CN108918894A - 一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜及其应用,该检测膜通过静电纺丝技术将聚合物膜一体化集成在支撑基底上,包括设在支撑基底上依次相连的样品区域、过滤区域、胶体金区域、检测区域和吸水区域。在检测区域上设有多条检测条带和一条质控线:在胶体金区域含有胶体金抗体偶联物,胶体金抗体为显色抗体,所述检测条带由多条固载有不同捕捉抗体的线段构成,显色抗体与捕捉抗体为可以形成双抗体夹心配对的抗体,本发明的胶体金层析膜通过对人体液中多种肿瘤标志物的检测,实现对肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、子宫癌、卵巢癌的检测。本发明的检测膜对多种癌症检测特异性高、灵敏度高、具有良好的稳定性和重复性。
Description
技术领域
本发明涉及诊断检测膜技术领域,具体为一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜及其应用。
背景技术
肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中,由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质,包括蛋白质、激素、酶、胞泌体及癌基因产物等。这些物质有的不存在于正常人体内只见于胚胎中,有的在肿瘤病人体内含量超过正常人体内含量。临床上肿瘤标志物的检测一般采用酶联免疫吸附法分析(ELISA),由于ELISA需要多次孵育,检测时间较长,不适宜快速检测。胶体金免疫层析技术具有简单、快速、灵敏、可现场操作等优点,满足了应对癌症普查筛选和个人癌症预后监测等快速检测的需要。
甲胎蛋白(AFP)及癌胚抗原(CEA)作为长期大量使用的肿瘤标志物,其临床反应结果准确可靠,但是它们不仅存在于恶性肿瘤中,也存在于良性肿瘤和胚胎组织中。为提高对肿瘤辅助诊断的准确性,结合甲胎蛋白(AFP)及癌胚抗原(CEA)的定量、动态、联合检查具有显著的实用价值,可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移等,适用于肿瘤普查、诊断、预后和转归、以及评价治疗疗效和高危人群随访观察等方面。癌胚抗原(CEA)在胚胎期合成于小肠、肝脏和胰腺。成人血清含量极低(2.5 ng/mL以下)。主要用于对结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及甲状腺髓质癌等患者的临床辅助诊断。其中结肠直肠癌CEA的敏感性高于其他肿瘤标志物,CEA对肺腺癌较为敏感并且其阳性率随病程发展而增高,CEA对鼻咽腺癌也较为敏感。定量检测CEA可显著提高诊断结直肠癌的敏感性和准确性,也可用于结、直肠癌术后疗效评价、病情分期和复发监测。血清CEA水平变化与结肠癌Duke分期密切相关。结直肠癌病人常常发生肝转移,而其间CEA升高更为明显。临床上常用的肿瘤标志物还包括CA125(癌抗原125),这是一种卵巢癌特异性标志物。临床上常通过检测血液中CA125 的含量作为卵巢癌早期诊断的判据。由于其它种类的肿瘤例如子宫内膜癌、腹膜癌和输卵管癌也能引起血液中CA125水平的升高,因此常需要测定多种标志物的含量对不同的癌症类型进行确认。临床上通过测定CA-125和癌抗原CA72-4的含量来进一步确认卵巢癌。此外,常用的肿瘤标志物如血清中的CA72-4是临床上判断胃癌的首选标志物,而癌抗原CA19-9是胰腺癌的首选标志物。
我国的肝癌死亡人数约占全世界的40%。医疗工作者已经达成共识:提高生存率的最佳途径就是早诊断、早发现、早治疗,其中最关键的是早期诊断。肝癌通常进展缓慢,在早期阶段无症状。目前,结合血清甲胎蛋白(AFP)检测和肝脏的超声检查是监测和筛查肝癌的标准方法。正常成人血清AFP的含量约为10 ng/mL,而肝癌患者的血清AFP值可高达500 ng/mL。由于相当部分良性肝病患者中甲胎蛋白也容易升高,因此,检测甲胎蛋白(AFP)不仅具有早期诊断原发性肝癌的价值,而且有助于肝炎、肝硬化癌变的预警。对甲胎蛋白含量异常的肝病患者密切随访,可早期诊治以提高患者的生存率。然而,仅用AFP作为标志物,其检测的敏感性和特异性有限。而肝脏的超声检测则对操作者依赖较高,且当肿瘤直径小于2 cm时假阴性率较高。可以通过同时检测血清中AFP和CEA的含量提高早期诊断的准确性。类似地,胰腺癌治疗高度依赖于早期诊断的准确性。为此,检测其首选肿瘤标志物CA19-9 的含量及其次选标志物CA125的含量可以提供胰腺癌的有效判据,胃癌可通过首选肿瘤标志物CA72-4和次选标志物CEA进行有效的早期诊断。此外对妇女健康威胁极大的子宫癌也可以通过综合检测肿瘤标志物CA125 和CA19-9的含量给出有效判据。卵巢癌则通过检测CA125和CA72-4。
现有技术公开了一种可同时检测甲胎蛋白(AFP)及癌胚抗原(CEA)的双肿瘤标志物金标检测试纸(参见CN 201196651 Y,公开日2009年2月18日)。该试纸为多层结构,载体为聚氯乙烯(PVC)片基,上部铺设硝酸纤维素膜,质控线、甲胎蛋白检测线和癌胚抗原检测线分别设置在硝酸纤维膜中,膜的一端层压有胶体金结合物垫和样品垫,另一端设有吸收垫。现有技术公开了一种快速无损伤性检测肝肿瘤标志物的方法以及采用的试纸条(参见CN 102854324 A,公开日2013年1月2日),用于检测唾液样本中的高尔基体蛋白73和甲胎蛋白(AFP)。该试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、以及用于吸收检测样品中多余液体的吸水垫,样品垫上粘附标有指示线的胶带。现有技术还公开了一种肿瘤标志物胶体金免疫层析定量检测试纸条及制备方法(参见CN 101900733 A,公开日2010年12月1日),包括样品垫、金标抗体结合物膜、硝酸纤维膜、吸水垫、反应支持物。所述的硝酸纤维膜以靠近样品垫一端为起始端,靠近吸水垫一端为末端,依次包被5条抗体条带,分别为包被鼠抗人肿瘤标志物单克隆抗体Ⅰ的T1、T2、T3、T4检测条带和包被羊抗鼠IgG的质控条带。
现有技术的检测线布设于硝酸纤维素膜中,抗体与硝酸纤维素膜的非特异性结合形成检测线(抗体蛋白的上载量通常为10-110 µg/cm2)。有必要提供其他材质的聚合物膜,提高的抗体上载率和增强膜的机械性能。现有技术的支撑基材为PVC塑料等疏水性底板,由于疏水基底与亲水膜界面的张力,不利水溶液样品的渗透扩散形成均匀的层析线。因此,有必要使用亲水性的支撑基材,获得均匀层析效果。
现有技术公开的肿瘤标志物试纸为多层结构。这种多层结构存在着层间接触程度不一致对检测稳定性的影响。各个片层之间接触的良好与否,对检测样在试纸中的扩散起着重要影响,决定了样品中抗原、胶体金的扩散效率,反映在显色反应效率的变动,影响定量检测数据的准确性。如果在层间附着气泡,会引起显色条带紊乱。为此,有必要提供一种一体化的检测膜,减少层间接触引起的检测误差。
现有技术的胶体金层析分析膜上一般是通过在检测液扩散方向上依次喷涂一种或多种单克隆抗体条带,用于与单种金标抗体的进行显色反应,并从各个条带的显色反应程度判断肿瘤标志物的特异性检出。由于依次喷涂多条抗体条带意味着抗体条带与随检测液扩散而来的金标抗体的接触存在时间差,使得扩散中检测液中水分的挥发,检测液中肿瘤标志物(即目标抗原)的浓度会依次发生细微变化。因此,有必要尽可能地将抗体检测条带进行平行布置。
由于使用体液样品,包括血清、唾液、尿等,其中除了抗原蛋白质外还有其他成分,例如血液细胞,唾液中的上皮细胞残体、尿液中的胞泌体等。这些成分易于与胶体金抗体偶联物结合,干扰对抗原的检测,必须去除。因此,有必要在层析检测膜上增设过滤区域。
现有技术公开的胶体金与抗体偶联物(亦即金标抗体)通过直径20-80 nm的胶体金与抗体溶液混合制备,抗体经过蛋白质与金纳米颗粒表面的非特异性吸附固载于胶体金表面。这种非特异性吸附通过电荷作用、疏水作用、范德华力、氢键结合等方式,形成的胶体金-抗体偶联物能可逆分离,因而存在着稳定性不足的问题,不利于长期稳定地保持与抗原特异性结合的能力。为此,有必要通过共价连接提高抗体在胶体金表面的固载稳定性。
现有技术尚缺乏在检测膜上同时提供多种胶体金与不同抗体的偶联物(即,多元金标抗体)。由于不同类癌症常常引起相同肿瘤标志物含量升高的现象,这会引起肿瘤标志物在指示癌症种类的误判和错诊。将多元金标抗体与其相对应的单克隆抗体条带的配合使用可以通过特异性的显色反应反映出多种癌症标志物的含量,综合检测两种或两种以上特定种类的肿瘤标志物含量,可以显著增强肿瘤诊断的准确性。其次,不同的肿瘤类别具有性别依耐性,也具有年龄、行业、地域(包括生活习惯、饮食习惯)的趋向性。例如,卵巢癌、子宫癌只发生于女性,而***癌、胰腺癌多发于男性,鼻咽腺癌多发于长期食用腌制食品的人群等。因此,很有必要提供一种多元肿瘤标志物的检测膜以提高癌症早期诊断的针对性和准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜及其应用,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜,包括设在支撑基底上依次相连的样品区域、过滤区域、胶体金区域、检测区域和吸水区域,所述检测区域上设有第一检测条带、第二检测条带和一条质控线;所述胶体金区域上设有层析膜,所述层析膜的支撑基底为金属材料或镀有金属镀层的片基,所述金属材料采用不锈钢箔、铜箔或铝箔,所述金属材料的厚度为0.2-3mm;所述金属镀层厚度为0.01-100 µm;镀有金属镀层的片基总厚度为0.2-3mm;
所述样品区域、过滤区域、胶体金区域、检测区域和吸水区域的宽度相同,均为0.5-1.5cm,优选0.7 cm;所述样品区域高度为0.5-1.5 cm,优选0.7 cm;所述过滤区域高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述胶体金区域高度为0.3-1.5 cm,优选0.5 cm;所述检测区域上第一检测条带与胶体金区域边缘之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述第一检测条带与第二检测条带之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm,所述第二检测条带与质控线之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述质控线与吸水区域边缘之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3cm,所述检测区域高度为0.8-3.2cm,所述吸水区域高度为0.5-1.5 cm,优选0.8 cm。
优选的,所述胶体金区域内含有胶体金-抗体偶联物作为金标抗体,所述金标抗体为胶体金与抗体的共价连接偶联物,其中胶体金表面为亲水性功能化层,抗体通过该层与胶体金共价连接;所述胶体金表面亲水层含有羧酸基团,可通过羧酸与抗体表面的氨基、醇基和其它反应基团进行偶联反应。
优选的,所述检测区域内第一检测条带和第二检测条带均为抗体溶液吸附在层析膜上形成;所述第一检测条带、第二检测条带的沿层析膜长度方向展宽为0.5-5mm,优选1-3mm。
优选的,所述第一检测条带和第二检测条带均包括两段检测条段,所述检测条段的沿层析膜宽度方向长度为1-5mm,优选1-4 mm;所述第一检测条带上布置的两条检测条段自左及右给定为检测条段A和检测条段B;所述第二检测条带上布置的两条检测条段自左及右给定为检测条段C和检测条段D;所述检测条段A、检测条段B、检测条段C和检测条段D分别含有选自AFP抗体、CA125抗体、 CA19-9抗体、CA72-4抗体和CEA抗体之一。
优选的,所述第一检测条带和第二检测条带均包括三段检测条段,所述检测条段的沿层析膜宽度方向长度为1-5mm,优选1-4 mm;所述第一检测条带上布置的三条检测条段自左及右给定为检测条段E、检测条段F、检测条段G;所述第二检测条带上布置的三条检测条段自左及右给定为检测条段H、检测条段I、检测条段J;所述检测条段E、检测条段F、检测条段G、检测条段H、检测条段I、检测条段J分别含有选自AFP抗体、CA125抗体、 CA19-9抗体、CA72-4抗体和CEA抗体之一。
优选的,一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:所述检测膜通过静电纺丝技术将聚合物膜一体化集成在支撑基底上,所述聚合物为聚乳酸、聚己内酯、聚偏氟乙烯、聚壳多糖;所述静电纺丝的直径为0.01-100 µm;且静电纺丝层析膜的空隙率均值为0.1-0.5µm;其中,所述胶体金区域金标抗体为胶体金溶液与抗体溶液混合,通过添加偶联剂使得抗体共价固载于胶体金表面;所述胶体金颗粒直径为20-80nm,优选20-60nm,进一步优选为40nm;所述胶体金颗粒表面覆盖有柠檬酸;所述第一检测条带、第二检测条带和质控带通过喷膜装置将抗体溶液打印于静电纺丝膜上形成;抗体蛋白的上载量为0.01-300 µg/mm2,优选0.1-100 µg/mm2,进一步优选1-50 µg/mm2。
优选的,所述一体化多元肿瘤早期诊断检测膜在多种肿瘤检测中的应用,所述检测为通过综合分析各检测条带的显色程度,给出多种肿瘤的早期诊断。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜使用多种抗体上载率高和机械强度高的聚合物膜,该层析膜可布设于亲水性的金属基底上获得均匀层析效果,确保检测质量。本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜不含多层结构,克服了层间接触质量控制不一致对检测稳定性的影响。降低了现有技术中多层结构对显色反应效率的变动,获得准确的定量检测数据。本发明的层析膜平行布设多条显色检测条带,克服了检测液在扩散过程中浓度变化带来的误差。本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜具有过滤区域,可以去除体液样品,包括血清、唾液、尿等的其他成分,提高抗原与胶体金抗体偶联物结合的选择性,进一步提高了检测效率。本发明公开的胶体金与抗体偶联物(即金标抗体)通过直径20-80 nm的胶体金纳米颗粒表面的羧酸基团与抗体蛋白共价连接,形成的胶体金-抗体偶联物不能发生可逆分离,具有优异的稳定性,可长期稳定地保持与抗原特异性结合的能力。本发明提供多种胶体金与不同抗体的偶联物(即,多元金标抗体),将多元金标抗体与其相对应的单克隆抗体条带的配合使用,通过特异性的显色反应反映出多种癌症标志物的含量,从而综合检测两种或两种以上特定种类的肿瘤标志物含量,显著提高了肿瘤诊断的准确性。本发明同时检测多元肿瘤标志物可以针对年龄、行业、地域(包括生活习惯、饮食习惯)的区别,着重检测肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。而且,还可以根据不同的癌症种类,制备针对性的检测层析膜,扩展癌症早期检测的范围。本发明还提供一种使用该检测膜对多种癌症进行定性分析的应用。
附图说明
图1为本发明一种检测膜结构示意图;
图2为本发明另一种检测膜结构示意图;
图3为本发明实施例的电纺纤维膜微观形貌特征及水接触角测定图;
图4本发明实施例的纳米金溶液原料AuNP和αAFP金标抗体储液紫外-可见吸收光谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4,本发明提供一种技术方案:一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜,包括设在支撑基底上依次相连的样品区域1、过滤区域2、胶体金区域3、检测区域4和吸水区域5,所述检测区域上设有第一检测条带6、第二检测条带7和一条质控线8;所述胶体金区域上设有层析膜,所述层析膜的支撑基底为金属材料或镀有金属镀层的片基,所述金属材料采用不锈钢箔、铜箔或铝箔,所述金属材料的厚度为0.2-3mm;所述金属镀层厚度为0.01-100 µm;镀有金属镀层的片基总厚度为0.2-3mm;
所述样品区域1、过滤区域2、胶体金区域3、检测区域4和吸水区域5的宽度相同,均为0.5-1.5 cm,优选0.7 cm;所述样品区域1高度为0.5-1.5 cm,优选0.7 cm;所述过滤区域2高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述胶体金区域3高度为0.3-1.5 cm,优选0.5 cm;所述检测区域4上第一检测条带与胶体金区域3边缘之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述第一检测条带6与第二检测条带7之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm,所述第二检测条带7与质控线8之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm;所述质控线8与吸水区域5边缘之间高度为0.2-0.8 cm,优选0.3 cm,所述检测区域高度为0.8-3.2cm,所述吸水区域5高度为0.5-1.5cm,优选0.8 cm。
本发明中,所述胶体金区域内含有胶体金-抗体偶联物作为金标抗体,所述金标抗体为胶体金与抗体的共价连接偶联物,其中胶体金表面为亲水性功能化层,抗体通过该层与胶体金共价连接;所述胶体金表面亲水层含有羧酸基团,可通过羧酸与抗体表面的氨基、醇基和其它反应基团进行偶联反应。
本发明中,所述检测区域内第一检测条带和第二检测条带均为抗体溶液吸附在层析膜上形成;所述第一检测条带6、第二检测条带7的沿层析膜长度方向展宽为0.5-5mm,优选1-3 mm;所述第一检测条带6和第二检测条带7均包括两段检测条段,所述检测条段的沿层析膜宽度方向长度为1-5mm,优选1-4 mm;所述第一检测条带6上布置的两条检测条段自左及右给定为检测条段A9和检测条段B10;所述第二检测条带7上布置的两条检测条段自左及右给定为检测条段C11和检测条段D12;所述检测条段A9、检测条段B10、检测条段C11和检测条段D12分别含有选自AFP抗体、CA125抗体、 CA19-9抗体、CA72-4抗体和CEA抗体之一;所述第一检测条带6和第二检测条带7均包括三段检测条段,所述检测条段的沿层析膜宽度方向长度为1-5mm,优选1-4 mm;所述第一检测条带上布置的三条检测条段自左及右给定为检测条段E13、检测条段F14、检测条段G15;所述第二检测条带7上布置的三条检测条段自左及右给定为检测条段H16、检测条段I17、检测条段J18;所述检测条段E13、检测条段F14、检测条段G15、检测条段H16、检测条段I17、检测条段J18分别含有选自AFP抗体、CA125抗体、CA19-9抗体、CA72-4抗体和CEA抗体之一。
实施例一:
制备方法包括以下步骤:
A、电纺纳米纤维膜:称取左旋聚乳酸和聚环氧乙烷,加入到二氯甲烷中,使得聚乳酸与聚环氧乙烷重量比为PLLA/PEO = 5:1,磁力搅拌8h;待完全溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺,使得二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为6:4。继续搅拌30min,配制成PLLA/PEO混合溶液。控制溶液体积使得聚合物在混合溶剂中的最终浓度为4%重量体积比。采用静电纺丝设备进行纺丝。将上述溶液吸入注射器,用注射泵控制流量。采用内径为0.32mm的不锈钢平口针头为喷头,直径20cm转盘式接收器,其上铺有0.40mm厚度的铝箔。0~+40kV的高压直流电源。纺丝参数设定如下:流速1mL/h、电压+8.5kV、接收距离15cm,转盘转速为60rpm。喷头以转盘中心为起点作行程10 cm的往复运动8次,喷头线速度为5 cm/min。环境温度25℃;相对湿度控制为30%。将电纺得到的纤维与铝箔一起从转盘中取下放入真空烘箱中,在60℃干燥8h,彻底清除溶剂。退火至室温后取出。如附图3中结果显示,电纺纤维的平均直径为408nm,电纺纤维膜厚度均值为7 µm。测得该铝箔基底上的电纺纤维膜水接触角为0°,显示了良好的亲水性。此外PEO使得电纺纤维膜具有良好的生物相容性,亦即最大程度维持抗体抗原的活性。将此PLLA/PEO (5:1)电纺纤维膜连同其铝箔基底用切片机切成30 mm×8 mm的条状备用;
B、电纺纤维膜预处理:将上述条状电纺纤维膜放入样品处理溶液中,浸泡处理1小时后取出37°C烘干3小时。样品处理液的配制: 0.5% 牛血清白蛋白BSA和1.0 %的聚乙烯醇,20mM,ρΗ7.4的磷酸缓冲液。0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置于4°C保存备用,有效期一周;
C、抗体制备及电纺纤维膜抗体负载:选用商品化的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体、癌胚抗原单克隆抗体、CA125单克隆抗体、CA19-9单克隆抗体以及作为质控抗体的羊抗鼠IgG抗体,对20mM,pH7.4的磷酸缓冲液4°C透析过夜备用。负载缓冲液的配制:20mM pH 7.4的PBS为负载缓冲液,0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置4°C保存备用,有效期两周。用负载缓冲液将鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I)、癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) 、CA125单克隆抗体(αCA125)、CA19-9单克隆抗体(αCA19-9) 分别稀释为lmg/ml,使用定量喷膜装置AirJetTMBioDot以lµL/mm的量将上述抗体溶液以中心点间隔3mm 的距离均匀喷印于0.8 cm宽度电纺纤维膜上。以附图1的结构布设检测条带,即,检测条段A为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段B为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段C为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段D为CA19-9单克隆抗体(αCA19-9)。控制BioDot喷点与电纺纤维膜接触速度和时间,使得各检测条带长/宽分别为3 mm/2 mm。平行布设的检测条段A/B之间相隔2mm,C/D之间相隔2mm。用负载缓冲液将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释为lmg/ml,质控线通过BioDot连续喷涂羊抗鼠IgG单克隆抗体于平行检测条段C/D中心点之后3mm处,质控线宽2mm。室温晾干30分钟后,于37 °C烘干1小时,加入干燥剂封存4°C备用。
D、金标抗体:粒径均值为20nm-80nm的胶体金用常规的柠檬酸三钠还原法以HAuCl4原料出发制备。作为参照,本实施例使用质量控制良好的商购样品,其为直径40 nm的胶体金溶液。40 nm的胶体金溶液经过离心管浓缩,使其最终OD值为3备用。取OD值为3、直径为40nm的胶体金7 ml及配对的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体II (αAFP-II) 200µg,在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合,加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂,且使得BSA最终浓度为1%,采用高速离心法(10000r/min,30min,4°C )除去未结合的单克隆抗体,在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体复合物(αAFP金标抗体)。收集该αAFP金标抗体,复溶于1 mL的20mM,pH7. 4的无盐磷酸缓冲液中,加入1-乙基-3,3-二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐至1mg/mL,室温下反应15分钟。加入1.4 µL 2-氨基乙醇对EDC进行淬火处理。由此制得αAFP共价连接于金纳米颗粒上的稳定金标抗体。使用同样流程,分别制备共价连接的αCEA金标抗体、αCA125金标抗体、αCA19-9金标抗体。用10 ml含0. 2%聚乙二醇的20mM,pH7. 4的无盐磷酸缓冲液缓涤胶体金-抗体复合物,离心除去上清液,得到深红色沉淀,纯化后的沉淀用2ml浓度为20mM,pH 8的硼酸缓冲液溶解,储存于4°C备用。紫外-可见吸收光谱显示αAFP金标抗体储液的吸收峰在527 nm,OD值3.4 ,如附图4所示;
E、金标抗体区:上述分别制备的共价连接的αAFP金标抗体、αCEA金标抗体、αCA125金标抗体和αCA19-9金标抗体储液混合。用BioDot喷膜仪以10 µL/cm的量均匀喷涂于0. 8cm宽度电纺纤维膜的预留的金标抗体区内。参照附图1,该金标抗体区为起始于距平行检测条段A、检测条段B中心点 5mm处,终止于检测膜一端5mm处的连续区域。37°C真空干燥1小时。由此即制得多元免疫检测的胶体金检测膜。加入干燥剂封存备用。
实施例2
按照实施例1的方式制备多元免疫检测的胶体金检测膜,不同在于在步骤C中“抗体制备及电纺纤维膜抗体负载”中,选用商品化的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体(αAFP)、癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) 、CA125单克隆抗体(αCA125)、CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)以及作为质控抗体的羊抗鼠IgG抗体,以附图1的结构布设检测条带。即,检测条段A为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段B为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段C为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段D为CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)。于此相应地,在步骤D“金标抗体”中,分别制备共价连接的αAFP金标抗体、αCEA金标抗体、αCA125金标抗体、αCA72-4金标抗体。并且在步骤E“金标抗体区”中,用BioDot喷膜仪将αAFP金标抗体、αCEA金标抗体、αCA125金标抗体、αCA72-4金标抗体均匀喷涂于0. 8cm宽度电纺纤维膜的预留的金标抗体区内。加入干燥剂封存备用。
实施例3
制备方法包括以下步骤:
A、电纺纳米纤维膜:称取左旋聚乳酸和聚环氧乙烷,加入到二氯甲烷中,使得聚乳酸与聚环氧乙烷重量比为PLLA/PEO = 5:1,磁力搅拌8h。待完全溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺,使得二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为6:4。继续搅拌30min,配制成PLLA/PEO混合溶液。控制溶液体积使得聚合物在混合溶剂中的最终浓度为4%重量体积比。采用静电纺丝设备进行纺丝。将上述溶液吸入注射器,用注射泵控制流量。采用内径为0.32mm的不锈钢平口针头为喷头,直径20cm转盘式接收器,其上铺有0.40mm厚度的铝箔。 0~+40kV的高压直流电源。纺丝参数设定如下:流速1mL/h、电压+8.5kV、接收距离15cm,转盘转速为60rpm。喷头以转盘中心为起点作行程10 cm的往复运动8次,喷头线速度为5 cm/min。环境温度25℃;相对湿度控制为30%。将电纺得到的纤维与铝箔一起从转盘中取下放入真空烘箱中,在60℃干燥8h,彻底清除溶剂。退火至室温后取出。如附图3中结果显示,电纺纤维的平均直径为408 nm,电纺纤维膜厚度均值为7 µm。测得该铝箔基底上的电纺纤维膜水接触角为0°,显示了良好的亲水性。此外PEO使得电纺纤维膜具有良好的生物相容性,亦即最大程度维持抗体抗原的活性。将此PLLA/PEO (5:1)电纺纤维膜连同其铝箔基底用切片机切成30 mm×12 mm的条状备用。
B、电纺纤维膜预处理:将上述条状电纺纤维膜放入样品处理溶液中,浸泡处理1小时后取出37°C烘干3小时。样品处理液的配制:20mM,ρΗ7.4的磷酸缓冲液含有0. 5% 牛血清白蛋白BSA、1.0 %的聚乙烯醇和0.2%吐温20。0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置于4°C保存备用,有效期一周。
C、抗体制备及电纺纤维膜抗体负载:选用商品化的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体(αAFP)、癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) 、CA125单克隆抗体(αCA125)、CA19-9单克隆抗体(αCA19-9)、CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)以及作为质控抗体的羊抗鼠IgG抗体,对20mM,pH7.4的磷酸缓冲液(PBS) 4°C透析过夜备用。负载缓冲液的配制:20mM pH 7.4的PBS为负载缓冲液,0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置4°C保存备用,有效期两周。用负载缓冲液将鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I)、癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) 、CA125单克隆抗体(αCA125)、CA19-9单克隆抗体(αCA19-9) 、CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)分别稀释为lmg/ml,使用定量喷膜装置AirJetTMBioDot以lµL/mm的量将上述抗体溶液以中心点间隔3mm 的距离均匀喷印于1.2 cm宽度电纺纤维膜上。以附图2的结构布设检测条带,即,检测条段E为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段F为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段G为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段H为CA19-9单克隆抗体(αCA19-9),检测条段I喷涂负载缓冲液作为空白,检测条段J为CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)。控制BioDot喷点与电纺纤维膜接触速度和时间,使得各检测条带长/宽相等,均为2.5 mm。平行布设的检测条段E与F之间,F与G之间相隔均为2mm,其中检测条段E的起始端为检测膜的最左边缘。同样,平行布设的检测条段H与I之间,I与J之间相隔均为2mm,其中检测条段G的起始端为检测膜的最左边缘。用负载缓冲液将羊抗鼠IgG单克隆抗体稀释为lmg/ml,质控线通过BioDot连续喷涂羊抗鼠IgG单克隆抗体于平行检测条段HI/J中心点之后3mm处。质控线宽2mm。室温晾干30分钟后,于37 °C烘干1小时,加入干燥剂封存4°C备用;
D、金标抗体:粒径均值为20nm-80nm的胶体金用常规的柠檬酸三钠还原法以HAuCl4原料出发制备。作为参照,本实施例使用质量控制良好的商购样品,其为直径40 nm的胶体金溶液。40 nm的胶体金溶液经过离心管浓缩,使其最终OD值为3备用。取OD值为3、直径为40nm的胶体金7 ml及配对的鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体II (αAFP-II) 200µg,在pH 8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合,加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂,使得BSA最终浓度为1%,采用高速离心法(10000r/min,30min,4°C )除去未结合的单克隆抗体,在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体复合物(αAFP金标抗体)。收集该αAFP金标抗体,复溶于1 mL的20mM,pH7. 4的无盐磷酸缓冲液中,加入1-乙基-3,3-二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐至1mg/mL,室温下反应15分钟。加入1.4 µL 2-氨基乙醇对EDC进行淬火处理。由此制得αAFP共价连接于金纳米颗粒上的稳定金标抗体。使用同样流程,分别制备共价连接的αCEA金标抗体、αCA125金标抗体、αCA19-9金标抗体、αCA72-4金标抗体。用10 ml含0. 2%聚乙二醇的20mM,pH7. 4的无盐磷酸缓冲液缓涤胶体金-抗体复合物,离心除去上清液,得到深红色沉淀,纯化后的沉淀用2ml浓度为20mM,pH 8的硼酸缓冲液溶解,储存于4°C备用。紫外-可见吸收光谱显示αAFP金标抗体储液的吸收峰在527 nm,OD值3.4;
F、金标抗体区:上述分别制备的共价连接的αAFP金标抗体、αCEA金标抗体、αCA125金标抗体、αCA19-9金标抗体和αCA72-4金标抗体储液混合。用BioDot喷膜仪以10 µL/cm的量均匀喷涂于0. 8cm宽度电纺纤维膜的预留的金标抗体区内。参照附图1,该金标抗体区为起始于距平行检测条段A/B/C中心点 5mm处,终止于检测膜一端5mm处的连续区域。37°C真空干燥1小时。由此即制得多元免疫检测的胶体金检测膜。加入干燥剂封存备用。
实施例4
使用实施例1中制备的检测膜用于子宫癌、胰腺癌、肝癌、结肠直肠癌的检测。将25µL血液样品滴加在样品区中心区。迅速滴加40 µL样品处理液,样品处理液的配制为20mM,ρΗ7.4的磷酸缓冲液含有0.5% 牛血清白蛋白BSA、1.0 %的聚乙烯醇和0.2%吐温20。0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置于4°C保存备用,有效期一周。样品经由电纺纤维检测膜上的毛细作用向过滤区、金标区、检测区依次扩散,待样品经过质控线后,手持吸水区(亦即可接触区)立即检查质控线和各检测条带的颜色变化。实施例1 制备的检测膜中检测条段A为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段B为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段C为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段D为CA19-9单克隆抗体(αCA19-9)。首先检查质控线的显色反应情况,如果质控线没有显色反应,本次检测结果没有实质意义,原因可能是样品有误或检测膜因保存不当实效。如果质控线呈红色,明确说明肿瘤类型的标志物的显色反应如表1所示,其中显色(+),未显色(-)。
表1实施例1中制备的检测膜对多种肿瘤的检测说明
A | B | C | D | 肿瘤类型 |
+ | + | - | - | 肝癌 |
- | -/+ | + | + | 子宫癌 |
- | + | - | - | 结肠直肠癌 |
- | - | - | + | 胰腺癌 |
实施例5
实施例2中制备的检测膜用于卵巢癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌的检测。将25µL血液样品滴加在样品区中心区。迅速滴加40 µL样品处理液,样品处理液的配制为20mM,ρΗ7.4的磷酸缓冲液含有0.5% 牛血清白蛋白BSA、1.0 %的聚乙烯醇和0.2%吐温20。0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置于4°C保存备用,有效期一周。样品经由电纺纤维检测膜上的毛细作用向过滤区、金标区、检测区依次扩散,待样品经过质控线后,手持吸水区(亦即可接触区)立即检查质控线和各检测条带的颜色变化。实施例2制备的检测膜中检测条段A为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段B为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段C为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段D为CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)。首先检查质控线的显色反应情况,如果质控线没有显色反应,本次检测结果没有实质意义,原因可能是样品有误或检测膜因保存不当实效。如果质控线呈红色,明确说明肿瘤类型的标志物的显色反应如表2所示,其中显色(+),未显色(-)。
表2实施例2中制备的检测膜对多种肿瘤的检测说明
A | B | C | D | 肿瘤类型 |
+ | + | - | - | 肝癌 |
- | -/+ | + | + | 卵巢癌 |
- | + | - | - | 结肠直肠癌 |
- | -/+ | - | + | 胃癌 |
实施例6
实施例3中制备的检测膜用于肝癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌的检测。将40µL血液样品滴加在样品区中心区。迅速滴加80µL样品处理液,样品处理液的配制为20mM,ρΗ7.4的磷酸缓冲液含有0.5% 牛血清白蛋白BSA、1.0 %的聚乙烯醇和0.2%吐温20。0. 22µm微孔滤膜过滤除菌后置于4°C保存备用,有效期一周。样品经由电纺纤维检测膜上的毛细作用向过滤区、金标区、检测区依次扩散,待样品经过质控线后,手持吸水区(亦即可接触区)立即检查质控线和各检测条带的颜色变化。实施例3制备的检测膜中检测条段E为甲胎蛋白单克隆抗体I(αAFP-I),检测条段F为癌胚抗原单克隆抗体(αCEA) ,检测条段G为CA125单克隆抗体(αCA125),检测条段H为CA19-9单克隆抗体(αCA19-9),检测条段I喷涂负载缓冲液作为空白,检测条段J为CA72-4单克隆抗体(αCA72-4)。首先检查质控线的显色反应情况,如果质控线没有显色反应,本次检测结果没有实质意义,原因可能是样品有误或检测膜因保存不当实效。如果质控线呈红色,明确说明肿瘤类型的标志物的显色反应如表3所示,其中显色(+),未显色(-)。
表3实施例3中制备的检测膜对多种肿瘤的检测说明
A | B | C | D | F | 肿瘤类型 |
+ | + | - | - | - | 肝癌 |
- | -/+ | + | - | + | 卵巢癌 |
- | -/+ | + | + | - | 子宫癌 |
- | + | - | - | - | 结肠直肠癌 |
- | - | - | + | - | 胰腺癌 |
- | -/+ | - | - | + | 胃癌 |
本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜使用多种抗体上载率高和机械强度高的聚合物膜,该层析膜可布设于亲水性的金属基底上获得均匀层析效果,确保检测质量。本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜不含多层结构,克服了层间接触质量控制不一致对检测稳定性的影响。降低了现有技术中多层结构对显色反应效率的变动,获得准确的定量检测数据。本发明的层析膜平行布设多条显色检测条带,克服了检测液在扩散过程中浓度变化带来的误差。本发明的一体化多元肿瘤早期诊断检测膜具有过滤区域,可以去除体液样品,包括血清、唾液、尿等的其他成分,提高抗原与胶体金抗体偶联物结合的选择性,进一步提高了检测效率。本发明公开的胶体金与抗体偶联物(即金标抗体)通过直径20-80 nm的胶体金纳米颗粒表面的羧酸基团与抗体蛋白共价连接,形成的胶体金-抗体偶联物不能发生可逆分离,具有优异的稳定性,可长期稳定地保持与抗原特异性结合的能力。本发明提供多种胶体金与不同抗体的偶联物(即,多元金标抗体),将多元金标抗体与其相对应的单克隆抗体条带的配合使用,通过特异性的显色反应反映出多种癌症标志物的含量,从而综合检测两种或两种以上特定种类的肿瘤标志物含量,显著提高了肿瘤诊断的准确性。本发明同时检测多元肿瘤标志物可以针对年龄、行业、地域(包括生活习惯、饮食习惯)的区别,着重检测肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。而且,还可以根据不同的癌症种类,制备针对性的检测层析膜,扩展癌症早期检测的范围。本发明还提供一种使用该检测膜对多种癌症进行定性分析的应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.本发明公开了一种一体化多元肿瘤早期诊断检测膜及其应用,该检测膜通过静电纺丝技术将聚合物膜一体化集成在支撑基底上,包括设在支撑基底上依次相连的样品区域、过滤区域、胶体金区域、检测区域和吸水区域。
2.在检测区域上设有多条检测条带和一条质控线:在胶体金区域含有胶体金抗体偶联物,胶体金抗体为显色抗体,所述检测条带由多条固载有不同捕捉抗体的线段构成,显色抗体与捕捉抗体为可以形成双抗体夹心配对的抗体,本发明的胶体金层析膜通过对人体液中多种肿瘤标志物的检测,实现对肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、子宫癌、卵巢癌的检测。
3.本发明的检测膜对多种癌症检测特异性高、灵敏度高、具有良好的稳定性和重复性。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181130 |
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