CN108456666A - 一种3-甾酮-△1-脱氢酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种3‑甾酮‑△¹‑脱氢酶及其编码基因和应用。本发明研究首次发现一种全新的3‑甾酮‑△¹‑脱氢酶，其在转化培养基中底物4‑AD浓度高达0.8%时，转化率可高达99%，转化液中产物ADD的浓度达到7.9 g/L，远远高于其他相关报道，有效的减少底物4‑AD残留，提高产物ADD的含量，减少了分离提取的步骤，具有很好的产业化前景。

Description

一种3-甾酮-△1-脱氢酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种3-甾酮-△¹-脱氢酶及其编码基因和应用。

背景技术

甾体化合物(steroids)又称类固醇，是广泛存在于生物体组织内的一类重要的天然有机化合物。从结构上看，甾体是一类以环戊烷多氢菲(Cl7)为母核的化合物，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环(如图1所示)。由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同，形成了种类繁多的甾体化合物，对机体起着非常重要的调节作用。甾体类药物是指具有甾核结构的甾体激素类药物，包括盐皮质激素、糖皮质激素、性激素和蛋白同化激素等。盐皮质激素和糖皮质激素具有抗炎症、抗过敏等功效，广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘和湿疹等疾病；性激素是治疗雄性器官衰退和一些妇科疾病的主要药物，是治疗乳腺癌、***癌的辅助治疗药物，也是近年来需求旺盛的口服避孕药的主要成分；蛋白同化激素可促进蛋白质合成并抑制蛋白质异化，使肌肉生长；促使韩、碟在组织中沉积，加速骨组织分化和生长等。由于甾体类药物对机体起着非常重要的调节作用，到目前为止，已获得批准使用的甾体类药物大约有300多种，是产量仅次于抗生素的第二大类药物。

3-甾酮-△¹-脱氢酶(KSDD，EC 1.3.99.4)是甾体母核降解过程中的关键酶，可介导甾体母核C1和C2之间双键的形成。这样的结构变化可以成倍的增加药物的抗炎活性，在甾体类药物生产过程中起着重要作用，具有丰富的应用价值，因此KSDD酶基因进行深入研究对甾体药物的开发具有重要的意义。近年来，国内外众多学者在节杆菌(Arthrobacter)，分支杆菌(Mycobacterium sp.)，诺卡氏菌(Nocardia sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)和金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)等微生物中克隆并鉴定了多个KSDD酶基因(参考文献)，并且将一些不同来源的KSDD酶基因进行了外源表达。专利CN106636160A公开了一种来源于新金分支杆菌的KSDD，实现了该基因在大肠杆菌BL21中的过量表达，构建的基因工程菌株可以转化4-AD为ADD，但是投料浓度仅为0.1％(w/v)，底物转化率仅为76.5％。专利CN102168099A公开了一种来源于金龟子绿僵菌KSDD基因序列，将该基因外源表达到毕赤酵母中，构建的基因工程酵母也可以转化4-AD毕赤酵母为ADD，但是最大投料浓度也仅为0.15％(w/v)。专利CN102703494A公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化4-AD生成ADD的方法，申请人将新金分支杆菌的KSDD外源表达到枯草芽孢杆菌中，构建的基因工程菌株比对照菌株的酶活力显著提高，但是以0.1％4-AD为底物时，底物的摩尔转化率也仅仅为65.7％。

综上所述，目前利用基因工程方法将不同来源的KSDD酶基因外源表达到不同宿主中，构建重组菌株进行生物转化4-AD制备ADD仍然面临底物投料浓度小、转化率低等问题。因此充分挖掘KSDD酶基因资源，构建高效表达的KSDD酶基因工程菌株对实现利用生物技术转化AD制备重要甾体类原料药ADD的工业化生产具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的3-甾酮-△¹-脱氢酶及其编码基因和应用，以解决已经报道的KSDD酶基因外源表达时存在3-甾酮-△¹-脱氢酶活力低，导致其应用时底物投料浓度小，转化率低等问题。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种分离的3-甾酮-△¹-脱氢酶，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶为如下 (1)或(2)的蛋白质；(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；(2)与(1) 中蛋白质具有至少80％同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。

如本发明实施例中所列举的，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码前述3-甾酮 -△¹-脱氢酶。

本发明的编码前述3-甾酮-△¹-脱氢酶的多核苷酸，可以是DNA形式或RNA形式。DNA 形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明的编码所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸PCR法。

如本发明实施例中所列举的，所述编码前述3-甾酮-△¹-脱氢酶的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，包含前述分离的多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述重组表达载体。这些方法包括重组DNA 技术、DNA合成技术等。可将编码所述3-甾酮-△¹-脱氢酶的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达3-甾酮-△¹-脱氢酶，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pET-28a。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述细胞含有前述重组表达载体或基因组中整合有外源的前述分离的多核苷酸。

本发明的较佳案例中，所述宿主细胞采用大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。所述的大肠杆菌优选为BL21(DE3)。所述枯草芽孢杆菌优选为BS158。所述毕赤酵母优选为GS115。

本发明的第五方面，提供一种制备前述3-甾酮-△1-脱氢酶的方法，包括以下之任一：

(1)构建含有3-甾酮-△¹-脱氢酶的编码多核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶。

或者

(2)在合适的条件下培养前述宿主细胞，使之表达所述3-甾酮-△¹-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△¹-脱氢酶。

本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pET-28a。所述宿主细胞采用大肠杆菌。所述的大肠杆菌优选为BL21(DE3)。

本发明的第六方面，提供第一方面所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的宿主细胞用于转化4-AD生成ADD的用途。

本发明的第七方面，提供一种4-AD生成ADD的转化剂，含有前述第一方面所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的宿主细胞或第四方面所述的宿主细胞中的任一项。

需要说明的是，在本发明中，4-AD均为雄烯二酮，ADD均为雄二烯二酮。

本发明的第八方面，提供一种转化4-AD生成ADD的方法，包括步骤：将本发明的第一方面的3-甾酮-△¹-脱氢酶或第四方面所述的宿主细胞，作用于4-AD。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、发明人首次从新金分支杆菌DSM 1381中克隆出一个新的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因kstD2。kstD2与目前报道的其它3-甾酮-△¹-脱氢酶基因最高相似度仅为85％，具有明显的差异性，是一种新的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，为进一步研究该基因家族进化关系提供条件，也为利用基因工程技术构建具有高效3-甾酮-△¹-脱氢酶重组菌提供了更多的基因资源。

2、通过基因工程手段，将kstD2基因在大肠杆菌中进行了异源过量表达，获得了高效表达3-甾酮-△¹-脱氢酶的重组菌。建立该重组菌对3-甾酮-4-烯甾体类化合物的生物转化工艺，在转化培养基中底物4-AD浓度高达0.8％时，利用该工艺底物的转化率可高达99％，转化液中产物ADD的浓度达到7.9g/L，远远高于其他相关报道，有效的减少底物4-AD残留，提高产物ADD的含量，减少了分离提取的步骤，具有很好的产业化前景。

附图说明

图1：甾体化合物通式，在本发明中，3-甾酮甾体化合物可以是现有3-甾酮-4-烯甾体类化合物，常见的有AD、9α-OH-AD、17α-羟基***、环氧***、霉菌氧化物、可的松、氢化可的松、依普利酮、20-(羟甲基)孕-4-烯-3-酮。

图2：琼脂糖凝胶电泳检测KstD2 PCR产物。

图3：重组大肠杆菌BL21-kstD2 AD转化率。

图4：重组大肠杆菌BL21-kstD2AD转化实验中的AD的剩余量。

图5：重组大肠杆菌BL21-kstD2 AD转化实验中ADD的产量。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1新金分支杆菌DSM 1381 3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2的获取

利用Illumina Miseq测序技术对新金分支杆菌DSM 1381进行测序分析，根据基因注释信息，得到完整的3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2序列，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因 kstD2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：

GTGACCGATCAGAACAACATCACCGTCGACCTCGTCGTCGTCGGCTCGGGTACCGGGATGGCGGCAGCATTGGCTGCCCACGAGCTGGGAATGTCGACGCTGATCGTCGAGAAGAGCGCCTATGTCGGTGGTTCGACGGCTCGCTCCGGCGGTGCCTTCTGGCTTCCCGGCAGCTCCATTCTCAAGGACGCCGGTTCGGCGGACACTCCGGCCAAGGCGCGCACCTACCTTGAAGCACTCGTCGGTGACGACGTCTCACCCGAACGCGCACGCACTTTCATCGATCAGATCCCCGCGACCATCGACATGTTGCGTCGCACCACCCCGATGAAGTTCATGTGGGCCAAGGGATATTCGGACTACCACCCGGAGAGGCCAGGAGGCAGTGCGGTGGGCCGGACCTGTGAGTGTCGCCCGTTCGACACTGCGGTCCTCGGTCCAGAGCTGGCGCGGCTACGACCTGGAGTGATGAAGTCATCGTTCCCGATGCCGGTCACCGGCGCCGATTACCGTTGGCTGAACCTGATGGCCCGCACCCCGCGCAAGTCCTGGCCGCGGATCATGCTGCGGGCCATGCAGGGTGTCGGCGGTTTGGCCCTGCGGCGCCGGTACGCCGCAGGCGGCCAGGCCTTGGCGGCCGGGATGTTCGCCGGCGTGCTGCAGGCGGGGATCCCGGTGTGGACCGATTCGACGGTGACCGAGCTCATCACCGATGGTGGGCGGGTGACCGGCGCGCGGGTGCTGCGCGAGGGATCGGCCGTGACCGTCACCGCACGCCGTGGCATCGTGCTGGCCACCGGCGGTTTCGACCACGAGATGAATTGGCGGCGGAAGTTCCAGTCCGAGCTCCTCGGTGAACATCTCAGCCTTGGGGCCGAGAGCAATACCGGCGATGGCATCCGGCTCGCCCAGGACCTGGGCGCAGGCACCGGACTGATGGACCAGGCATGGTGGTTTCCGGCCTTTGCTCCGCTGCCTGGCGGGGATCCCACCGTGATGCTGGCCGAGCGGTCGCTGCCCGGCTGCCTGCTGGTAGACCAGACCGGTGAGCGCTTCATCAACGAGGCCACCGACTACATGTCCTTCGGACAGCAGCTGCTGCGTCGCGAACACGCGGGCAATCCGGTCGAGACGATGTGGATGATCTTCGATCAGCGCTACCGGAACAGCTATCTGCTTGCCGCCGAACTATTTCCACGAATGCCGATCCCACAGAGTTGGTACGACGCCGGGATCGCGCACCGCGGCACGGATGCGGAAGCACTGGGCCGCCAGATCGGTTTCGATCCCGCGACGTTGGTCGCCACGATCGAGCGGTTCAACGGACTCGCCGATGCCGGTGTCGACGCCGACTTCCAGCGCGGCGCGAGCGCCTACGACCGCTACTACGGCGACCCGACGATCACGCCCAACCCGAACCTGCGACCGCTGGATCCCGGCCCGCTGTACGCCGTCAAGGTCGTGCTGAGCGACCTGGGCACCTGTGGTGGGGTCCTGTGCGACGTGAACGGCCGGGTTCTGCGCGAAGACGGAGTGCCCATCGACGGTCTGTACGCGATCGGCAATACCGCGGCCAACGCATTCGGCAAGACCTACCCGGGCGCGGGCGCGACCATCGCGCAGGGGCTGGTGTACGGCCATGTTGCCGCGCAGCATGCCGC CGGACACACCTGA。

所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2所对应的3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：

VTDQNNITVDLVVVGSGTGMAAALAAHELGMSTLIVEKSAYVGGSTARSGGAFWLPGSSILKDAGSADTPAKARTYLEALVGDDVSPERARTFIDQIPATIDMLRRTTPMKFMWAKGYSDYHPERPGGSAVGRTCECRPFDTAVLGPELARLRPGVMKSSFPMPVTGADYRWLNLMARTPRKSWPRIMLRAMQGVGGLALRRRYAAGGQALAAGMFAGVLQAGIPVWTDSTVTELITDGGRVTGARVLREGSAVTVTARRGIVLATGGFDHEMNWRRKFQSELLGEHLSLGAESNTGDGIRLAQDLGAGTGLMDQAWWFPAFAPLPGGDPTVMLAERSLPGCLLVDQTGERFINEATDYMSFGQQLLRREHAGNPVETMWMIFDQRYRNSYLLAAELFPRMPIPQSWYDAGIAHRGTDAEALGRQIGFDPATLVATIERFNGLADAGVDADFQRGASAYDRYYGDPTITPNPNLRPLDPGPLYAVKVVLSDLGTCGGVLCDVNGRVLREDGVPIDGLYAIGNTAANAFGKTYPGAGATIAQGLVYGHVAAQHAAGHT。

与目前报道的其它3-甾酮-△¹-脱氢酶基因最高相似度仅为85％，具有明显的差异性，因此kstD2是一种新的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。利用Primer 5.0设计引物如下：

kstD2-F 5’cagcaagcttGTGACCGATCAGAACAACATCACC(SEQ ID NO：3)；

kstD2-R 5’ctcgaagcttTCAGGTGTGTCCGGCGGC(SEQ ID NO：4)。

其中，在引物kstD2-F上引入EcoRI酶切位点，在引物kstD2-R上引入Hind III酶切位点。

以新金分支杆菌DSM 1381的总DNA为模板，以引物kstD2-F和kstD2-R为扩增引物，选择高保真PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer(TaKaRa)进行PCR扩增具体条件如下：

95℃预变性3min，95℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸10min；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示。目标DNA片段大小为1674bp，与目标基因片段长度一直。经测序公司测序分析，得到3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2序列，长度为1674bp(SEQ ID NO：1)。

实施例2 3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2表达载体的构建和转化

将实施例1得到的片段经EcoRI和Hind III双酶切，与同样利用EcoRI和Hind III进行双酶切的表达载体pET-28a进行连接，连接产物经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)，筛选验证得到表达重组质粒。将重组质粒送到苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析，经测序所述3-甾酮-△¹-脱氢酶编码基因kstD2序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。把构建的表达重组质粒按照常规方法转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中(实验室保存)，获得生产3-甾酮-△¹-脱氢酶的基因工程菌BL21-kstD2。

实施例3基因工程菌的酶活力测定

用IPTG诱导24h后,6000rpm，4℃离心10分钟从50Ml培养物中收集重组大肠杆菌BL21(DE)和枯草芽孢杆菌164菌体，然后用50mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.0)两次清洗，最后用4mL缓冲液重悬。重悬物进行超声波破碎处理，然后12000rpm 4℃离心30分钟。取上清测定KstD酶活。酶活测定使用分光光度法，利用NanoDrop 2000测定600nm(ε600 nm＝18.7×103cm^-1M^-1)处在30℃时的吸光度变化来测定相应的酶活。反应混合物(1毫升) 包含50mMTris-HCl pH7.0、1.5mM吩嗪硫酸甲酯(PMS)、0.12mM 2，6-二氯酚靛酚 (DCPIP),300μL粗酶液、500μM AD和5g/L羟丙基-β-环糊精。每个测定重复三次。每个样本的对特定底物的酶活性通过减去的空白对照的值来计算(不含任何甾体)。总蛋白含量的测序采用Bradford法。1U的酶活性被定义为1min内还原1μmol DCPIP所需要的酶量。测得重组菌株粗酶活为3.46U/mg。

实施例4基因工程菌株BL21-kstD2对AD的转化

将重组大肠杆菌BL21-kstD2以5％接种量接种于TB培养基中，在37℃200rpm摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)使其终浓度达到1.0 mM，同时按照1.0％(W/V)加入4-AD和0.5％(W/V)加入羟丙基环糊精，继续在37℃转化。经HPLC检测分析，转化21h后底物AD的转化率达到99％(见图3)，重组大肠杆菌BL21-kstD2AD转化实验中的AD的剩余量如图4所示，产物ADD含量达到7.9g/L(见图5)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种3-甾酮-△1-脱氢酶及其编码基因和应用

<130> 181606

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1674

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaccgatc agaacaacat caccgtcgac ctcgtcgtcg tcggctcggg taccgggatg 60

gcggcagcat tggctgccca cgagctggga atgtcgacgc tgatcgtcga gaagagcgcc 120

tatgtcggtg gttcgacggc tcgctccggc ggtgccttct ggcttcccgg cagctccatt 180

ctcaaggacg ccggttcggc ggacactccg gccaaggcgc gcacctacct tgaagcactc 240

gtcggtgacg acgtctcacc cgaacgcgca cgcactttca tcgatcagat ccccgcgacc 300

atcgacatgt tgcgtcgcac caccccgatg aagttcatgt gggccaaggg atattcggac 360

taccacccgg agaggccagg aggcagtgcg gtgggccgga cctgtgagtg tcgcccgttc 420

gacactgcgg tcctcggtcc agagctggcg cggctacgac ctggagtgat gaagtcatcg 480

ttcccgatgc cggtcaccgg cgccgattac cgttggctga acctgatggc ccgcaccccg 540

cgcaagtcct ggccgcggat catgctgcgg gccatgcagg gtgtcggcgg tttggccctg 600

cggcgccggt acgccgcagg cggccaggcc ttggcggccg ggatgttcgc cggcgtgctg 660

caggcgggga tcccggtgtg gaccgattcg acggtgaccg agctcatcac cgatggtggg 720

cgggtgaccg gcgcgcgggt gctgcgcgag ggatcggccg tgaccgtcac cgcacgccgt 780

ggcatcgtgc tggccaccgg cggtttcgac cacgagatga attggcggcg gaagttccag 840

tccgagctcc tcggtgaaca tctcagcctt ggggccgaga gcaataccgg cgatggcatc 900

cggctcgccc aggacctggg cgcaggcacc ggactgatgg accaggcatg gtggtttccg 960

gcctttgctc cgctgcctgg cggggatccc accgtgatgc tggccgagcg gtcgctgccc 1020

ggctgcctgc tggtagacca gaccggtgag cgcttcatca acgaggccac cgactacatg 1080

tccttcggac agcagctgct gcgtcgcgaa cacgcgggca atccggtcga gacgatgtgg 1140

atgatcttcg atcagcgcta ccggaacagc tatctgcttg ccgccgaact atttccacga 1200

atgccgatcc cacagagttg gtacgacgcc gggatcgcgc accgcggcac ggatgcggaa 1260

gcactgggcc gccagatcgg tttcgatccc gcgacgttgg tcgccacgat cgagcggttc 1320

aacggactcg ccgatgccgg tgtcgacgcc gacttccagc gcggcgcgag cgcctacgac 1380

cgctactacg gcgacccgac gatcacgccc aacccgaacc tgcgaccgct ggatcccggc 1440

ccgctgtacg ccgtcaaggt cgtgctgagc gacctgggca cctgtggtgg ggtcctgtgc 1500

gacgtgaacg gccgggttct gcgcgaagac ggagtgccca tcgacggtct gtacgcgatc 1560

ggcaataccg cggccaacgc attcggcaag acctacccgg gcgcgggcgc gaccatcgcg 1620

caggggctgg tgtacggcca tgttgccgcg cagcatgccg ccggacacac ctga 1674

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Thr Asp Gln Asn Asn Ile Thr Val Asp Leu Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Thr Gly Met Ala Ala Ala Leu Ala Ala His Glu Leu Gly Met Ser

20 25 30

Thr Leu Ile Val Glu Lys Ser Ala Tyr Val Gly Gly Ser Thr Ala Arg

35 40 45

Ser Gly Gly Ala Phe Trp Leu Pro Gly Ser Ser Ile Leu Lys Asp Ala

50 55 60

Gly Ser Ala Asp Thr Pro Ala Lys Ala Arg Thr Tyr Leu Glu Ala Leu

65 70 75 80

Val Gly Asp Asp Val Ser Pro Glu Arg Ala Arg Thr Phe Ile Asp Gln

85 90 95

Ile Pro Ala Thr Ile Asp Met Leu Arg Arg Thr Thr Pro Met Lys Phe

100 105 110

Met Trp Ala Lys Gly Tyr Ser Asp Tyr His Pro Glu Arg Pro Gly Gly

115 120 125

Ser Ala Val Gly Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Phe Asp Thr Ala Val

130 135 140

Leu Gly Pro Glu Leu Ala Arg Leu Arg Pro Gly Val Met Lys Ser Ser

145 150 155 160

Phe Pro Met Pro Val Thr Gly Ala Asp Tyr Arg Trp Leu Asn Leu Met

165 170 175

Ala Arg Thr Pro Arg Lys Ser Trp Pro Arg Ile Met Leu Arg Ala Met

180 185 190

Gln Gly Val Gly Gly Leu Ala Leu Arg Arg Arg Tyr Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Gln Ala Leu Ala Ala Gly Met Phe Ala Gly Val Leu Gln Ala Gly Ile

210 215 220

Pro Val Trp Thr Asp Ser Thr Val Thr Glu Leu Ile Thr Asp Gly Gly

225 230 235 240

Arg Val Thr Gly Ala Arg Val Leu Arg Glu Gly Ser Ala Val Thr Val

245 250 255

Thr Ala Arg Arg Gly Ile Val Leu Ala Thr Gly Gly Phe Asp His Glu

260 265 270

Met Asn Trp Arg Arg Lys Phe Gln Ser Glu Leu Leu Gly Glu His Leu

275 280 285

Ser Leu Gly Ala Glu Ser Asn Thr Gly Asp Gly Ile Arg Leu Ala Gln

290 295 300

Asp Leu Gly Ala Gly Thr Gly Leu Met Asp Gln Ala Trp Trp Phe Pro

305 310 315 320

Ala Phe Ala Pro Leu Pro Gly Gly Asp Pro Thr Val Met Leu Ala Glu

325 330 335

Arg Ser Leu Pro Gly Cys Leu Leu Val Asp Gln Thr Gly Glu Arg Phe

340 345 350

Ile Asn Glu Ala Thr Asp Tyr Met Ser Phe Gly Gln Gln Leu Leu Arg

355 360 365

Arg Glu His Ala Gly Asn Pro Val Glu Thr Met Trp Met Ile Phe Asp

370 375 380

Gln Arg Tyr Arg Asn Ser Tyr Leu Leu Ala Ala Glu Leu Phe Pro Arg

385 390 395 400

Met Pro Ile Pro Gln Ser Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ala His Arg Gly

405 410 415

Thr Asp Ala Glu Ala Leu Gly Arg Gln Ile Gly Phe Asp Pro Ala Thr

420 425 430

Leu Val Ala Thr Ile Glu Arg Phe Asn Gly Leu Ala Asp Ala Gly Val

435 440 445

Asp Ala Asp Phe Gln Arg Gly Ala Ser Ala Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly

450 455 460

Asp Pro Thr Ile Thr Pro Asn Pro Asn Leu Arg Pro Leu Asp Pro Gly

465 470 475 480

Pro Leu Tyr Ala Val Lys Val Val Leu Ser Asp Leu Gly Thr Cys Gly

485 490 495

Gly Val Leu Cys Asp Val Asn Gly Arg Val Leu Arg Glu Asp Gly Val

500 505 510

Pro Ile Asp Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Asn Thr Ala Ala Asn Ala Phe

515 520 525

Gly Lys Thr Tyr Pro Gly Ala Gly Ala Thr Ile Ala Gln Gly Leu Val

530 535 540

Tyr Gly His Val Ala Ala Gln His Ala Ala Gly His Thr

545 550 555

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaagctt gtgaccgatc agaacaacat cacc 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgaagctt tcaggtgtgt ccggcggc 28

Claims (11)

1.一种分离的3-甾酮-△¹-脱氢酶，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶为如下(1)或(2)的蛋白质；(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；(2)与(1)中蛋白质具有至少80％同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。

2.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码如权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶。

3.如权利要求2所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种重组表达载体，包含如权利要求2或3所述的分离的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体由如权利要求2或3所述的分离的多核苷酸克隆到表达载体中获得。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET-28a。

7.一种宿主细胞，所述细胞含有如权利要求4～6之任一项所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求2～3之任一项所述的分离的多核苷酸。

8.一种制备如权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶的方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如权利要求7所述的宿主细胞，使之表达所述3-甾酮-△¹-脱氢酶，而后分离及纯化获得所述3-甾酮-△¹-脱氢酶。

9.如权利要求1所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、如权利要求2～3之任一项所述多核苷酸、如权利要求4～6之任一项所述重组表达载体或如权利要求7所述宿主细胞用于转化4-AD生成ADD的用途。

10.一种4-AD生成ADD的转化剂，含有如权利要求1所述3-甾酮-△¹-脱氢酶、如权利要求2～3之任一项所述多核苷酸、如权利要求4～6之任一项所述重组表达载体或如权利要求7所述的宿主细胞中的任一项。

11.一种转化4-AD生成ADD的方法，包括步骤：将如权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶或如权利要求7所述的宿主细胞，作用于4-AD。