CN113185599B - 一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽及制备方法和应用。抗菌肽F6的序列如SEQ ID No.1所示。本发明以人髓化分样蛋白MD‑2的119‑132片段为基础片段，利用亮氨酸定点突变技术，构建出靶向革兰氏阳性菌的抗菌肽F6。在最小抑菌浓度试验和单细菌培养体系抗菌试验中，本发明的F6多肽表现出了极强的抗金黄色葡球菌的抗菌能力，无革兰氏阴性菌能力。在混合体系的选择性杀菌试验中，F6可以优先地杀灭金黄色葡萄球菌，对大肠杆菌几乎无影响，表明其作为特异性抗革兰氏阳性菌抗菌药物及作为特异性抗革兰氏阳性菌多肽分子探针的潜力。

Description

一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽及制备方法和应用。
背景技术
人类身体中共生着大量的微生物，现有研究已经表明共生微生物与人类生命活动息息相关。目前，抗生素的滥用使得细菌耐药性问题受到重视。抗菌肽作为一类小分子的抗菌物质，由于独特的抗菌机制，被认为是较为优秀的抗生素替代物。然而，正是由于其独特的抗菌机制，抗菌肽对益生菌仍具有作用，容易造成微生物区系平衡失调，造成机体损伤。因此，对特异性病原菌具有特异杀灭能力的抗菌肽，极具应用前景。除此之外，由于缺少能够移除特异性微生物的生物探针，了解特异微生物在微生物群落中所起的作用是十分困难的。现有的人源MD-2的119-132片段对于革兰氏阳性菌无抗菌能力，只对革兰氏阴性菌有抗菌能力，金黄色葡球菌属于革兰氏阳性菌，现需要一种能够移除特金黄色葡球菌的生物探针，用于了解金黄色葡球菌在微生物群落中所起的作用。
发明内容
基于以上不足之处，本发明提供一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽F6，该抗菌肽是一种能够专门杀灭金黄色葡球菌的靶向抗菌肽。
本发明所采用的技术如下：一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽F6，序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还公开一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽F6的制备方法，步骤如下：
(1)选取人的髓化分样蛋白MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变方法，利用亮氨酸替代第二位置丝氨酸、第四位置的赖氨酸和第七位置的赖氨酸；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽F6；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽F6的制备。
本发明还公开一种靶向金黄色葡球菌抗菌肽F6在制备专门消除金黄色葡球菌的特异性的多肽分子探针中的应用。
本发明的有益效果及优点：本发明的抗菌肽F6，对金黄色葡球菌具有很强的抗菌能力，对革兰氏阴性菌抗菌能力弱。同时，在金黄色葡球菌和大肠杆菌的混合培养体系中，F6可以有效地杀灭金黄色葡球菌，对大肠杆菌的影响较小。本发明的抗菌肽F6可作为特异性的多肽分子探针，用于研究金黄色葡球菌在微生物群落中的作用。
附图说明
图1是抗菌肽F6在单细菌体系中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生存率的影响对比图；
图2是抗菌肽F6在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌混合培养体系中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生存率的影响对比图；
图3是抗菌肽F6对小鼠巨噬细胞RAW264.7活性的影响图。
具体实施方式
下面举例对本发明做进一步的说明：
实施例1
将人源MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变技术，利用亮氨酸替代第二位置丝氨酸、第四位置的赖氨酸、第七位置的赖氨酸。F6的序列及理化参数如表1所示。
表1 F6的序列及理化参数
Figure BDA0003012975110000021
实施例2
1.最小抑菌浓度检测
将肽配置成为2.56mM储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2、3所示。
表2 MD-2119-132、F6对革兰氏阴性菌的抗菌活性
Figure BDA0003012975110000022
表3 MD-2119-132、F6对革兰氏阳性菌的抗菌活性
Figure BDA0003012975110000023
人源MD-2的119-132片段对于革兰氏阳性菌并无能力。经改造后的突变体多肽F6，其抗菌谱与原有片段完全不同，极大的提升了对革兰氏阳性菌的抗菌能力，并且为靶向革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌并无抗菌能力。该实施例表明，F6可以成为良好的靶向药物及靶向革兰氏阳性菌的特异性多肽探针。
实施例3
1.单细菌培养体系中F6的细菌选择性
将肽配置成为2.56mM储存液备用。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测大肠杆菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液(～105个/mL)于各孔中。设置阳性对照，含有菌液而不含有抗菌肽。37℃恒温培养1h，吸取50μL悬浊液，用生理盐水适当稀释后涂布于MHA琼脂板上，培养24小时后计数。结果如图1所示。
该实施例表明，在单细菌培养体系中，在1μM浓度时，F6可以完全清除金黄色葡萄球，而MD-2119-132则对金黄色葡萄球菌毫无影响。在64μM浓度处理时，F6对大肠杆菌没有显著的抗菌能力，而MD-2119-132则可以完全消除大肠杆菌。该结果表明，F6对金黄色葡球菌的清除能力远远高于大肠杆菌，并对大肠杆菌几乎没有影响。
2.混合细菌培养体系中F6的抗菌活性
将肽配置成为2.56mM储存液备用。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后添加等体积大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合菌液(～105个/mL)于各孔中。设置阳性对照，含有菌液而不含有抗菌肽。37℃恒温培养1h，吸取50μL悬浊液，用生理盐水适当稀释后涂布于MHA琼脂板上，培养24小时后计数。结果如图2所示。
该结果表明，在混合培养体系中，MD-2119-132对大肠杆菌有抗菌能力，并且在高浓度时对金黄色葡球菌也有影响。但本发明的抗菌肽F6，在低浓度时，可完全清除混合微生物群落中的金黄色葡萄球菌，并且在高浓度时，清除金黄色葡萄球菌的同时，对大肠杆菌几乎无影响。
实施例4
抗菌肽的细胞毒性可以通过噻唑蓝(MTT)比色法进行检测，主要方法如下：在96孔板中每孔加入1.0-2.0×104个小鼠RAW264.7细胞，然后用抗菌肽进行处理，抗菌肽的浓度从1-64μM变化。在37℃下，培养18-24h，然后再与MTT(50μl,0.5mg/ml)培育4小时，然后再1,000×g条件下离心5分钟。上清弃去。随后，用150μl的二甲基亚砜去溶解孔底的甲瓒，细胞毒性可以通过酶标仪在492nm的吸光值进行检测。结果如图3所示。
该结果表明，本发明的抗菌肽F6在高浓度处理小鼠RAW264.7细胞后，细胞仍能保持较好的活性，表明F6的生物相容性良好。
综上所述，实例1、2、3和4的结果显示，F6具有很强的抗金黄色葡球菌能力，较强的清除金黄色葡球菌的能力，并且在微生物群落中可以特异性地清除金黄色葡球菌，对革兰氏阴性菌几乎影响。并且抗菌肽F6还表现出极好的生物相容性。以上结果表明F6可以作为特异性抗金黄色葡球菌感染的抗菌药物，并且可作为特异性的多肽分子探针，研究金黄色葡球菌在微生物群落中的作用。
<110> 东北农业大学
<120> 一种靶向金黄色葡球菌的抗菌肽及制备方法和应用
<140> 2021103810462
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Leu Phe Leu Gly Ile Leu Phe Ser Lys Gly Lys Tyr Lys-NH2
1 5 10

Claims (3)

1.一种靶向金黄色葡球菌抗菌肽F6，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种靶向金黄色葡球菌抗菌肽F6的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)选取人的髓化分样蛋白MD-2的119-132片段，采用定点氨基酸突变方法，利用亮氨酸氨酸替代第二位置丝氨酸、第四位置的赖氨酸、第七位置的赖氨酸；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到抗菌肽F6；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成抗菌肽F6的制备。
3.根据权利要求1所述的一种靶向金黄色葡球菌抗菌肽F6在制备治疗金黄色葡球菌引发的感染性疾病的药物中的应用。
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