CN111534607A - 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents
用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111534607A CN111534607A CN201910824895.3A CN201910824895A CN111534607A CN 111534607 A CN111534607 A CN 111534607A CN 201910824895 A CN201910824895 A CN 201910824895A CN 111534607 A CN111534607 A CN 111534607A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vibrio cholerae
- detecting
- toxigenic
- gene
- vibrio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 title claims abstract description 72
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 title claims abstract description 72
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 title claims abstract description 47
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims abstract description 41
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 25
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims description 21
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 9
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 7
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 7
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 12
- 101150101299 gene 4 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 238000011276 addition treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007418 data mining Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229930013356 epothilone Natural products 0.000 description 1
- HESCAJZNRMSMJG-KKQRBIROSA-N epothilone A Chemical class C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@@H]2CCC[C@@H]([C@@H]([C@@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@@H](O)CC(=O)O1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 HESCAJZNRMSMJG-KKQRBIROSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 208000011140 intestinal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000002349 well water Substances 0.000 description 1
- 235000020681 well water Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分霍乱弧菌与其它弧菌属,以及产毒和非产毒的霍乱弧菌属,通过综合判断,得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比,本发明用于检测产毒霍乱弧菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势,具有良好的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域,具体涉及一种通过特异性基因对产毒霍乱弧菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
弧菌属是革兰氏阴性菌的一种,属于兼性厌氧型细菌,可通过呼吸和发酵代谢产生能量。弧菌属多存在于水中,其中典型代表性的弧菌种类具有致病性,例如:霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus,又称为副溶血弧菌)及创伤弧菌(Vibrio vulnificus、俗称为海洋弧菌)等。
霍乱弧菌,菌体短小呈逗点状,有单鞭毛、菌毛,部分有荚膜。霍乱弧菌共分为155个血清群,其中O1群和O139群可引起霍乱。自然情况下,霍乱弧菌主要通过污染的水源或饮食食物经口而引起肠道感染,具体临床症状表现为:剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。主要病理变化均由严重脱水引起,临床可见指纹皱缩,皮下组织及肌肉干瘪。心、肝、脾等脏器均见缩小。内脏浆膜无光泽。肠腔高度扩张、肠内充满泔水样液体,肠粘膜松弛,但粘膜上皮完整,无溃疡。胆囊内充满粘稠胆汁。肾小球及间质的毛细管扩张,肾小管肿胀、变性及坏死。其他脏器也有出血、变性等变化。
霍乱弧菌包括两个生物型:古典生物型(classical biotype)和埃尔托生物型(EL-Tor biotype)。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外,形态和免疫学性基本相同,在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来,全球共发生了七次世界性霍乱大流行,造成了人类的大量死亡,前六次病原是古典型霍乱弧菌,第七次病原是埃尔托型霍乱弧菌。霍乱弧菌分泌产生的肠毒素,是一种剧烈的致泄毒素。该毒素作用于肠壁促使肠黏膜细胞极度分泌从而使水和盐过量排出,导致严重脱水虚脱;进而引起代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭。由霍乱弧菌引起的腹泻性疾病是引起全球五岁以下儿童死亡的第二大疾病。
霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱,埃尔托生物型抵抗力较强,在河水、井水、海水中可存活1~3周,在鲜鱼、贝壳类食物上可存活1~2周。霍乱是一种烈性肠道传染病,发病急、传染性强、病死率高,属于国际检疫传染病。因此,准确快速地检测霍乱弧菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。目前,国内外对霍乱弧菌进行了大量研究,建立了很多有效的检测方法,其中细菌纯培养、生理生化检测、血清学分型及噬菌体分型已广泛应用,但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来,分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于霍乱弧菌的检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法。
具体地,上述方法包括如下步骤:
S1、收集样品;
S2、提取基因组DNA;
S3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3以及产毒特异性基因gene4;
S4、读取扩增Ct值;当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时,产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性;当所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时,产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案,所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber:KX894541.1)的检测引物如SEQ ID NO:1~2所示:
SEQ ID NO:1(5'-GGTGATGATCTGGCTCCTGG-3');
SEQ ID NO:2(5'-ACCCTTGTTACCGTGACGAC-3')。
所述霍乱弧菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3~4所示:
SEQ ID NO:3:(5'-CCCTCAGCCAGATCTTGAGC-3')(NCBI Accession Number:QBJ29380.1);
SEQ ID NO:4:(5'-TACAGTGCACGGCGTAAACT-3')(NCBI Accession Number:QBJ29381.1)。
所述霍乱弧菌属特异性基因gene2(NCBI Accession Number:AEA77965.1)的检测引物如SEQ ID NO:5~6所示:
SEQ ID NO:5:(5'-CACTCTATTTGCATGGCCGC-3');
SEQ ID NO:6:(5'-TGGCTAAATCTGCGGTGATGT-3')。
所述霍乱弧菌属特异性基因gene3(NCBI Accession Number:QBJ29687.1)的检测引物如SEQ ID NO:7~8所示:
SEQ ID NO:7:(5'-CCCCAACGCTATTTATGTGCC-3');
SEQ ID NO:8:(5'-CATCTTCTACCCGCTCAGCC-3')。
所述产毒特异性基因gene4(NCBI Accession Number:AKB08108.1)的检测引物如SEQ ID NO:9~10所示:
SEQ ID NO:9:(5'-CTAATGCTGCCAATACGCCG-3');
SEQ ID NO:10:(5'-GGATGAGGACTGTATGCCCC-3')。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR试剂盒,其包含上述的霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明通过前期对霍乱弧菌属和其他弧菌属,产毒和非产毒弧菌属的微生物的大量研究数据中,挖掘出能够区分霍乱弧菌属和其他弧菌属,产毒和非产毒弧菌属的特异性的孤儿基因,通过对特异性基因的检测,准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的霍乱弧菌,具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础,选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中,通过对设计条件和实验条件的优化,选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物,提高引物扩增的效率,能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物,实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比,本发明的两部分检测策略,能够分步判断霍乱弧菌属和其他弧菌属、产毒和非产毒弧菌属,判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒霍乱弧菌,结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围,灵敏度高,应用范围广,更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来,检测结果稳定,具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、水质抽检等各个领域来源样品筛查和检测,精准地判断出样品中是否含有产毒霍乱弧菌,操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖,生活用水监控,食品安全等各个方面的快速检验,无需额外进行微生物培养,使基因检验在日常民生中得到应用,具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例结合附图详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中,使用扩增产物构建阳性标准品质粒,并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制,得到每对检测引物的扩增效率,本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中,通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因,能够正确的区分出霍乱弧菌属和其他弧菌属,产毒和非产毒弧菌属,从而准确检测并判断出产毒霍乱弧菌。
在一些实施方案中,通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测,能够精确区分出霍乱弧菌属和其他弧菌属,产毒和非产毒弧菌属,从而准确检测并判断出产毒霍乱弧菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出,而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间,同样可以准确检出。
在一些实施方案中,采集养殖场水体、塘泥、河道水体、底泥和生活用水的样品,通过对特异性基因的检测,能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒霍乱弧菌,方便快捷。
本领域技术人员应能理解,本方法中检测的基因和设计的特异性引物,同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒霍乱弧菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于环境土壤监控、水体监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴,能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为霍乱弧菌的培养基,pH8.8~9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形,光滑,透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自霍乱弧菌提取的DNA,分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的引物进行扩增,扩增产物经过加A处理后,使用T4连接酶连入T载体,并且通过转导感受态细胞后,质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1~10所示,具体如表2。
表2
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌,收集单克隆的菌斑,并通过LB培养摇菌过夜扩增,最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株,按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度,并通过10倍稀释的方法,配置6个浓度梯度的标准品,浓度梯度分别为1μg/μL,100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增,并且绘制对应的扩增曲线,得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复,qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示,rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.980,高扩增效率在90-105%,证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度,以及6个浓度梯度下的扩增效率,均达到最优状态的要求,5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增,并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复,qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示,霍乱弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果,而其他弧菌属均显示阴性结果。因此,对于霍乱弧菌属和其他弧菌属,进行rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测,能够较好的区分霍乱弧菌属和其他弧菌属。同时,gene4基因的检测结果,产毒的霍乱弧菌属呈现检测结果阳性,而其他非产毒霍乱弧菌属和其他弧菌属呈现阴性。因此,进行gene4基因的检测,能够较好的区分产毒和非产毒的弧菌属。综上所述,rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的对应引物,能够满足弧菌属中霍乱弧菌属的检测判断,gene4基因的对应引物,能够满足产毒和非产毒弧菌属的检测判断。
表6
表7
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为霍乱弧菌的培养基,pH8.8~9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形,光滑,透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验,收集菌体后进行浓度计算,并且10稀释得到10个菌/ml,100个菌/ml,1000个菌/ml,和10000个菌/ml,对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示,从10个菌至10000个菌的范围内,霍乱弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果。因此,通过进行rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测,能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内霍乱弧菌属的检出。同时,从10个菌至10000个菌的范围内,gene4基因的检测结果,产毒的霍乱弧菌属呈现检测结果阳性,而其他非产毒霍乱弧菌属呈现阴性。因此,进行gene4基因的检测,能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的弧菌属的检测和区分。综上所述,可以通过rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因的搭配检测,较好的完成产毒霍乱弧菌的检测,检测范围可以从10个菌株至10000个菌株,更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内,能够达到预期的检测要求。
表8
表9
实施例4环境样品的检测
1.环境样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的虾塘水和对应底泥、河道污水和对应底泥,以及生活污水和过滤水,按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示,除了河道污水和过滤水,其他样品均检出rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上,证明相应的样品来源中含有霍乱弧菌。而除了河道污水、过滤水、一个河道底泥和一个生活污水样品外,其他样品均检出gene4基因,证明对应的样品来源中含有产毒的霍乱弧菌。最终判断为产毒霍乱弧菌阳性的准则为,rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环,同时gene4基因检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因均检测得到Ct值大于35个循环,或者,gene4基因检测得到Ct值大于35个循环,则判断为产毒霍乱弧菌阴性未检出。
表10
表11
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微芯生物科技有限公司
<120> 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgatgatc tggctcctgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acccttgtta ccgtgacgac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctcagcca gatcttgagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacagtgcac ggcgtaaact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cactctattt gcatggccgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggctaaatc tgcggtgatg t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccaacgct atttatgtgc c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcttctac ccgctcagcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctaatgctgc caatacgccg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggatgaggac tgtatgcccc 20
Claims (7)
1.一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、收集样品;
S2、提取基因组DNA;
S3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3,以及产毒特异性基因gene4;
S4、读取扩增Ct值;当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时,产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性;当所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时,产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,所述霍乱弧菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1~2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,所述霍乱弧菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3~4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,所述霍乱弧菌属特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5~6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,所述霍乱弧菌属特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7~8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法,其特征在于,所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9~10所示。
7.一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,包含权利要求2~6所述的霍乱弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2、gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910824895.3A CN111534607A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910824895.3A CN111534607A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111534607A true CN111534607A (zh) | 2020-08-14 |
Family
ID=71972949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910824895.3A Pending CN111534607A (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111534607A (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6106843A (en) * | 1996-12-10 | 2000-08-22 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the isolation of a nontoxinogenic vibrio cholerae strain and a process for preparing cholera vaccine from said vibrio cholerae strain |
US20060115820A1 (en) * | 2002-12-13 | 2006-06-01 | Takeshi Koizumi | Primer and probe for detecting vibrio cholerae or vibrio mimicus and detection method using the same |
CN1902316A (zh) * | 2003-10-31 | 2007-01-24 | Sbl疫苗有限公司 | 霍乱毒素b亚基的表达*** |
CN101967516A (zh) * | 2010-04-12 | 2011-02-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法 |
RU2458141C1 (ru) * | 2011-03-14 | 2012-08-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
CN105950748A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-21 | 胡成进 | 一种基于rpoB基因鉴定高同源性海洋弧菌的方法 |
WO2019014462A1 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | LIVING VACCINE ATTENUATED AGAINST CHOLERA WITH PROBIOTIC PROPERTIES |
-
2019
- 2019-09-02 CN CN201910824895.3A patent/CN111534607A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6106843A (en) * | 1996-12-10 | 2000-08-22 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the isolation of a nontoxinogenic vibrio cholerae strain and a process for preparing cholera vaccine from said vibrio cholerae strain |
US20060115820A1 (en) * | 2002-12-13 | 2006-06-01 | Takeshi Koizumi | Primer and probe for detecting vibrio cholerae or vibrio mimicus and detection method using the same |
CN1902316A (zh) * | 2003-10-31 | 2007-01-24 | Sbl疫苗有限公司 | 霍乱毒素b亚基的表达*** |
CN101967516A (zh) * | 2010-04-12 | 2011-02-09 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种霍乱弧菌分型及毒力基因检测试剂盒及其检测方法 |
RU2458141C1 (ru) * | 2011-03-14 | 2012-08-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации токсигенных штаммов v. cholerae o1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления |
CN105950748A (zh) * | 2016-06-03 | 2016-09-21 | 胡成进 | 一种基于rpoB基因鉴定高同源性海洋弧菌的方法 |
WO2019014462A1 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | LIVING VACCINE ATTENUATED AGAINST CHOLERA WITH PROBIOTIC PROPERTIES |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
金大智;张政;罗芸;叶菊莲;程苏云;吴方;金郁;: "多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因" * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112048572B (zh) | 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒 | |
CN111485028A (zh) | 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒 | |
CN111485034A (zh) | 用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量rt-pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN101381767A (zh) | 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法 | |
CN108103152B (zh) | 一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法 | |
CN109811073A (zh) | 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用 | |
CN111534607A (zh) | 用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN110699470A (zh) | 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重pcr引物、试剂盒、应用和方法 | |
CN106755518B (zh) | 一种梭子蟹肌孢虫实时定量pcr检测试剂盒 | |
CN112094854B (zh) | 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒 | |
CN113817854B (zh) | 一种单标记ssDNA探针可视化检测沙门氏菌基因的方法 | |
CN111334613B (zh) | 用于检测犬腺病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN111676300A (zh) | 用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN111534611A (zh) | 用于检测产毒猪链球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN111518927A (zh) | 用于检测恶臭假单胞菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒 | |
CN111996268A (zh) | 溶藻弧菌双重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法 | |
CN111534608A (zh) | 用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN111518922A (zh) | 用于检测产毒副溶血性弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN113403427B (zh) | 一种反转录多重套式pcr检测引物 | |
CN111534614A (zh) | 用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 | |
CN113337626B (zh) | 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 | |
KR101203067B1 (ko) | 노로바이러스 표준양성대조군 유전자 (rna 전사체) | |
CN111218526B (zh) | 一种快速鉴别i亚群血清11型禽腺病毒的pcr引物对和探针及其应用 | |
CN116144808A (zh) | 一种大肠埃希菌快速核酸检测的引物组合及检测方法 | |
CN111518923A (zh) | 用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200814 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |