CN111533788B - 一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用。该抗菌肽L10，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明以无乳链球菌群体交流***中的短链疏水肽为靶向抗菌肽的靶向区，以富含正电荷的人细胞外超氧化物歧化酶213‑220片段为基础片段，修饰后形成细胞穿透结构域，将二者连接构建具有靶向无乳链球菌及细胞穿透能力的新型抗菌肽L10，其表现出较好的靶向效果，在对其他菌影响较小的情况下，对无乳链球菌有高效的抗菌活性。抗菌肽L10的细胞毒性低，并且同时可以杀灭胞内的无乳链球菌，提高了其替代抗生素的发展潜力。

Description

一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用。
背景技术
随着抗生素的滥用增加，耐药性问题日益受到重视。抗菌肽作为最具潜力的抗生素替代物也受到了研究人员的关注。普遍认为抗菌肽的作用机制是利用正电荷残基与细菌细胞膜产生静电作用，随后将疏水新氨基酸***到膜中，破坏膜的完整性，内容物外泄，使细菌死亡。正是由于这种独特的作用机制，细菌很难对抗菌肽产生耐药性。然而，破膜作用机制也使得抗菌肽对病原微生物或者益生菌均有抗菌作用，破坏微生物区系平衡。目前，在人体中鉴定出超过7000万种16s RNA，微生物群落与宿主的生命活动息息相关。除此之外，传统抗生素不能够穿透哺乳细胞的细胞膜，有效地杀灭已经入侵到胞内的病原微生物。因此，设计出具有靶向抗菌能力及细胞穿透功能的抗菌肽具有十分重要的意义。
无乳链球菌是一种可以存活在细胞内，对家畜及人类都具有传染性的病原菌。在无乳链球菌的群体感应***中，短链疏水肽发挥重要的作用。前体肽经膜上受体转运至胞外，经酶切后，由膜上的寡肽转运蛋白转运至胞内，结合与胞内的特异性受体，发挥调节群体活性的功能。但是，由于短链疏水肽的疏水性大，很难直接与抗菌肽相连，发挥作用。
发明内容
基于以上不足之处，本发明提供一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用，对无乳链球菌具有靶向的杀灭作用，对其他微生物没有影响。
本发明所采用的技术方案如下：一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、如上所述的一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10的制备方法，其特点是：选取无乳链球菌的短链疏水肽作为靶向区域，对富含正电荷的人细胞外超氧化物歧化酶213-220片段修饰，形成细胞穿透结构域，将二者连接得到抗菌肽L10，其序列如SEQ IDNo.1所示。
2、如上所述的一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10在制备治疗无乳链球菌感染性疾病药物中的应用。
本发明得到的抗菌肽L10，对无乳链球菌具有靶向的杀灭作用，对其他微生物没有影响。同时，抗菌肽L10细胞毒性小，可以杀灭胞内无乳链球菌，证明了其具有成为抗无乳链球菌靶向穿透药物的潜力。细胞穿透肽可以通过胞吞机制转运至胞内，并且具有载体转运功能。抗菌药物与细胞穿透肽相连，可以使药物进入至胞内，杀灭胞内细菌，具有很大的应用前景。
附图说明
图1是L10的细胞毒性图；
图2是L10对于小鼠巨噬细胞细胞中无乳链球菌的抗菌能力图。
具体实施方式
下面举例对本发明做进一步的说明：
实施例1
一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10的制备方法如下：
(1)选取无乳链球菌的短链疏水肽作为靶向区域，对富含正电荷的人细胞外超氧化物歧化酶213-220片段修饰，形成细胞穿透结构域，将二者连接得到L10；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后得到多肽；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽L10的制备，其序列如SEQ ID No.1所示。抗菌肽L10的序列及理化参数如表1所示。
表1 L10的序列及理化参数
Figure BDA0002430563200000021
实施例2
1、抑菌活性
将肽配置成为2.56mM储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2、3所示。
表2 L10对革兰式阳性菌的抗菌活性
Figure BDA0002430563200000031
表3 L10对革兰式阴性菌的抗菌活性
Figure BDA0002430563200000032
2、细胞毒性
抗菌肽的细胞毒性可以通过噻唑蓝(MTT)比色法进行检测，主要方法如下：在96孔板中每孔加入1.0-2.0×104个细胞，然后用抗菌肽进行处理，抗菌肽的浓度从1-128μM变化。在37℃下，培养18-24h，然后再与MTT(50μl,0.5mg/ml)培育4小时，然后再1,000×g条件下离心5分钟。上清弃去。随后，用150μl的二甲基亚砜去溶解孔底的甲瓒，细胞毒性可以通过酶标仪在492nm的吸光值进行检测，如图1所示，结果显示在64μM、32μM、16μM、8μM、4μM、2μM的条件下，细胞经L10处理后，仍可以保持80％、99％、107％、114％、116％及123％的细胞存活率，表明L10具有良好的生物相容性。
3、胞内抑菌活性
通过细胞内细菌活死数检测L10的抗菌能力，主要方法如下：在24孔板中每孔加入1.0-2.0×105个细胞。培养24小时后，向孔中加入2×106CFU个无乳链球菌，侵染1小时。向孔中加入100mg/mL庆大霉素和5μg/mL盘尼西林，孵育1小时，杀灭胞外细菌。利用PBS将抗生素清洗干净后，加入不同浓度的L10孵育2、6和8小时。利用PBS将剩余L10清洗后，利用0.025％的Triton-100破坏细胞膜，利用平板稀释法计算胞内细菌数目，如图2所示,结果显示已经被无乳链球菌感染的小鼠巨噬细胞经L10处理4小时、6小时及8小时后，胞内的无乳链球菌存活率分别为4.7％、0.8％及0.3％，表明L10具有很好的胞内抗菌能力。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽及制备方法和应用
<140> 2020102346052
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Leu Ile Ile Val Gly Gly Lys Arg Arg Arg-NH2
1 5 10

Claims (3)

1.一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10的制备方法，其特征在于：选取无乳链球菌的短链疏水肽作为靶向区域，对富含正电荷的人细胞外超氧化物歧化酶213-220片段修饰，形成细胞穿透结构域，将二者连接得到抗菌肽L10，其序列如SEQID No.1所示。
3.如权利要求1所述的一种靶向无乳链球菌的细胞穿透抗菌肽L10在制备治疗无乳链球菌感染性疾病的药物中的应用。
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