CN114349825B - 一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于多肽药物技术领域，公开了一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用。所述蝎毒衍生肽氨基酸序列为：FFGRLFKLAVKIIPSLFK。所述蝎毒衍生肽对正常细胞的毒性较低，具备良好的安全性；且所述蝎毒衍生肽对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等细菌具有显著的抑制作用；同时，可通过对NF‑κB的调控影响下游炎症因子的表达，起到抗炎及免疫调节作用。

Description

一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用

技术领域

本发明属于多肽药物技术领域，尤其涉及一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用。

背景技术

大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)属革兰氏阴性短杆菌，可引起尿道、血液、皮肤和软组织感染，严重感染可能危及生命安全。且因大肠埃希菌血清型众多，免疫预防的效果并不理想，因此抗菌药物依旧是目前主要的治疗方案。但由于广谱抗生素的过度使用，大肠埃希菌的耐药程度变得越来越严重，并且耐药菌株具有通过水平基因转移积累抗性基因的能力，导致临床现有抗生素疗效下降甚至完全失效。因此，研发出不易使细菌产生耐药性的新型抗菌药物对于临床治疗具有重要意义。

抗菌肽(AMPs)是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，构成了宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线。抗菌肽相比于传统抗生素有三大优势：一、抗菌肽自身具有净正电荷，使其能够优先与微生物带有负电荷的细胞膜结合，而细胞膜是生物的固有结构，因此对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用；二、由于原核和真核生物细胞膜脂质存在特异性，抗菌肽具有选择性杀菌的特性，对正常真核细胞毒性较低；三、抗菌肽的靶分子是保守的细胞膜成分，酶解、细胞外排药物等耐药机制不存在于抗菌肽的抗菌过程中，极难产生耐药性。以上优势使得抗菌肽受到广泛的重视，有望代替现有抗生素用于临床常见耐药菌株感染的治疗。

蝎毒素作为一类广泛分布的生物毒素，因其复杂的成分及性质能够产生多种药理活性，具有开发及应用潜力。前期我们从黄肥尾蝎(Androctonus australis)中进行分离及活性筛选，得到一个对大肠埃希菌生长有显著抑制作用的蝎毒素单体(其氨基酸序列为：FLSSLIPSAISGLISAFK)。对该序列结构进行分析后，我们发现其抗菌能力有进一步提高的空间。因此本发明拟对筛选出的蝎毒素单体结构进行设计和改造，以期得到活性更优的人工合成蝎毒衍生肽。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用。所述蝎毒衍生肽对正常细胞的毒性较低，具备良好的安全性；且所述蝎毒衍生肽对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等细菌具有显著的抑制作用；同时，可通过对NF-κB的调控影响下游炎症因子的表达，起到抗炎及免疫调节作用。

本发明提供了一种蝎毒衍生肽，其氨基酸序列为：FFGRLFKLAVKIIPSLFK(SEQ IDNO：1)。

上述蝎毒衍生肽是申请人自主研发的抗菌多肽，是对黄肥尾蝎中分离得到蝎毒素单体(氨基酸序列FLSSLIPSAISGLISAFK)进行结构改造，并通过分子设计及氨基酸扫描替代的方法筛选出的一种新的蝎毒衍生肽，其氨基酸序列为：FFGRLFKLAVKIIPSLFK(SEQ ID NO：1)，命名为FFG-18。该蝎毒衍生肽多肽含有18个氨基酸残基，平均分子量为2124.65g/mol，疏水系数1.03，理论等电点pH为11.73。本发明所述蝎毒衍生肽FFG-18可采用固相合成法进行合成，具有合成方便快捷，稳定可控的特点；所述蝎毒衍生肽FFG-18也可采用生物合成法进行合成。

优选的，所述蝎毒衍生肽中氨基酸均为L-氨基酸。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，可编码上述蝎毒衍生肽。

本发明还提供了一种重组载体，包含上述核酸分子。

本发明还提供了上述蝎毒衍生肽或其药学上可接受的盐在制备抗菌产品中的应用。

试验表明，本发明所述蝎毒衍生肽具备显著的抑菌效果，对多种细菌均具有良好的抑制杀灭作用，可作为抗菌药物在疾病治疗中得到应用，或者在消毒剂、清洁剂、防腐剂、包装材料中作为抗菌组分得到应用。

优选的，所述蝎毒衍生肽在药学上可接受的盐包括乙酸盐、柠檬酸盐中的至少一种。为了提高多肽药物的稳定性或溶解性，因此可将蝎毒衍生肽制为乙酸盐或柠檬酸盐的形式。

本发明还提供了一种抗菌药物，包括上述蝎毒衍生肽和/或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

优选的，所述抗菌药物所能抑制/杀灭的细菌种类包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。其中，所述抗菌药物对于大肠埃希菌的抑制/杀灭效果更为显著。

优选的，所述药学上可接受的辅料为溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。

优选的，所述抗菌药物的剂型为片剂、注射剂、喷雾剂、冻干粉针剂、胶囊或包衣药丸。

更优选的，所述抗菌药物的剂型为注射剂。由于本发明所述蝎毒衍生肽属于多肽类化合物，易被降解和较难穿越肠黏膜，口服可能会降低其药效，因而将其制备为注射剂的形式，更有助于药物成分的吸收利用。

本发明还提供了上述蝎毒衍生肽或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。

试验表明，本发明所述蝎毒衍生肽可通过对NF-κB的调控影响下游炎症因子的表达，起到良好的抗炎及免疫调节作用。

优选的，所述蝎毒衍生肽在药学上可接受的盐包括乙酸盐、柠檬酸盐中的至少一种。

本发明还提供了一种抗炎药物，包括上述蝎毒衍生肽和/或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

优选的，所述药学上可接受的辅料为溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。

优选的，所述抗炎药物的剂型为片剂、注射剂、喷雾剂、冻干粉针剂、胶囊或包衣药丸。

更优选的，所述抗炎药物的剂型为注射剂。由于本发明所述蝎毒衍生肽属于多肽类化合物，易被降解和较难穿越肠黏膜，口服可能会降低其药效，因而将其制备为注射剂的形式，更有助于药物成分的吸收利用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述蝎毒衍生肽(FFG-18)对正常细胞的毒性较低，具备良好的安全性；

(2)本发明所述蝎毒衍生肽(FFG-18)可通过物理作用直接破坏细菌细胞膜，杀菌速度较快；所述蝎毒衍生肽(FFG-18)对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等具有显著的抑制作用，且不易产生耐药性，经测试对临床分离耐药菌株也有显著抑制作用。

(3)本发明所述蝎毒衍生肽(FFG-18)可通过对NF-κB的调控影响下游炎症因子的表达，起到抗炎及免疫调节作用。

附图说明

图1表示蝎毒衍生肽FFG-18的HPLC数据图；

图2表示蝎毒衍生肽FFG-18的质谱数据图；

图3表示蝎毒衍生肽FFG-18作用于大肠埃希菌的杀菌时效曲线；

图4表示蝎毒衍生肽FFG-18的溶血毒性评价结果；

图5表示蝎毒衍生肽FFG-18的细胞毒性评价结果；

图6表示蝎毒衍生肽FFG-18作用于大肠埃希菌的透射电镜图；

图7表示蝎毒衍生肽FFG-18对细胞炎症因子的调控作用；

图8表示蝎毒衍生肽FFG-18对NF-κB的调控作用。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

多肽的合成：实验中所用多肽均由实验室自行合成纯化，合成方法为固相合成法，纯化后经HPLC检测纯度在95％以上。

所需实验材料有：

标准菌株E.coli ATCC25922(大肠埃希菌)、S.aureus ATCC12600(金黄色葡萄球菌)，P.aeruginosa ATCC25853(铜绿假单胞菌)均购自广东省微生物菌种保藏中心，大肠埃希菌临床分离菌株取自广东省珠海市人民医院，小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW 264.7)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

所需实验试剂有：

全套Fmoc保护氨基酸、固相树脂及缩合剂(HBTU，HOBt)，购自吉尔生化有限公司(中国上海)；哌啶购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)；茚三酮、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、甲苯硫醚、色谱纯乙腈、色谱纯甲醇购自阿拉丁生化科技股份有限公司(中国上海)；细菌培养基(MH培养基、LB培养基)、琼脂购自海博生物技术有限公司(中国青岛)；DMEM高糖培养基、1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，购自Gibco(美国)；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所(日本)；ELISA试剂盒(TNF-α，IL-1β，IL-8)购自欣博盛生物科技有限公司(中国深圳)。

实施例1

本实施例提供一种蝎毒衍生肽(命名为FFG-18)，其氨基酸序列为：FFGRLFKLAVKIIPSLFK(SEQ ID NO：1)，该蝎毒衍生肽多肽含有18个氨基酸残基，平均分子量为2124.65g/mol，疏水系数1.03，理论等电点pH为11.73。

该蝎毒衍生肽可应用于制备抗菌产品或抗炎药物。

实施例2：蝎毒衍生肽FFG-18的合成方法

采用标准Fmoc固相合成方法合成实施例1中蝎毒衍生肽FFG-18，具备步骤为：称取0.1mmol树脂置于反应器中，加入DCM溶胀及活化，1.5mL/5min，洗2次；DMF 1.5mL/10min，洗2次。加上25％哌啶/DMF 2mL/5min；加上25％哌啶/DMF 2mL/25min；DMF 1mL/2min，洗6次。设置树脂：氨基酸：TBTU：HOBt：DIEA＝1:3:3:3:6，加入适量DMF作为溶剂，反应3h。2％茚三酮溶液配制：称取0.3g茚三酮，用15mL无水乙醇溶解；用移液枪吸取十几颗树脂于玻璃管中，用DMF、MeOH洗树脂，加入茚三酮溶液约200μL，加热3-5min后观察树脂颜色变化，树脂不变蓝色则反应完全，挤去反应液，反应器里的树脂用DMF、MeOH各洗2次。重复以上步骤连接下一个氨基酸。反应完全的树脂用DMF、DCM：MeOH(1:1)、DCM各洗2次并晾干；冰上操作配制TFA：EDT：Tis：H₂O(v/v，100:1:2:2)；反应3h；挤入沉淀剂石油醚：甲基叔丁基醚(1:1)10mL，以5000rpm离心10min，弃去上清；加上沉淀剂石油醚：甲基叔丁基醚(1:1)5mL，以8000-9000rpm离心10min，晾干过夜。第二天，将晾干的多肽先后置于旋转蒸发仪及真空干燥箱中抽干，冷藏保存。

采用HPLC检测所制得蝎毒衍生肽FFG-18的纯度，检测结果如图1所示：经纯化后，蝎毒衍生肽FFG-18纯度＞95％。采用MALDI-TOF MS质谱仪确定所制得蝎毒衍生肽FFG-18的分子量，检测结果如图2所示。

实施例3：菌株培养条件及最小抑菌浓度测定

使用LB培养基对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌及其临床分离株在需氧条件下进行培养，使用MH培养基对金黄色葡萄球菌在需氧条件下培养，菌株的生长温度均为37℃，使用麦氏比浊法测定菌落总数。使用菌株对应培养基稀释待测化合物至指定浓度范围以配制96孔药敏板。取对数生长期细菌悬液，测定菌液浓度并稀释至1×10⁵CFU/mL，每孔中加入100μL细菌悬浮液，设置多组药物浓度，于培养箱中继续孵育，17-20小时读取结果，取没有细菌生长迹象的最低观察药物浓度为MIC值。每组测试结果独立重复4至6次。测试结果如表1所示：

表1不同多肽化合物的MIC值

从表1结果可以看出，本发明经改造后的蝎毒衍生肽FFG-18对几种测试菌株的抑菌活性相比原蝎毒素单体均有显著提高，尤其对于大肠埃希菌标准株及临床分离株的抑制效果最好，MIC达到4μg/mL。而由随机18个氨基酸组成的多肽在测试范围内对测试菌株几乎没有抑菌作用，证明本发明所提供的蝎毒衍生肽FFG-18是经合理设计和筛选得到的，具有高活性抑菌的特性。

实施例4：蝎毒衍生肽FFG-18对大肠埃希菌杀菌时效关系测定

取对数生长期细菌悬液稀释至1×10⁵CFU/mL，加入终浓度为8μg/mL的蝎毒衍生肽FFG-18，在25℃有氧条件下分别处理0，2，4，6，8，10小时，之后将菌液分别按照1:10，1:100，1:1000比例稀释，并各取20μL稀释液置于琼脂培养基平板上，在37℃有氧条件下培养24小时后，记录平板菌落数；并以2μg/mL庆大霉素作为对照药物。

从图3中可以明显看出，最小抑菌浓度下的蝎毒衍生肽FFG-18对大肠埃希菌的抑制速度远快于庆大霉素，在作用6小时后，FFG-18处理组仅观察到1×10²菌落，而庆大霉素处理组中仍有6×10⁴的菌落存活。说明FFG-18的杀菌机制与传统氨基糖苷类抗生素不同，能够起到快速抑制细菌增殖的作用。

实施例5：蝎毒衍生肽FFG-18的溶血毒性及细胞毒性评价

新鲜兔血离心得到压积红细胞(转速：10000rpm，时间：1min)，加入等体积PBS轻轻吹打重悬，离心(转速：10000rpm，时间：1min)，重复清洗一遍。清洗完毕的红细胞，用PBS轻轻重悬至浓度为5％后备用。FFG-18用PBS稀释得到100μL浓度梯度为2-125μg/mL的药物溶液；设置1％Triton X-100阳性对照孔(代表100％溶血率)和溶剂对照孔(代表0％溶血率)。每孔加入100μL 5％兔血悬液，37℃孵育1小时后，离心(转速：3000rpm，时间：15min)，取50μL上清液于新96孔板中，用酶标仪在570nm测试吸光度。

将RAW 264.7细胞(5×10⁴/孔)接种在96孔板中，孵育过夜后，加入含有2-125μg/mL FFG-18的新鲜培养基，37℃作用24小时。之后每孔加入10μL CCK-8(Dojindo，日本)，37℃继续孵育2小时。使用酶标仪(Infinite M1000 Pro，Tecan，瑞士)在450nm测定吸光度。通过比较经FFG-18处理后细胞的生长抑制率来评估细胞毒性。未经FFG-18处理的对照组细胞的抑制率设定为0％。

从图4-5中可以看出，FFG-18的溶血毒性和细胞毒性均较低，100μg/mL浓度下的溶血率仅有28％；同时对RAW 264.7细胞的IC₅₀＝68.66μg/mL，远高于其抑菌浓度。因此可以认为FFG-18在正常剂量使用范围内安全指数较高。

实施例6：蝎毒衍生肽FFG-18作用于大肠埃希菌的透射电镜图

调整菌液浓度为1×10⁶CFU/mL，用8μg/mL FFG-18处理2小时。离心(1000rpm，5min)弃掉上清液，PBS缓冲液洗涤两次，之后用2.5％戊二醛处理过夜。用0.1M磷酸盐冲洗至少三次，每次15分钟，用1％四氧化锇固定2-3小时。脱水条件：50％乙醇15-20分钟，70％乙醇15-20分钟，90％乙醇15-20分钟，90％乙醇和90％丙酮15-20分钟(1:1，v/v)。孵育条件：丙酮和包埋液(2:1，v/v)室温下孵育3-4小时，丙酮和包埋液(1:2，v/v)37℃孵育2-3小时。固化条件：37℃过夜，45℃孵育12小时，60℃孵育24小时。固化后切片，用3％醋酸双氧铀和柠檬酸铅作为染料，用透射电子显微镜观察样品并拍照记录结果。

从图6透射电镜结果显示，大肠埃希菌经8μg/mL FFG-18作用后，相比于空白对照组，细胞膜受损，边缘溶解，细胞质缺失，内边缘与细胞膜出现明显间隙，细胞内部形成清晰的空泡结构。此结果印证FFG-18杀菌作用可通过物理性的细胞膜破坏效应导致靶细胞破裂死亡。

实施例7：蝎毒衍生肽FFG-18抗炎作用效果评价实验

酶联免疫吸附实验：将RAW 264.7细胞(5×10⁴/孔)接种在96孔板中并生长过夜，分别加入终浓度为2，8，32μg/mL FFG-18的新鲜培养基，2小时后每孔中加入终浓度为100ng/mL的LPS。在37℃，5％CO₂环境下孵育6小时，收集细胞培养液，根据ELISA试剂说明书(Neobioscience，中国)测定细胞外液中TNF-α，IL-1β和IL-8水平，1μg/mL Melittin(蜂毒肽)作为阳性对照。

荧光素酶报告基因检测：将稳定转染NF-κB的RAW 264.7细胞以5×10⁴/孔接种在96孔板中，待细胞生长过夜后，分别加入含有2，8，32μg/mL FFG-18。2小时后，将终浓度为100ng/mL的LPS或1×10⁷CFU/mL的热灭活大肠埃希菌加入各孔中，37℃孵育6小时。接着弃掉上清液，每孔加入100μL裂解液，避光孵育20分钟后，将细胞裂解液转移到白色不透明板上，各孔加入100μL化学发光底物，通过酶标仪(Infinite M1000 Pro，Tecan，Swiss)检测化学发光，10μg/mL PDTC(NF-κB抑制剂的一种)作为阳性对照。

采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7促炎细胞因子的产生以建立细胞炎症模型。根据图7的ELISA结果可以看出，将FFG-18的浓度设定为2，8，32μg/mL时，8μg/mL FFG-18即可抑制细胞炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-8的表达，展示出较为显著的抗炎作用。

考虑到核转录因子因子κB(NF-κB)在炎症发展以及多种下游炎症因子的信号转导中起到重要作用，我们测试了FFG-18对RAW 264.7炎症模型细胞中NF-κB的抑制作用。先用FFG-18预处理编码NF-κB和荧光素酶报告基因稳转质粒的RAW 264.7细胞，2小时后，分别用LPS和热灭活的大肠埃希菌诱导细胞6小时，最后通过比较加药组与对照组萤光素酶的活性来评估FFG-18对NF-κB的抑制作用。图8中结果显示，稳转细胞经LPS或灭活细菌诱导炎症反应后，8μg/mL的FFG-18可显著抑制NF-κB的表达。

实施例8

本实施例提供一种含实施例1中蝎毒衍生肽FFG-18的药物，其剂型为注射剂，包括质量浓度为10mg/mL的蝎毒衍生肽FFG-18以及作为溶剂的0.9％氯化钠溶液，该药物具有抗菌和抗炎功效。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海市人民医院

<120> 一种蝎毒衍生肽及其在制备抗菌或抗炎药物中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Phe Gly Arg Leu Phe Lys Leu Ala Val Lys Ile Ile Pro Ser Leu

1 5 10 15

Phe Lys

Claims (9)

1.一种蝎毒衍生肽，其特征在于，所述蝎毒衍生肽的氨基酸序列为：FFGRLFKLAVKIIPSLFK。

2.根据权利要求1所述的蝎毒衍生肽，其特征在于，所述蝎毒衍生肽中氨基酸均为L-氨基酸。

3.一种分离的核酸分子，其特征在于，可编码权利要求1或2所述的蝎毒衍生肽。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核酸分子。

5.权利要求1或2中所述蝎毒衍生肽或其药学上可接受的盐在制备抗菌产品中的应用，其特征在于，所述菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蝎毒衍生肽在药学上可接受的盐包括乙酸盐、柠檬酸盐中的至少一种。

7.一种抗菌药物，其特征在于，包括权利要求1或2中所述蝎毒衍生肽或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料；

所述抗菌药物所能抑制的细菌种类为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌。

8.权利要求1或2中所述蝎毒衍生肽或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。

9.一种抗炎药物，其特征在于，包括权利要求1或2中所述蝎毒衍生肽或其在药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

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