CN111521805B - 一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法。所述检测试剂包括样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫。该产品操作简便，检测时间短，灵敏度高，非常适合基层医疗机构及疫情集中爆发区的大范围初筛。

Description

一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂及其制备方法，更特别地涉及一种2019新型冠状病毒抗原通过免疫荧光进行检测的试剂及其制备方法。

背景技术

面对新冠综合症(COVID-19)大规模流行，大量人群需要被筛查、确诊并做相应的处理，临床对诊断试剂的需求极为迫切。

CN105624335B公开了一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒，其主要包括RT-PCR反应液、引物探针混合液、RT-PCR反应酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

CN111020064A公开了一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括引物对集和探针组；其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述内标引物对包括：/n如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；/n所述探针组包括：/n核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。

CN111088407A公开了一种检测冠状病毒RNA的试剂盒，其包括：核酸酶Cas13a，用于特异性检测SARS-CoV-1基因序列及SARS-CoV-2基因序列的Cas13a指导RNA，RNA荧光探针，反向转录酶，DNA聚合酶，T7RNA聚合酶，以及缓冲液。

CN110982944A公开了用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，所述LAMP引物包括如SEQ ID NO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQ ID NO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。

CN1177224C公开了一种检测SARS冠状病毒抗体的的方法及其试剂盒。具体检测步骤如下：(1)利用纯化的全病毒裂解液包被一种固相支持物；(2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育；(3)适度清洗去除任何未结合的SARS冠状病毒抗体；(4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育；(5)适度清洗去除任何未结合的第二抗体；(6)定量检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。

CN100425991C公开了一种用于检测SARS抗体的免疫微球，及其制备方法和用途，该免疫微球是以表面有羧基修饰的聚苯乙烯微球为内核，其表面的羧基通过多聚赖氨酸化学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S，N，M或E蛋白。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗SARS抗体。

CN105624335B公开了一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术同时检测中东呼吸综合征冠状病毒UPE和N基因，该试剂盒主要包括RTPCR反应液、引物探针混合液、RTPCR反应酶系、DEPC H₂O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

CN111020064A公开了一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括引物对集和探针组；其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述内标引物对包括：如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；所述探针组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。

CN1453589A公开了一种胶体金层析法检测SARS冠状病毒抗体的试剂，由包被膜、吸水纸、涂覆金标抗体的玻璃纤维膜依次粘贴构成。

“6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂检测性能比较与分析”，郭元元等，重庆医学，2020年2月，对不同的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂的检测性能进行比较和分析，以供实验室参考。方法收集该院1例弱阳性患者不同时间点采集的咽拭子标本，选取6种国产试剂(A-F试剂)平行检测，进行RNA提取和扩增，根据各试剂检测结果比较其性能。

从上述现有技术可以看出，目前对于新冠病毒的检测筛查方法主要为PCR核酸检测及抗体检测。核酸检测过程60-120分钟不等，且需要专业人员在PCR专业实验室中进行操作。而抗体检测不能单独作为诊断指标用于筛查，只能作为当核酸检测为阴性时的辅助诊断方法。在FDA的SARS-COV-2检测指导中明确指出，抗体检测不能单独用于新冠病毒诊断，不能排除感染或说明感染状态。因此，本领域需要一种同时具备采样速度快速、过程操作简便、特异性强且灵敏度稳定等优点的检测试剂及其制备方法。基于此，本申请人开发了一种2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂。

发明内容

为了同时解决现有技术中的上述问题，本发明人经过深入研究与合作开发，提供了一种2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂(即试剂条或试剂盒)。本发明的2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂利用双抗体夹心原理及高灵敏度的时间分辨荧光微球示踪物。实现对疑似新型冠状病毒感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、或痰液中的新冠病毒核壳蛋白(nucleocapsid protein，或称N蛋白)的快速定性检测。

具体地，本发明提供了一种2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂及其制备方法。本发明的2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂利用双抗体夹心原理，示踪物为时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere,TRFM)。其具有荧光强度高寿命长、共价结合稳定等特点，结合特定光源设备即可实现目测判读，较同样可目测判读的胶体金方法灵敏度高1-3个数量级，更适用于对敏感度要求高的新型冠状病毒检测。该检测试剂主要应用于疑似新型冠状病毒感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、或痰液中的新冠病毒核壳蛋白的快速定性检测。该产品操作简便，检测时间短，灵敏度高，非常适合基层医疗机构及疫情集中爆发区的大范围初筛。

该检测试剂主要由样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫组成。NC包被有T线鼠抗人单克隆抗体1和C线抗鼠抗人单克隆抗体。结合垫包被有鼠抗人抗体2-时间分辨微球偶联结合物。当待检样本中含有抗原N蛋白时，抗原N蛋白首先与结合垫位置包被的标记有时间分辨微球的鼠抗人单克隆抗体2结合，形成N蛋白-鼠抗人单克隆抗体2结合物，后与T线位置包被的鼠抗人单克隆抗体1捕获结合，剩余标记有时间分辨微球的鼠抗人单克隆抗体2继续层析，与C线位置的抗鼠抗人抗体结合。利用365nm波长紫外光照射，T线位置显示时间分辨微球特有的红色荧光型号，即为阳性，C线位置始终显色。

更具体地，本发明提供了一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂(即试剂条或试剂盒)，其包括或包含：样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫。

优选地，所述NC包被有T线鼠抗人单克隆抗体1和C线抗鼠抗人单克隆抗体。

优选地，所述结合垫包被有鼠抗人抗体2-时间分辨微球偶联结合物。

优选地，所述结合垫为玻璃纤维膜。

优选地，所述玻璃纤维膜为经过预处理的玻璃纤维膜，其预处理方法包括：将玻璃纤维膜浸润于预处理液中30min，取出后室温晾干，即得经过预处理的玻璃纤维膜。

更优选地，所述玻璃纤维预处理液包含50mM硼酸盐缓冲液+2-10％蔗糖+0.1-0.5％TW20+0.1-5％BSA。

在本发明的另一方面，提供了制备上述检测试剂的方法，该方法包括以下步骤：(1)玻璃纤维预处理；(2)时间分辨微球标记；(3)硝酸纤维素膜的包被；(4)微球的喷涂；和(5)试纸条组装。

优选地，所述微球的喷涂使用喷膜仪进行。

优选地，在试纸条组装时，将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴于PS底板上。

优选地，所述步骤(2)包括以下步骤2.1至2.6：2.1分别配制新鲜的EDC和Sulfo-NHS水溶液，浓度均为5-20mg/mL(优选地，由于EDC和Sulfo-NHS是低温保存且试剂易受潮，因此在溶液配制前将其室温放置30min，再称量相应重量使用)；2.2取50-200uL时间分辨微球溶于600-1000ul标记缓冲液中，加入上述配制的EDC溶液5-10uL，混匀；再加入10-20uL的Sulfo-NHS溶液，混匀；对微球进行活化；将该反应溶液放置在摇床上，室温下反应10-60min；2.3将活化后的微球用标记缓冲液离心清洗三次，并超声溶解于1ml标记缓冲液中；2.4向超声溶解后的微球中加入0.05-0.5mg鼠抗人单克隆抗体2，放置在摇床上，室温下反应1-3小时；2.5向反应后的微球-抗体溶液中加入50-200ul微球封闭液进行封闭，放置在摇床上，室温下继反应0.5-2小时；和2.6使用微球储存液将封闭后的微球-抗体溶液离心清洗三次，充分超声溶解于1-5ml微球储存液中，4℃放置备用。

优选地，所述步骤(3)硝酸纤维素膜的包被包括：使用抗体包被液分别将鼠抗人单克隆抗体1、抗鼠抗人抗体稀释至0.1-0.5mg/ml浓度，使用biodot喷膜仪，包被于NC膜上，过夜干燥，备用。

优选地，所述步骤(4)微球的喷涂包括：使用biodot喷膜仪将微球以3-8ul/cm使用量喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，室温干燥4小时，裁切后备用。

优选地，所述步骤(5)试纸条组装包括：将各组分依次粘贴于PS底板上，用数控高速斩切机切成例如4mm宽的测试条，干燥避光保存。

更优选地，将试纸条个组成部分用切割机切割成以下大小：吸收垫：18mm×300mm；NC膜：25mm×300mm；结合垫：8mm×300mm；样品垫：18mm×300mm。

优选地，制备过程中使用的溶液如下或通过如下方法配制：

(1)微球标记缓冲液：50mM MES，pH 6.0

(2)微球封闭液：50mM乙醇胺溶液+0.1-5％BSA

(3)微球储存液：50mM PBS+0.05-0.5％BSA+0.01-0.1％Tween20+0.02％叠氮钠

(4)NHS为10mg/ml

(5)EDC为10mg/ml

(6)玻璃纤维预处理液：50Mm硼酸盐缓冲液+2-10％蔗糖+0.1-0.5％TW20+0.1-5％BSA

(7)抗体包被液：10mM PBS缓冲液+1-5％蔗糖

在本发明的又一方面，提供了使用上述检测试剂的方法，该方法包括在检测时利用365nm波长紫外光照射，T线位置显示时间分辨微球特有的红色荧光型号，即为阳性，C线位置始终显色。

更具体而言，当待检样本中含有抗原N蛋白时，抗原N蛋白首先与结合垫位置包被的标记有时间分辨微球的鼠抗人单克隆抗体2结合，形成N蛋白-鼠抗人单克隆抗体2结合物，后与T线位置包被的鼠抗人单克隆抗体1捕获结合，剩余标记有时间分辨微球的鼠抗人单克隆抗体2继续层析，与C线位置的抗鼠抗人抗体结合。

优选地，所述硝酸纤维素膜通过如下方法制得：(1)将硝酸纤维素(即NC聚合物)溶于甲基丙烯酸甲酯和异丙醇溶剂中，当硝酸纤维素完全溶解后，加入季戊四醇和和水，搅拌均匀，得到铸膜所用的溶液；(2)使用铸膜机进行铸膜，然后烘干；(3)取下得到的膜，并裁成所需尺寸的膜条，然后将膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧，在绝热室中将膜加热到40-70℃，达到预定温度后将膜拉伸8-15％，然后保持10-30分钟，再降温至室温；(4)通过静电纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层。

优选地，在步骤(1)中，在铸膜所用的溶液中，含有60-85wt％甲基丙烯酸甲酯，5-10wt％异丙醇，1-3wt％季戊四醇和1-2wt％的水。在所述溶剂中，季戊四醇和水用作为成孔剂。

优选地，拉伸速度为为0.02-0.08mm/s。

优选地，所述拉伸为横向拉伸或纵向拉伸或其组合。更优选地，所述拉伸为单轴拉伸。

优选地，所述降温速度为0.05-0.2℃/min。

优选地，所述纳米纤维层的厚度为200nm-800nm。

更优优选地，所述膜的表面施加有聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层的部分占整个膜表面的0.2-10.0％(以面积比例计)，优选1.0-8.0％。

聚乳酸和聚己内酯的重量比优选为1:2-1:5。

优选地，所述铸膜过程使用自动铸膜机。可以对每膜的孔隙率、孔径和厚度进行表征，以确保所生产膜的质量和形态一致。

裁切的膜片尺寸可以根据实际需要进行选择，例如300mm×60mm或25mm×300mm等。

可以使用对流烘箱将膜在绝热室中加热到合适的拉伸温度，对流烘箱能够实现膜的均匀加热。加热温度非常关键，过低的加热温度，会导致拉伸时膜的破裂，而如果加热温度偏高，特别是当接近接近膜收缩点时，会导致膜发生不均匀收缩转变。

更优选地和具体地，可以通过如下方法制备硝酸纤维膜：(1)将NC聚合物(上海未熹生物科技有限公司)溶于甲基丙烯酸甲酯和异丙醇溶剂中，当硝酸纤维素完全溶解后，加入季戊四醇和和水，搅拌均匀，得到铸膜所用的溶液；(2)使用铸膜机(JK-TMJ-200A，深圳市晶科诺尔公司)进行铸膜，然后烘干；(3)取下得到的膜，并裁成25mm×300mm的膜条，然后将膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧，在绝热室中将膜加热到50℃，达到预定温度后将膜单轴拉伸11％，拉伸速度为为0.03mm/s，然后保持20分钟，再降温至室温，降温速度为0.1℃/min。；(4)通过静电纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层，静电纺丝设备(北京新锐佰纳科技有限公司)的工艺条件为：电池8kV，针与硝酸纤维膜的距离即接收距离为12cm进行静电纺丝，同时保持进料速度恒定在6ml/h，纺丝时间为180s。述纳米纤维层的平均厚度为312nm，所述膜的表面施加有聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层的部分占整个膜表面的8％(以面积比例计)。

膜的表面和内层的结构和力学行为对于开发侧向流动膜作为试剂条的处理材料非常重要。通过所述拉伸例如单轴拉伸操作来改变膜的形态能够非常有效地改善膜性能。由于拉伸作用，膜样品的孔结构和孔隙率发生明显变化。对于侧向流动中的膜性能，增加膜拉伸伸长率可加快侧向芯吸时间。合适的拉伸速率，可以提高蛋白质如N蛋白结合力，同时减少横向迁移时间以进行快速检测。

测试发现，通过本发明的所述拉伸操作，NC膜的侧向芯吸吸收的时间增加了20-30％，液体在侧向流动膜中迁移增加10-30％。此外，膜的蛋白结合能力提高18-32％，从而使得可以在快速诊断试剂盒的生产中保持高的膜蛋白结合力。

研究还发现，通过在NC膜上通过静电纺丝施涂疏水聚己内酯和聚乳酸来控制流体流动，进而可以改善生物分子之间的相互作用并提高检测灵敏度。电纺丝涂层可以在NC膜中实现长的流动延迟(例如5-20s)。这种延迟的流动增加了N蛋白与偶联物之间的相互作用速率，从而提高了检测灵敏度。与未涂层的NC膜相比，静电纺丝施涂的NC膜的灵敏度与未经涂覆的NC膜相比，灵敏度可以提高2-4倍。此外，本发明的精度纺丝层不明显影响流体流动。

本领域技术人员能够意识到，使用该方法制得的经拉伸和静电纺丝涂覆的硝酸纤维素膜并不是必须的或必要的。换言之，使用市售硝酸纤维素膜即可实现本发明的目的。只是当使用根据上述方法制得的硝酸纤维素膜时，能够使本发明的试纸条具有更进一步提高的侧向芯吸吸收、蛋白结合能力和灵敏度，即能够获得进一步提高益处。

本发明的免疫荧光层析法利用抗原与抗体之间特异性结合的特点，使待测物与标记有其特异性抗体的时间分辨微球结合，通过层析反应与包被在硝酸纤维素膜检测线位置的的特异性抗体结合，通过配套光源，对检测线荧光强度进行目测观察定性检测样本中待测物的方法。检测过程操作简单，不依赖于设备判读，较同样目测判读的胶体金产品拥有更高的灵敏度，15-20分钟即可获得结果，非常适合基层医疗机构及疫情集中爆发区的大范围初筛。

本发明的2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂，较现有新冠病毒检测试剂具有以下优点：(1)采样快速，且无需对样本进行过多处理；(2)检测过程操作简便，无需特定的环境及技术人员，实现15-20分钟快速获得检测结果，结合配套的光源即可实现快速的目测判读，较同样目测判读的胶体金产品拥有更高的灵敏度，可很好的应用于大范围快速初筛；(3)更高的产品特异性：采用高亲和力特异性单克隆抗体标记时间分辨微球，识别结合靶点抗原的不同表位，降低非特异***叉反应的几率，同时避免了血液样本中内源性及外源性干扰物质引起非特异性结合，很大程度上提高了产品的特异性。3.灵敏度稳定：本发明方法的抗原检测试剂检测目标物为新冠病毒壳蛋白，灵敏度可达50ng/ml，该蛋白经过简单的病毒裂解操作获得，受前处理操作影响极小，且结构及存在状态稳定，故该检测试剂具有稳定的检测灵敏度；(4)抗原检测可作为出院病例核酸检测及抗体检测的再次确诊方法，避免假阴性患者出院造成新的传播风险。

进一步研究表明，本发明的检测试剂具有荧光强度高寿命长、共价结合稳定等特点，结合特定光源设备即可实现目测判读，较同样可目测判读的胶体金方法灵敏度显著提高，更适用于对敏感度要求高的新型冠状病毒检测。并且新的纤维素的使用，能够更进一步提高其性能。

附图说明

图1是根据本发明的测试条的示意图，其中1是样品垫，2是结合垫，3是NC膜，4是吸收垫，5是T线，6是C线。

具体实施方案

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

试剂条的制备：

1.溶液配制：

(1)微球标记缓冲液：50mM MES，pH 6.0

(2)微球封闭液：50mM乙醇胺溶液+0.1-5％BSA

(3)微球储存液：50mM PBS+0.05-0.5％BSA+0.01-0.1％Tween20+0.02％叠氮钠

(4)10mg/ml NHS

(5)10mg/ml EDC

(6)玻璃纤维预处理液：50Mm硼酸盐缓冲液+2-10％蔗糖+0.1-0.5％TW20+0.1-5％BSA

(7)抗体包被液：10mM PBS缓冲液+1-5％蔗糖

2.玻璃纤维预处理

将玻璃纤维膜浸润于预处理液中30min,取出后室温晾干，备用。

3.时间分辨微球标记

3.1分别配制新鲜的EDC和Sulfo-NHS水溶液，浓度均为10mg/mL。EDC和Sulfo-NHS是低温保存且试剂易受潮，因此在溶液配制前将其室温放置30min，再称量相应重量使用。

3.2取100uL时间分辨微球溶于900ul标记缓冲液中，加入上述配制的EDC溶液5-10uL，混匀；再加入10-20uL的Sulfo-NHS溶液，混匀。对微球进行活化。将该反应溶液放置在摇床上，室温下反应30min。

3.3将活化后的微球用标记缓冲液离心清洗三次，并超声溶解于1ml标记缓冲液中。

3.4向超声溶解后的微球中加入0.05-0.5mg鼠抗人单克隆抗体2,放置在摇床上，室温下反应2小时。

3.5向反应后的微球-抗体溶液中加入100ul微球封闭液进行封闭，放置在摇床上，室温下继反应1小时。

3.6使用微球储存液将封闭后的微球-抗体溶液离心清洗三次，充分超声溶解于1ml微球储存液中，4℃放置备用。

4.硝酸纤维素膜的包被

使用抗体包被液分别将鼠抗人单克隆抗体1、抗鼠抗人抗体稀释至0.1-0.5mg/ml浓度，使用biodot喷膜仪，包被于NC膜(默克Millipore HF13502S25)上，过夜干燥，备用。

5.微球的喷涂

使用biodot喷膜仪将微球以3-8ul/cm使用量喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，室温干燥4小时，裁切后备用。

6.试纸条组装

将各组分用切割机切割成以下大小：

吸收垫：18mm×300mm

NC膜：25mm×300mm

结合垫：8mm×300mm

样品垫：18mm×300mm

将各组分依次粘贴于PS底板上，用数控高速斩切机切成4mm宽的测试条，干燥避光保存。

使用该实施例制得的试纸条进行新冠病毒核壳蛋白的快速定性检测，无需对样本进行过多处理，检测过程操作简便，无需特定的环境及技术人员，实现约18分钟即可获得检测结果，结合配套的光源(365nm波长紫外光)即可实现快速的目测判读，较同样目测判读的胶体金产品拥有更高的灵敏度，其中较同样可目测判读的胶体金方法灵敏度高约2个数量级，并且经测试灵敏度可达50ng/ml，能够应用于大范围快速初筛。

实施例2

重复实施例1，区别仅在于NC膜为根据本发明前述具体方法制得的NC膜。

经检测，与实施例1相比，在检测SARS-CoV-2时，本实施例的NC膜的侧向芯吸吸收的时间增加了约22％，膜对N蛋白结合能力提高约20％，灵敏度可以提高约2.4倍。这清楚地表明本发明的检测试剂具有更加优越的性能。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (7)

1.一种制备2019新型冠状病毒抗原检测试剂的方法，所述检测试剂包括：样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫；所述方法包括以下步骤：(1)玻璃纤维膜预处理；(2)时间分辨微球标记；(3)硝酸纤维素膜的包被；(4)微球的喷涂；和(5)试纸条组装；

所述硝酸纤维膜通过以下方法制得：

(1)将NC聚合物溶于甲基丙烯酸甲酯和异丙醇溶剂中，当硝酸纤维素完全溶解后，加入季戊四醇和水，搅拌均匀，得到铸膜所用的溶液；其中，在铸膜所用的溶液中，含有60-85wt％甲基丙烯酸甲酯，5-10wt％异丙醇，1-3wt％季戊四醇和1-2wt％的水；

(2)使用铸膜机进行铸膜，然后烘干；

(3)取下得到的膜，并裁成25mm×300mm的膜条，然后将膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧，在绝热室中将膜加热到50℃，达到预定温度后将膜单轴拉伸11％，拉伸速度为0.03mm/s，然后保持20分钟，再降温至室温，降温速度为0.1℃/min；

(4)通过静电纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层，静电纺丝设备的工艺条件为：电池8kV，针与硝酸纤维膜的距离即接收距离为12cm进行静电纺丝，同时保持进料速度恒定在6ml/h，纺丝时间为180s，所述纳米纤维层的平均厚度为312nm，所述膜的表面施加有聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层的部分以面积比例计占整个膜表面的8％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NC膜包被有T线鼠抗人单克隆抗体1和C线抗鼠抗人单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中结合垫包被有鼠抗人抗体2-时间分辨微球偶联结合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述玻璃纤维膜为经过预处理的玻璃纤维膜，其预处理方法包括：将玻璃纤维膜浸润于预处理液中30min，取出后室温晾干，即得经过预处理的玻璃纤维膜。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述玻璃纤维膜预处理液包含50mM硼酸盐缓冲液+2-10％蔗糖+0.1-0.5％TW20+0.1-5％BSA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中微球的喷涂使用喷膜仪进行。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴于PS底板上。

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