鱼类组织包括：鱼体表瘤状物、表皮、脾、胃、肠等，取样与A液约按1∶10(W/V)的比例混合，匀浆，反复冻融3～4次，超声破碎后，低温离心，5000rpm，15min，取上清作为检测样品，待检。

(2)将不同待检样品加到上述芯片的不同亚阵列中，加样量为10μL/阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，再加稀释的C液(Cy3标记的鼠抗LCDV单抗)，10μL/阵列，37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，晾干。

(3)激光扫描

上述检测芯片用晶芯

EcoScan^TM-100 CCD扫描仪扫描成像，激发波长为532nm，检测波长为585nm，荧光信号用Lab-chipscanner 2.0软件分析。

检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有LCDV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无LCDV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列阳性对照及质量控制点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，则检测结果为无效。

(4)病毒的定量检测及最低检测限

分离纯化后LCDV稀释至25.6μg/mL，再按二倍比稀释所得的8个抗原浓度分别与载玻片上的8个亚阵列孵育，经抗体探针检测，扫描分析后结果如图3所示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。以抗原浓度的对数为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在0.8～12.8μg/mL范围内，相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，提示所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析。此抗体微阵列所能检测到的最低抗原浓度为1.6μg/mL。

所述芯片载体具有经过亲和硅烷处理后，并用琼脂糖凝胶修饰的玻璃表面，该表面为三维多孔结构，经NaIO₄活化后，可以使抗体以物理吸附和共价连接两种方式固定在其上，同时，其亲水环境还有利于保持固定在上面的抗体蛋白的活性。所述的抗体是兔抗LCDV抗体、兔抗鼠Ig的抗体，但不仅仅限于这两种抗体。

所用于点样的亲和层析纯化后兔抗LCDV抗体最适浓度为0.5mg/mL。

所述的待检样品加到芯片上后，37℃饱和湿度放置30min，玻片上加稀释的抗体探针后，37℃饱和湿度下放置30min。

所述芯片单张玻片点有8个亚阵列，可以根据实际需要增加亚阵列数量，能够实现更多样品的同时检测。

本发明的优点在于可以同时检测多个样品或同一个体的多个不同组织中的LCDV，它结构简单，成本低廉，通量易于扩充，实现多样品的同时平行检测，增加了不同标本数据之间的可比性，可快速、准确、简便地检测多种养殖鱼类体内的LCDV。对样品要求简单，少量样品即可满足检测需要，并大大简化了现有检测技术的样品处理步骤，甚至可以在不杀死养殖动物的情况下取材检测。同时由于阳性控制及阴性控制的设置及捕获抗体的重复点样，增加了检测结果的可靠性。另外免疫芯片反应相对较快，操作过程便捷，一般人员即可操作，并且能够相对定量检测病原，适用于养殖过程中病毒病的快速、准确的检测。

附图说明

图1.鱼类淋巴囊肿病毒免疫芯片结构示意图及点样分布图。其中，1-芯片载体，2-琼脂糖凝胶层，3-抗体微阵列，4-芯片专用围栏或Super PAP Pen划线，5-标签区域。点样分布：①含50％甘油的PBS，作为阴性对照；②、③为兔抗LCDV抗体；④兔抗鼠Ig的抗体，作为阳性对照及固定对照等质量控制。

图2.鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片检测不同来源鱼类样品中LCDV的CCD扫描图(扫描仪的荧光强度设定为88％)。A1、A2表明样品中未检出LCDV；A3、B3表明样品中LCDV浓度较高；B2、B4表明样品中含一定量的LCDV，但浓度较A3、B3低；A4、B1表明样品中LCDV含量较低。

图3.抗原浓度与信号强度的关系及此免疫芯片的检测限。所检测的抗原浓度依次为25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μg/mL。以抗原浓度的对数值为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在0.8～12.8μg/mL范围内，相对荧光信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来详细说明本发明。

本发明所用仪器及试剂如下：

小型手动芯片点样***(购自Whatman公司)；晶芯

EcoScan^TM-100 CCD扫描仪(购自北京博奥生物公司)；Cy3抗体标记试剂盒(购自GE公司)；HiTrap Protein G SepharoseColumn(购自GE公司)；1640(购自GIBCO公司)；胎牛血清(购自HYCLONE公司)；牛血清白蛋白(购自SIGMA公司)；Tween-20(购自SIGMA公司)；二甲基亚砜(购自SIGMA公司)。

实施例1：

1.抗体的制备及纯化

从患淋巴囊肿病毒病的牙鲆体表瘤状物中提取LCDV，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗LCDV抗体。

复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株单抗B和单抗C，注射一定数量的杂交瘤细胞入小鼠腹腔生产腹水，得到大量高浓度、高特异性、高效价的鼠抗LCDV单抗。

取亲和层析纯化后的单抗B和单抗C混合，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血制备血清，得到兔抗鼠Ig的抗体。

使用Amersham Phamacia Biotech公司的亲和层析柱(HiTrap Protein G SepharoseColumn)纯化所得抗体。

2.Cy3标记的单克隆抗体探针的制备

按照Amersham Phamacia Biotech公司的Cy3产品说明书，使用荧光素Cy3对亲和层析纯化后的鼠抗LCDV单抗进行标记，并过凝胶柱纯化。

3.载玻片的预处理

将玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温作用1h，双蒸水冲洗，晾干。

4.琼脂糖凝胶基片的制备

配制1.2％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min完全溶解，将2mL琼脂糖溶液铺覆在60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，载玻片在37℃下过夜干燥；使用前用0.02mol/L NaIO₄溶液室温下活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干，室温干燥处保存。

5.芯片结构设计及点阵分布

该芯片结构如图1所示，包括芯片载体(1)、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层(2)，琼脂糖凝胶层上固定有两排四列共8个4×4的抗体微阵列(3)，点样量为50-70nL，点直径为500～600μm。各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线(4)隔开。所述的芯片载体为标准载玻片，在玻片一端可以留出标签区域(5)。

6.抗体的固定

①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗LCDV抗体，使其浓度为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001mg/mL。

②用点样仪将此不同浓度抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列为不同浓度的兔抗LCDV抗体，各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。

③在载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到鱼类LCDV免疫检测芯片。

实施例2：

步骤1、2、3、4、5同实施例1。

6.抗体的固定

①用pH 7.4的含50％甘油的PBS缓冲液稀释兔抗LCDV抗体，使其浓度为0.5mg/mL；稀释兔抗鼠Ig的抗体使其浓度为0.1mg/mL。

②用点样仪将此抗体稀释液在修饰过的载玻片表面的不同区域点样，点阵分布如图1所示，每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，其中，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液，作为阴性对照；第二、三列所点样品为兔抗LCDV抗体；第四列所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照等质量控制点。各个亚阵列之间用芯片专用围栏Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干。

③在载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到鱼类LCDV免疫检测芯片。

实施例3：

检测鱼类淋巴囊肿病毒采用的是夹心法。

步骤1、2、3、4、5、6同实施例2。

7.病原的检测

①取待检鱼类组织(表皮、鳃、胃或肠等)，与A液约按1∶10(W/V)的比例混合，匀浆，反复冻融3～4次，超声破碎后，低温离心，5000rpm×15min，取上清液作为检测样品，待检；

②将待检样品加入上述芯片同一载体不同亚阵列中，加样量为10μL/阵列，一张芯片可同时检测八个样品，注意避免不同亚阵列间的液体混合。37℃饱和湿度孵育15min、30min、45min、60min、90min、120min，洗涤，在芯片上加稀释的C液，10μL/阵列，37℃饱和湿度放置孵育15min、30min、45min、60min、90min、120min，洗涤，晾干；

③激光扫描

上述检测芯片用晶芯

EcoScan^TM-100 CCD扫描仪扫描成像，激发波长为532nm，检测波长为585nm，荧光信号用Lab-chipscanner 2.0软件分析。

检测结果分析与判定：扫描得到的图像亚阵列中，第一列阴性对照的信号强度代表实验的本底值大小；第二、三列出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测样品中有LCDV，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测样品中无LCDV。信号强弱与样品中病毒浓度有关；第四列阳性对照及固定点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题或者抗体蛋白发生变性，检测结果无效。

实施例4：

抗原的定量分析及最低检测限：

取制备好的鱼类LCDV免疫检测芯片，将分离纯化的LCDV稀释至25.6μg/mL，再按二倍比稀释所得的8个抗原浓度分别与玻片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后，扫描结果利用计算机软件处理。结果显示，随抗原浓度变化，荧光信号呈现梯度的变化。以抗原浓度的对数值为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标分析信号强度变化，结果显示抗原浓度在0.8～12.8g/mL范围内，相对信号强度和抗原浓度之间有较好的线性关系，提示所构建的抗体微阵列在一定的病毒浓度范围内可以进行定量分析。此抗体微阵列所能检测到的最低抗原浓度为1.6μg/mL。

实施例5：

鱼类LCDV免疫检测芯片的特异性检测：

取正常鱼组织(鳃、胃、表皮等)，经PCR检测未感染LCDV，组织破碎后匀浆，反复冻融后超声破碎，低温沉降10min，取上清，与鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片上的抗体微阵列孵育，经抗体探针检测后扫描，无荧光信号，证实所制备的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片与组织无交叉反应。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

工业实用性

本发明为养殖鱼类病毒、细菌等各类病原的检测诊断提供了技术平台，适用于养殖过程中的疾病监控及水产动物的出入境检验检疫等，有着广阔的应用前景，能够有效避免养殖鱼类疾病的传播与流行。

Claims (3)

1.一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：

   （1）抗体的制备              

    制备兔抗淋巴囊肿病毒抗体，兔抗鼠Ig的抗体，鼠抗淋巴囊肿病毒单克隆抗体，亲和层析法纯化所得抗体；

   （2）Cy3标记单克隆抗体探针的制备

将亲和层析纯化后的鼠抗淋巴囊肿病毒单抗用Cy3标记，并过凝胶柱纯化；

   （3）载玻片的预处理

将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温下作用1h，双蒸水冲洗，晾干；

   （4）琼脂糖凝胶基片的制备

配制1.2％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2ml琼脂糖溶液铺覆在经60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁载玻片上；待琼脂糖凝固后，将玻片在37℃下过夜干燥；使用前在室温下用0.02mol/L NaIO₄溶液活化30min，超纯水冲洗3遍，用氮气流吹干，室温干燥处保存；

   （5）抗体的固定

① 用pH 7.4的含50%甘油的PBS缓冲液稀释兔抗淋巴囊肿病毒抗体，使其浓度为0.5~0.0001mg/mL、稀释兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL；

② 用点样仪将此抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量为50~70nL，点直径为500~600μm；每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗淋巴囊肿病毒抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照；各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元；37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干；

③向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白进行封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片。

2.根据权利要求1所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于用Cy3标记亲和层析纯化后的鼠抗淋巴囊肿病毒单抗作为抗体探针，并使用兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。

3.根据权利要求1所述的鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于Cy3标记抗体探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的特异性抗淋巴囊肿病毒囊膜单抗B和单抗C，其保藏号分别为：CCTCC－C200419和CCTCC－C200420。

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