CN111676300A

CN111676300A - 用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒

Info

Publication number: CN111676300A
Application number: CN201911099577.1A
Authority: CN
Inventors: 曹亮; 张智闵; 连政汉; 张新帅; 王萌萌; 王璋; 赵亮; 郝祎琪; 蒋华; 束文圣
Original assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2020-09-18

Abstract

本发明公开了一种检测产毒肺炎衣原体荧光定量PCR的方法及试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分肺炎衣原体属与其它衣原体属，以及产毒和非产毒的肺炎衣原体属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒肺炎衣原体试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒肺炎衣原体进行荧光定量PCR的检测方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)无运动力，能独立进行有限的代谢活动。肺炎衣原体染色体有DNA和RNA两种核酸，只能在细胞内复制、繁殖，发育周期分为原体和网状体两阶段。原体平均直径为0.38nm，在电镜下呈梨形，并有清晰的周浆间隙，原体中无质粒DNA。Giemsa染色呈紫色，Macchiavello 染色呈红色。原体具有高度感染性，在宿主细胞外较为稳定，无繁殖能力。当进入宿主易感细胞后，细胞膜位于原体外形成空泡。原体在空泡中逐渐发育、增大成为始体。根据遗传性和生物学特性，肺炎衣原体可分为TWAR、考拉和马肺炎衣原体3个生物变种。

人类肺炎衣原体感染呈世界性流行，不分地域、不受种族和年龄限制。肺炎衣原体TWAR生物变种仅是从人分离到，同时也只有1个血清变种。TWAR 对呼吸***有致病性，最突出的是引起急性或慢性支气管炎和肺炎。此外，还与急性或慢性呼吸道疾病如中耳炎、肺阻塞性疾病以及动脉粥样硬化、哮喘、结节性红斑、反应性呼吸道疾病、Reiter氏综合征、肉样瘤病等有关。

临床依据肺炎衣原体感染患者的症状和体征，很难鉴别细菌性、病毒性、肺炎支原体或肺炎衣原体的感染，以致在临床用药上存在困难，一般只能依赖实验室通过人体体液标本进行病因检测。常用的微生物学检查方法包括分离培养和血清学检测，存在灵敏性差、试验过程复杂等特点。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定肺炎衣原体特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于肺炎衣原体的诊断检测。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法。具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；

S4、读取扩增Ct值；当所述肺炎衣原体属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒肺炎衣原体的检测结果为阳性；当所述肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35 和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒肺炎衣原体的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述肺炎衣原体属特异性基因rpoB (NCBI AccessionNumber：KT737262.1)的检测引物如SEQ ID NO：1～2所示：

SEQ ID NO：1(5′-CCCGTGATATCCCCAACGTT-3′)；

SEQ ID NO：2(5′-CACGGACGTTTTGCACACTT-3′)。

所述肺炎衣原体属特异性基因genel(NCBI Accession Number：VEU56921.1) 的检测引物如SEQ ID NO：3～4所示：

SEQ ID NO：3(5′-GTGCGAGTGTTTGTGCCATT-3′)；

SEQ ID NO：4(5′-AATGGCAGGGTCAAGGTCAC-3′)。

所述肺炎衣原体属特异性基因gene2(NCBI Accession Number：VEU56963.1) 的检测引物如SEQ ID NO：5～6所示：

SEQ ID NO：5(5′-GCTATGACAAGATGCGTGCC-3′)；

SEQ ID NO：6(5′-GCATGGGTTGGGGTATCACT-3′)。

所述肺炎衣原体属特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO：7～8所示：

SEQ ID NO：7(5′-TCAAGGGCAAACTGAAACGC-3′)(NCBI Accession Number：VEU57467.1)；

SEQ ID NO：8(5′-CCGGACGGCTAAAGTTACCT-3′)(NCBI Accession Number：VEU57468.1)。

所述产毒特异性基因gene4(NCBI Accession Number：VEU57495.1)的检测引物如SEQ ID NO：9～10所示：

SEQ ID NO：9(5′-GGTTACAGTGCGGACAAACC-3′)；

SEQ ID NO：10(5′-AGATCTTCCCAGCAAACGGT-3′)。

本发明另一目的是提供一种用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对肺炎衣原体属和其他衣原体属，产毒和非产毒衣原体属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分肺炎衣原体属和其他衣原体属，产毒和非产毒衣原体属的特异性基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出样品中是否含有产毒的肺炎衣原体，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断肺炎衣原体属和其他衣原体属、产毒和非产毒衣原体属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒肺炎衣原体，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于对于肺泡、皮肤、尿液和脑脊液等各个来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒肺炎衣原体，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于医学等方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1是rpoB基因检测引物标准曲线。

图2的gene1基因检测引物标准曲线。

图3是gene2基因检测引物标准曲线。

图4是gene3基因检测引物标准曲线。

图5是gene4基因检测引物标准曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出肺炎衣原体属和其他衣原体属，产毒和非产毒衣原体属，从而准确检测并判断出产毒肺炎衣原体。

在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出肺炎衣原体属和其他衣原体属，产毒和非产毒衣原体属，从而准确检测并判断出产毒肺炎衣原体。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、脑脊液和过滤水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒肺炎衣原体，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测产毒肺炎衣原体荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于医学等检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为产毒创伤弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组DNA提取

按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自肺炎衣原体提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2 基因、gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO：1～10所示，具体如表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置5个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL， 10ng/μL，lng/μL，100pg/μL，10pg/μL。

5.检测引物标准曲线绘制

按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个 qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene4 基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2＞0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。

表4

实施例2阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qPCR检测

按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。

表5

4.结果分析

5对引物的qPCR扩增结果显示，肺炎衣原体属呈现rpoB基因、gene1基因、 gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果，而其他衣原体属均显示阴性结果。因此，对于肺炎衣原体属和其他衣原体属，进行rpoB基因、gene1 基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的区分肺炎衣原体属和其他衣原体属。同时，gene4基因的检测结果，产毒的肺炎衣原体属呈现检测结果阳性，而其他非产毒肺炎衣原体属和其他衣原体属呈现阴性。因此，进行gene4基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的衣原体属。综上所述，rpoB基因、gene1 基因、gene2基因和gene3基因的对应引物，能够满足衣原体属中肺炎衣原体的检测判断，gene4基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒衣原体属的检测判断。

表6

实施例3检测体系的灵敏度

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为创伤弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qPCR检测

同实施例2。

4.结果分析

5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，肺炎衣原体属呈现rpoB基因、genel基因、gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因、genel基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内肺炎衣原体属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene4基因的检测结果，产毒的肺炎衣原体属呈现检测结果阳性，而其他非产毒肺炎衣原体属呈现阴性。因此，进行gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的衣原体属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene4基因的搭配检测，较好的完成产毒肺炎衣原体的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

表7

实施例4环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组DNA的提取

分别收集不同的肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、脑脊液和过滤水，按照 Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.5个目标基因的qPCR检测

同实施例2。

3.结果分析

5对引物的qPCR扩增结果显示，除了脑脊液和过滤水，其他样品均检出rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上，证明相应的样品来源中含有肺炎衣原体。而除了皮肤分泌物、尿液、脑脊液、过滤水和一个肺泡灌洗液样品外，其他样品均检出gene4基因，证明对应的样品来源中含有产毒的肺炎衣原体。最终判断为产毒肺炎衣原体阳性的准则为，rpoB基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环，同时gene4基因检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1 基因、gene2基因和gene3基因均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene4 基因检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒肺炎衣原体阴性未检出。

表8

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东美格基因科技有限公司

<120> 用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccgtgatat ccccaacgtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacggacgtt ttgcacactt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcgagtgt ttgtgccatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatggcaggg tcaaggtcac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctatgacaa gatgcgtgcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcatgggttg gggtatcact 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaagggcaa actgaaacgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggacggct aaagttacct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggttacagtg cggacaaacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatcttccc agcaaacggt 20

Claims

1.一种用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和基因gene3，以及产毒特异性gene4；

S4、读取扩增Ct值；当所述肺炎衣原体属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因Ct值均小于35时，产毒肺炎衣原体的检测结果为阳性；当所述肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和基因gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒肺炎衣原体的检测结果为阴性。

2.根据权利要求1所述的用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述肺炎衣原体属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO：1～2所示。

3.根据权利要求1所述的用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述肺炎衣原体属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO：3～4所示。

4.根据权利要求1所述的用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述肺炎衣原体属特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO：5～6所示。

5.根据权利要求1所述的用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述肺炎衣原体属特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO：7～8所示。

6.根据权利要求1所述的用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO：9～10所示。

7.一种用于检测产毒肺炎衣原体的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含权利要求2～6所述的肺炎衣原体属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。