CN110699470A - 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重pcr引物、试剂盒、应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物、试剂盒、应用和方法；所述双重PCR引物包括用于沙门氏菌检测的STN引物组和用于鸡白痢/鸡伤寒检测的SEP引物组；所述STN引物组包括引物STN‑F和引物STN‑R；所述SEP引物组包括引物SEP‑F和引物SEP‑R；所述试剂盒包括所述的双重PCR引物；所述双重PCR检测方法包括步骤：模板DNA制备：提取待测样品DNA；双重PCR扩增：利用双重PCR引物的引物STN‑F、引物STN‑R、引物STN‑F和引物STN‑R进行双重PCR扩增；扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断。本发明实现了一次PCR中检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型，优化后的双重PCR方法具有特异性良好的特点。

Description

一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引 物、试剂盒、应用和方法

技术领域

本发明属于疫病检测技术领域，具体涉及一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物、试剂盒、应用和方法。

背景技术

沙门氏菌隶属于肠杆菌科沙门氏菌属，是一种具有重要公共卫生学意义的人畜共患病原菌。现已发现超过2600种不同血清型的沙门氏菌，目前发现除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其他血清型沙门氏菌都有周身鞭毛。鸡白痢沙门氏菌可引起鸡白痢，对雏鸡具有较高的死亡率；鸡伤寒沙门氏菌会引起败血性传染病，其致病菌同鸡白痢沙门菌类似，这两种病常相伴发生，但鸡白痢主要宿主为雏鸡，而伤寒表现出全年龄段感染。鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的感染给规模化鸡场带来严重的经济损失。

除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其它血清型如肠炎沙门氏菌等在规模化鸡场中时有检出。沙门氏菌为肠道微生物，在禽肉/禽蛋生产加工过程中有可能会导致污染，最终该菌经由上述方式进入人类食物链，威胁人类健康。美国在2010年连续有2000多例腹泻病例是食用被沙门氏菌感染的鸡蛋而导致的，全美当年宣布召回5.5亿枚受影响鸡蛋，造成严重的经济损失和恶劣的社会影响。

传统分离培养法是检测沙门氏菌的金标准。按照国家标准“食品微生物学检验沙门氏菌检验(GB4789.4—2016)中提出的沙门氏菌检验方法，需要对样品进行培养、分离、生化检验以及血清型检验，结果准确，但步骤较为繁琐、费时费力。目前种鸡场主要采用全血平板凝集试验监测鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌抗体，但该方法适用于产卵母鸡及1年以上公鸡，幼龄检验结果不理想，同时需要大量的人力物力，存在假阳性率较高、易受操作不规范等导致污染等问题；除此之外，肠杆菌科的生化反应特异性较差，检测灵敏度和特异性有限。相比之下，PCR方法在检测上更加方便快捷，灵敏度有较大提升，可以有效的简化检测步骤，减少污染，实现高效准确检测。

目前能检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物、方法和试剂盒还未见报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物、试剂盒、应用和方法。

本发明所采用的技术方案为：

本发明的第一方面提供，一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物，所述双重PCR引物包括用于沙门氏菌检测的STN引物组和用于鸡白痢/鸡伤寒检测的SEP引物组；所述STN引物组包括引物STN-F和引物STN-R；具体核苷酸序列如下：

引物STN-F：5’-TGATGATAACGCGGTCGGTC-3’；引物STN-R：5’-TCTGACGCTCCAGACGGTTA-3’；所述SEP引物组包括引物SEP-F和引物SEP-R；引物SEP-F：5’-CACTGGAGACTCTGAGGACAA-3’；引物SEP-R：5’-GGATTGATGAGGCTAACAAGGA-3’。

进一步的，所述STN引物组的扩增产物大小为251bp；所述SEP引物组的扩增产物大小为573bp。

本发明第二方面提供，一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR检测试剂盒，包括所述的双重PCR引物。

本发明第三方面提供，一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物在一次PCR检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型中的应用。

本发明第四方面提供，一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物在制备一次PCR检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的检测试剂盒中的应用。

本发明第五方面提供，一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR检测方法，包括步骤：模板DNA制备：提取待测样品DNA；双重PCR扩增：以待测样品DNA中的鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌为模板DNA，利用权利要求1或2所述的双重PCR引物的引物STN-F、引物STN-R、引物STN-F和引物STN-R进行双重PCR扩增；扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：PCR反应终止后，取PCR产物，用1％琼脂糖凝胶加入GelView染料，于缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像仪下观察扩增结果；扩增得到251bp大小产物，则判定为待测样品中检测出沙门氏菌；扩增得到573bp大小产物，则判定待测样品中检测出鸡白痢/鸡伤寒血清型沙门氏菌。

进一步的，所述双重PCR扩增的PCR反应体系为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix：10μL，ddH₂O：6μL，模板DNA 2μL，SEP-F引物0.5μL，SEP-R引物0.5μL,STN-F引物0.5μL，STN-R引物0.5μL。

进一步的，所述PCR反应条件为：预变性温度95℃，10min；变性温度94℃，30s；退火温度57℃，30s；延伸温度72℃，30s，运行30次循环；终延伸温度72℃，10min；保存温度4℃。

进一步的，所述扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断还包括步骤：灵敏度检测：采用TE缓冲液将DNA分别作10¹-10⁹倍稀释，并采用所述PCR反应体系和PCR所述PCR反应条件进行PCR扩增，得到最低检出沙门氏菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的最低浓度。

进一步的，所述检测方法最低检出沙门氏菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的最低浓度为1.5×10^-4ng/μL。

本发明的有益效果为：本发明的一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物、试剂盒、应用和方法，在一次PCR中能检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型，通过全基因组序列比对，筛选到沙门氏菌属和鸡白痢/鸡伤寒血清型特异性片段，并设计两对PCR引物。通过优化引物配比、退火温度等反应条件，建立了能检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR方法。优化后的双重PCR方法特异性良好，沙门氏菌DNA检测灵敏度为1.5×10-4ng/μL。本发明使用该方法对送检的267份肛拭子样品进行检测，共检测出沙门氏菌7株，其中2株为鸡白痢/鸡伤寒血清型，与传统分离培养法对比符合率为100％。

附图说明

图1是最佳退火温度探究实验结果图，其中，M:DL2000 DNA Marker；1-8为鸡白痢沙门氏菌，退火温度依次为52℃-59℃；9-16为肠炎沙门氏菌，退火温度依次为52℃-59℃。

图2是最佳引物配比浓度探究结果图，其中，M:DL2000 DNA Marker；1、4、7、10、13、16、19号泳道为肠炎沙门氏菌，2、5、8、11、14、17、20为鸡白痢沙门氏菌，3、6、9、12、15、18、21为鸡伤寒沙门氏菌。①-⑦组引物配比分别为SEP 1.6μL+STN 0.4μL、SEP 1.4μL+STN 0.6μL、SEP 1.2μL+STN 0.8μL、SEP 1μL+STN 1μL、SEP 0.8μL+STN 1.2μL、SEP 0.6μL+STN 1.4μL、SEP 0.4μL+STN 1.6μL。

图3是双重PCR特异性检测结果图，其中，M:DL2000 DNA Marker；1-18分别为鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌、弯曲杆菌、普通变形杆菌、乳酸杆菌；19：纯水。

图4是DNA检测灵敏度的实验图，其中，M:DL2000 DNA Marker；1-10为鸡白痢沙门氏菌，DNA浓度分别为150ng/μL-1.5×10^-7ng/μL；11-20为肠炎沙门氏菌，DNA浓度分别为150ng/μL-1.5×10^-7ng/μL。

图5是临床样本检测结果图，其中M:DL2000 DNA Marker,1、6号泳道为检测出的鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌；2、4、7、10、11为检测到的其他沙门氏菌。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行；本实施例若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。

实施例1

1.实验材料

1.1菌株

鸡白痢沙门氏菌(ATCC13036)、鸡伤寒沙门氏菌(ATCC9184)、德尔卑沙门氏菌(ATCC6960)、都柏林沙门氏菌(ATCC 15480)、纽波特沙门氏菌(ATCC 27869)、肠炎沙门氏菌(ATCC 13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)、甲型副伤寒沙门氏菌(ATCC 9150)、海德堡沙门氏菌(ATCC 8326)、大肠杆菌(ATCC10536)购自上海北诺生物科技有限公司。其余印第安纳沙门氏菌、奇异变形杆菌、肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌、弯曲杆菌、普通变形杆菌、乳酸杆菌为本实验室鉴定保存菌株。

1.2沙门氏菌送检样品

2018年10月由四川、云南等五家养殖场送检267份肛拭子。

1.3试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，2×Taq PCRMasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司，缓冲蛋白胨水(BPW)购自北京路桥技术股份有限公司，琼脂糖购自北京擎科生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker购自成都擎科梓熙生物技术有限公司，TAE 50×购自biosharp北京兰杰柯科技有限公司，所需试剂均为分子生物学级别。

2、实验方法

2.1沙门氏菌属及鸡白痢/鸡伤寒血清型特异性基因筛选及引物设计

沙门氏菌属特异性片段为Makino S等报道的沙门氏菌肠道内毒素基因stn。通过对目前已测序的鸡白痢沙门氏菌全基因组(GenBank登录号为CP012347、CP003786、LK931482、CP003047、CP006575)和鸡伤寒沙门氏菌全基因组(GenBank登录号为CP019035、CP003786、CP003047、AM933173)与其它血清型沙门氏菌进行Blast比对分析，在鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌中筛选到一段944bp鸡白痢/鸡伤寒血清型特异性序列(CP012347，序列位置：2764607-2765550bp)。采用NCBI-Primer Blast设计双重PCR特异性引物如下表1。引物序列由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物浓度5pmol/μL。

表1沙门氏菌及鸡白痢/伤寒血清型特异性引物

2.2模板DNA制备

采用天根细菌全基因组DNA试剂盒提取细菌总DNA。包括鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌、弯曲杆菌等提取DNA，置于-20℃保存。

2.3双重PCR体系的建立

设置预变性温度95℃，10min。设置变性温度94℃，30s；设置退火温度56℃，30s；设置延伸温度72℃，30s，以上重复30次循环；设置终延伸温度72℃，10min。设置保存温度4℃。PCR体系为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix：10μL，ddH₂O：6μL，样品2μL，SEP-F引物0.2μL，SEP-R引物0.2μL,STN-F引物0.8μL，STN-R引物0.8μL。取3μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶(加入GelView染料)于0.5×TAE缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像仪下观察扩增结果并照相保存。

2.4双重PCR体系的优化

(1)最佳退火温度的探究

选取鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌的DNA作为模板，调整退火温度分别为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃对沙门氏菌进行双重PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同退火温度的扩增结果。除退火温度以外，其PCR反应体系和扩增反应条件与表2的PCR方法的构建一致。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同菌株的扩增结果。

(2)最佳引物浓度配比的探究

选取鸡白痢、鸡伤寒和鸡肠炎沙门氏菌的DNA作为模板，两对引物总量保持2μL，分别尝试SEP 0.4μL+STN 1.6μL、SEP 0.6μL+STN 1.4μL、SEP 0.8μL+STN 1.2μL、SEP 1μL+STN1μL、SEP 1.2μL+STN 0.8μL、SEP 1.4μL+STN 0.6μL、SEP 1.6μL+STN 0.4μL(此处展示数字的为一对引物的总体体积，一对两端引物量保持相同)的引物配比沙门氏菌进行双重PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同引物比例的扩增结果。除引物比例变化以外，其PCR反应体系和扩增反应条件与表2的PCR方法的构建一致。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同菌株的扩增结果。

2.5特异性试验

选用优化的双重PCR方法对鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌、弯曲杆菌、普通变形杆菌、乳酸杆菌的DNA进行PCR检测，PCR反应体系和扩增反应条件与表2的PCR方法的构建一致。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同菌株的扩增结果。

2.6 PCR灵敏度检测

使用天根细菌全基因组提取试剂盒提取鸡白痢和肠炎沙门氏菌的DNA，浓度采用Nanodrop 2000微量分光光度计进行检测，采用TE缓冲液将DNA分别作101-109倍稀释，并进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增反应条件与表2的PCR方法的构建一致。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像***下观察不同菌株的扩增结果。

2.7临床样本检测

临床样本来源于四川、云南等地送检的267只鸡肛拭子样品，每一只鸡同时采集两份肛拭子样本，均经过2mL BPW缓冲液12小时37℃预增菌，其中一份样本采用煮沸法提取细菌基因组DNA，按照本研究建立的PCR扩增体系和扩增条件进行检测，并设立阴阳性对照，取PCR产物3μL在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳后判定结果。另一份样本按照国家标准“食品微生物学检验沙门氏菌检验(GB4789.4—2016)进行检测。比较本研究建立的沙门氏菌及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的双重PCR方法与国家标准沙门氏菌检测方法的符合程度。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的最佳退火温度的探究进行退火温度优化，结果如图2所示，最佳的退火温度为57℃。

实施例3

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的最佳引物浓度配比的探究，实验结果如图2所示，最佳引物配比浓度为SEP 1μL+STN 1μL。

实施例4

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的双重PCR体系的优化研究后，得到如下表2的最佳PCR反应体系和条件。

表2优化后的双重PCR反应体系和反应条件

实施例5

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的特异性试验研究，本实施例的双重PCR特异性检测结果如图3所示。鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌可见573、251bp两条条带，其余沙门氏菌仅见251bp条带，非沙门氏菌未见条带，表明设计引物特异性良好。

实施例6

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的PCR灵敏度检测得到的实验结果如图4所示，该双重PCR检测方法最低检出沙门氏菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的最低浓度为1.5×10^-4ng/μL。

实施例7

本实施例在实施例1的基础上进行。

基于实施例1的临床样本检测得到的检测结果如图5所示，采用本研究建立的双重PCR方法从267份肛拭子样本中检测7份为沙门氏菌阳性，其中两份为鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌阳性。按照国家标准对267份肛拭子样本中的沙门氏菌进行分离鉴定及血清学分型，结果从267份样本中鉴定出沙门氏菌7株，其中鸡白痢沙门氏菌2株。结果表明本研究建立的双重PCR方法鉴定结果与国家标准方法鉴定结果符合率为100％。

根据上述实施例1-7可得到如下结论：

1.沙门氏菌PCR检测方法中目的基因的选择尤为重要，现有的用于沙门氏菌检测的基因包括invA、ipaJ、tcpS、fliC和flhB。目前与鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌有关的PCR检测方法存在不同程度的问题，主要是对鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性扩增效果不佳。本研究通过对鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌与其它血清型沙门氏菌进行全基因组比对，筛选到鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性片段并设计引物，通过NCBI primer-blast比对表明SEP引物可扩增出的基因组序列号共九个，除CP030005未标注血清型外，其余均为鸡白痢/鸡伤寒血清型，表明该引物特异性良好。肠道内毒素基因stn是沙门氏菌的特异性基因，本实验室长期以来采用该基因对沙门氏菌进行PCR鉴定，表现出较好的特异性，能够有效保证本研究建立的双重PCR方法的准确性。

2.在多重PCR方法中，退火温度、引物浓度、镁离子浓度、Taq酶的使用，以及dNTP浓度均是影响PCR结果的重要因素，其中退火温度、引物浓度的影响最大。退火温度不仅应当考虑减少引物的非特异性结合，也应该保障引物和靶标序列实现高效退火。通过设计退火温度梯度试验，确定这两对引物最适合的退火温度为57℃。不同的引物浓度配比会影响不同条带的相对亮度，直接影响扩增结果判定。通过对引物配比进行优化，发现两对引物在相同浓度时扩增条带亮度相近。此外，本研究采用2×Taq PCR MasterMix进行PCR扩增，取得了较好的结果，无非特异性条带等情况，因此本发明没有进一步对镁离子、Taq酶以及dNTP浓度进行优化。

3.在特异性检测中，本发明对多个血清型沙门氏菌及非沙门氏菌进行了检测，结果表明建立的双重PCR方法具有较好的特异性。进一步对临床送检样本进行检测，按照传统分离培养方法对送检的肛拭子样本用BPW培养基进行预增菌12h后，再通过煮沸法制备DNA模板即可进行PCR检测，结果与国家标准方法鉴定结果符合率为100％，可有效缩短检测时间。综上所述，本研究建立的检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的双重PCR方法，灵敏度高、特异性强，耗时短的特点。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢_鸡伤寒血清型的双重PCR引物、试剂盒、应用和方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 1

ttgttaatcc tgttgtctcg ctatcactgg caaccagata gtaaagaccg cgcctttacc 60

ctcaatactt ttcaccttaa tcgcgccgcc atgctgttcg atgatatttt gcaccaccgc 120

cagccccaga cctgtcccgt cagctttggt cgtaaaataa ggcgtaaaaa tcgcctccaa 180

ctgatccggg gcgatccctt tcccgctatc ggtaacagtg atgataacgc ggtcggtccc 240

actttctttt gcctctacgc taatcgttcc ctggcggcca atcgcatgaa tagcgttcag 300

gtacaaattc aacagcacct gagtcagcct gtccgggtca gcctgaatac gcttaagcgt 360

ctcattcgcc gtgaacctca actgaatctc tctgctttgg gcatcctgac tgaccagatt 420

cagggagtga gtaataatat cattgaggtt aaccgtctgg agcgtcagat gcgcgggctt 480

taccagttcg agcaattcgc ttaccacccg gttcaaacgg tcggcctctt tggccatcac 540

ctgcgccagt tcatgcgact cgccgccggc aggcgtgcgc tcggcaaagt atttcgccag 600

ccctttgacg gacgagagcg ggttacgaat ttcgtgcgcg acgcccgccg ccagatgccc 660

catcgccacc agcttttctt tacgcttcat tgcatcaagc agttctctgt gcgagcgctg 720

ataacgctga tgccaaaaaa acgccagtaa 750

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatgataac gcggtcggtc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctgacgctc cagacggtta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactggagac tctgaggaca a 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggattgatga ggctaacaag ga 22

Claims (10)

1.一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物，其特征在于：所述双重PCR引物包括用于沙门氏菌检测的STN引物组和用于鸡白痢/鸡伤寒检测的SEP引物组；所述STN引物组包括引物STN-F和引物STN-R；具体核苷酸序列如下：

引物STN-F：5’-TGATGATAACGCGGTCGGTC-3’；

引物STN-R：5’-TCTGACGCTCCAGACGGTTA-3’；

所述SEP引物组包括引物SEP-F和引物SEP-R；

引物SEP-F：5’-CACTGGAGACTCTGAGGACAA-3’；

引物SEP-R：5’-GGATTGATGAGGCTAACAAGGA-3’。

2.根据权利要求1所述的一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物，其特征在于：所述STN引物组的扩增产物大小为251bp；所述SEP引物组的扩增产物大小为573bp。

3.一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的双重PCR引物。

4.一种权利要求1所述的一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物在一次PCR检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型中的应用。

5.一种权利要求1所述的一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR引物在制备一次PCR检测沙门氏菌并同时鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的检测试剂盒中的应用。

6.一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重PCR检测方法，其特征在于：包括步骤：

模板DNA制备：提取待测样品DNA；

双重PCR扩增：以待测样品DNA中的鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌为模板DNA，利用权利要求1或2所述的双重PCR引物的引物STN-F、引物STN-R、引物STN-F和引物STN-R进行双重PCR扩增；

扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：PCR反应终止后，取PCR产物，用1％琼脂糖凝胶加入GelView染料，于缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像仪下观察扩增结果；扩增得到251bp大小产物，则判定为待测样品中检测出沙门氏菌；扩增得到573bp大小产物，则判定待测样品中检测出鸡白痢/鸡伤寒血清型沙门氏菌。

7.根据权利要求6所述的双重PCR检测方法，其特征在于：所述双重PCR扩增的PCR反应体系为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix：10μL，ddH₂O：6μL，模板DNA 2μL，SEP-F引物0.5μL，SEP-R引物0.5μL,STN-F引物0.5μL，STN-R引物0.5μL。

8.根据权利要求7所述的双重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：预变性温度95℃，10min；变性温度94℃，30s；退火温度57℃，30s；延伸温度72℃，30s，运行30次循环；终延伸温度72℃，10min；保存温度4℃。

9.根据权利要求8所述的双重PCR检测方法，其特征在于：所述扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断还包括步骤：灵敏度检测：采用TE缓冲液将DNA分别作10¹-10⁹倍稀释，并采用所述PCR反应体系和PCR所述PCR反应条件进行PCR扩增，得到最低检出沙门氏菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的最低浓度。

10.根据权利要求6所述的双重PCR检测方法，其特征在于：所述检测方法最低检出沙门氏菌以及鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌的最低浓度为1.5×10^-4ng/μL。

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