CN111484976A - 肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测*** - Google Patents

肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测*** Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测***，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒以及高通量测序仪，其中，肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒包括EGFR免疫磁球、接头组、引物组，EGFR免疫磁球通过首先将乳化剂GHDC与链接分子的骨架材料胆固醇与磁珠溶液混合，然后加入基质材料DOPC溶液以及表面活性剂HQCMC溶液进行室温超声，最后加入EGFR抗体从而制备而成。因此通过该检测***能够对血液中非常稀少的CTC进行精确、快速、通量高的基因序列分析，从而提供肿瘤形成、分化、转移的本质信息，对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。

Description

肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测***
技术领域
本发明涉及生物技术与生物医学领域，具体涉及一种肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测***。
背景技术
肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一。预计到2025年我国肺癌每年的发病率将达100万人，其中85％～90％主要以非小细胞肺癌(NSCLC)为主。由于肺癌早期检出率不高，并无特异性及明细的临床表现，约60％～70％的肺癌患者初诊时已经有转移现象，便失去了早期手术治疗的机会。而在晚期的治疗中，主要以化学治疗为主，在肺癌晚期化疗中，死亡率仍未得到有效控制，其5年生存率不足20％，而且化疗后预后较差，且容易发生转移。
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，以下简称CTC)是指因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因。近年来，CTC在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注，随着技术手段的不断成熟，CTC在临床诊疗中的应用越来越广泛，CTC的检测可有效地应用于肿瘤的体外早期诊断，具有重要临床意义和广阔应用前景。
高通量测序(NGS)又称大规模平行测序，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标，是继Sanger测序之后的革命性进步。目前在临床肿瘤实践中，NGS主要应用于驱动基因测序，是肿瘤精准诊疗的重要环节。与Sanger测序技术不同，NGS技术通过反复测序同一区域的DNA片段，达到更高的灵敏度和准确度，同时通量高、自动化程度高，可在短时间内完成对上百亿碱基的测序，使得在几天内完成人类全基因组测序成为可能。也正因为NGS技术的高准确度、高速度以及低成本，对推动分子生物学的发展起到了重要作用，为肿瘤分子生物学的研究提供了新的手段，尤其在肿瘤分子诊断领域更是占有更重要的地位。
目前CTC的检测方法有很多，但鉴于CTC在循环外周血中的量非常稀少，纯度低，常规方法的检测不能提供肿瘤形成、分化、转移的本质。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测***。
本发明提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，具有这样的特征，包括：EGFR免疫磁球，用于捕获循环肿瘤细胞，其制备过程如下：步骤一，按二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵：胆固醇＝1:1的质量比，将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵和胆固醇进行混合，得到第一混合物；步骤二，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，得到第一溶液；步骤三，按第一溶液：第一混合物＝1：5～1：10的体积质量比，将第一溶液和第一混合物进行混合，得到第二溶液；步骤四，按二油酰磷脂酰胆碱溶液：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液：第二溶液＝1：1：5～1：1：12的体积比，将二油酰磷脂酰胆碱溶液、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液以及第二溶液进行混合，得到第三溶液；步骤五，将第三溶液进行室温超声后除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；步骤六，按照EGFR抗体：第四溶液＝1：16～1：20的质量体积比，将EGFR抗体和第四溶液进行混合，得到EGFR免疫磁球。
在本发明提供的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液中的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐的制备过程如下：按环氧十六季铵盐：羧甲基壳聚糖＝30:1的质量比，将环氧十六季铵盐和羧甲基壳聚糖共溶于dd H2O中，同时加入等体积的异丙醇，50℃～55℃搅拌过夜，然后用分子量为10000道尔顿的透析袋透析24h，再进行冻干，即得到羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐。
在本发明提供的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，染色剂，用于对EGFR免疫磁球所捕获的循环肿瘤细胞进行染色，包括第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂，其中，第一染色剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，第二染色剂为细胞角蛋白8、18、19标记的异硫氰酸荧光素，第三染色剂为白细胞共同抗原CD45标记的藻红蛋白。
在本发明提供的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中，还可以具有这样的特征，还包括：用于构建高通量测序文库的接头组以及引物组，其中，接头组包括第一接头和第二接头，第一接头的序列为
5’-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcactgcagtatctcgtatgccgtcttctgcttg-3’，第二接头的序列为
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’，引物组包括上游引物和下游引物，上游引物的序列为
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’，下游引物的序列为
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
在本发明提供的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中，还可以具有这样的特征：其中，高通量测序文库的大小为300～450bp。
在本发明提供的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中，还可以具有这样的特征，还包括：RNase-Free ddH2O以及2×Blood Direct PCR Master Mix。
本发明提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测***，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒以及高通量测序仪，其中，肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒为上述任意一项所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，因为具有EGFR免疫磁球，该EGFR免疫磁球通过首先将乳化剂二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与链接分子的骨架材料胆固醇与磁珠溶液混合，然后加入基质材料二油酰磷脂酰胆碱溶液以及表面活性剂羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液进行室温超声，最后加入EGFR抗体从而制备而成的，因此，该EGFR免疫磁球能够对血液中的循环肿瘤细胞(CTC)进行特异性靶向快速分离从而捕获CTC，进而方便后续对所捕获的CTC进行检测和分析，尤其是进行高通量测序分析，对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。
另外，由于在EGFR免疫磁球的制备过程中，EGFR抗体是最后添加进去的，避免了提前添加抗体后的后续步骤对抗体的活性产生不利的影响使其活力降低从而影响所制备的EGFR免疫磁球对肺癌循环肿瘤细胞的捕获效率的问题，因此，EGFR免疫磁球具有高活性、高纯度且能够强特异性、高灵敏度、最大程度上捕获受检者外周血中的CTC，尽可能减少CTC漏捕。此外，整个EGFR免疫磁球的制备过程在室温条件下即可完成，制备工艺简单，生产成本较低。
根据本发明所涉及的肺癌循环肿瘤细胞检测***，因为包括肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒以及高通量测序仪，通过肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒能够捕获血液中的CTC，然后对捕获的CTC构建高通量测序文库，然后通过高通量测序仪进行高通量测序，因此能够对血液中非常稀少的CTC进行精确、快速、通量高的基因序列分析，从而提供肿瘤形成、分化、转移的本质信息，对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。
附图说明
图1是本发明的实施例二中模拟实验的结果图；
图2是本发明的实施例三中的肺癌循环肿瘤细胞检测流程图；
图3是本发明的实施例三中的CTC免疫荧光鉴定结果图；
图4是本发明的实施例三中的CTC免疫荧光计数结果统计图；以及
图5是本发明的实施例中四中的肺癌循环肿瘤细胞检测流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测***作具体阐述。
<实施例一>
本实施例提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测***，用于捕获已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)，并对捕获的CTC进行鉴定及基因检测，包括：肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及高通量测序仪。
本实施例中的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒包括EGFR免疫磁球、染色剂、接头组、引物组、RNase-Free ddH2O以及2×Blood Direct PCR Master Mix。
本实施例的EGFR免疫磁球，用于捕获循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
步骤一，称取二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵(GHDC)、胆固醇各10mg，将GHDC和胆固醇进行混合，得到第一混合物，并将该第一混合物加入到磨口梨形瓶中。
步骤二，量取1.0mL去乙醇后的磁珠溶液溶解于2.0mL CH2Cl2中，得到第一溶液。
步骤三，将第一溶液倒入磨口梨形瓶中使得第一溶液和第一混合物混合，得到第二溶液。此时，第二溶液：混合物＝3：20的体积质量比。
步骤四，用移液管称取200μL 10mg/mL的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)溶液、200μL10mg/mL羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(HQCMC)溶液加入到第二溶液中，混匀，得到第三溶液。此时，DOPC溶液：HQCMC溶液：第二溶液＝1：1：7.5的体积比。
其中，HQCMC溶液的HQCMC的制备过程为：按环氧十六季铵盐：羧甲基壳聚糖＝30：1的质量比，将环氧十六季铵盐和羧甲基壳聚糖共溶于dd H2O中，同时加入与dd H2O等体积的异丙醇，50℃～55℃搅拌过夜，然后用分子量为10000道尔顿的透析袋透析24h，透析过程中每间隔两个小时换一次dd H2O，完成透析后再进行冻干，即得到HQCMC。HQCMC溶液为HQCMC的水溶液。
步骤五，将盛装第三溶液的梨形瓶放入超声波细胞粉碎仪中，启动仪器，超声参数为：功率27％，超声2s，间隔1s，总时间6min，温度25℃，在超声1min后暂停并快速加入6mLdd H2O，继续超声至结束，超声完成后旋蒸除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
步骤六，按照表皮生长因子受体(EGFR)抗体：第四溶液＝50μg：0.8mL～50μg：1mL的质量体积比，将EGFR抗体和第四溶液进行混合，涡旋振荡8小时使其充分混合，得到EGFR免疫磁球。在本实施例中，EGFR：第四溶液＝50μg：0.8mL的质量体积比。
本实施例的染色剂用在CTC鉴定和计数过程中对EGFR免疫磁球捕获的CTC进行染色，该染色剂包括第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂。其中，第一染色剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，第二染色剂为细胞角蛋白8、18、19标记的异硫氰酸荧光素(CK8-FITC、CK18-FITC以及CK19-FITC)，第三染色剂为白细胞共同抗原CD45标记的藻红蛋白(CD45-PE)。
接头组用于构建高通量测序文库，包括第一接头和第二接头。其中，第一接头的序列为
5’-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcactgcagtatctcgtatgccgtcttctgcttg-3’，第二接头的序列为
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’。在本实施例中，第一接头和第二接头按照等体积混合在一起。
引物组用于构建高通量测序文库，包括上游引物和下游引物。其中，上游引物的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’，下游引物的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
本实施例中高通量测序仪为用于对高通量测序文库进行高通量测序的仪器，它可以是现有技术中的任意一种高通量测序仪。
<实施例二>
本实施例为结合人肺癌细胞(H1975)对实施例一中的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒进行捕获效率模拟实验。
具体过程为：
步骤S1-1，将人肺癌细胞(H1975)在细胞培养液中培养一段时间，取一定量的细胞加入到EP管中并加入PBS，取10μL稀释液到计数板上，读出H1975细胞个数并计算细胞浓度(细胞浓度＝N*稀释倍数*1000)。
步骤S1-2，对计数后的H1975细胞进行分组(5组)，在每组中加入不同个数的H1975细胞，形成H1975细胞个数梯度分别为10、50、100、250以及500个，并在每组中加入一定量的PBS补足到7.5mL。
步骤S1-3，向5组H1975细胞中分别加入20μL EGFR免疫磁球，室温下孵育30min，每5min混匀一次。
步骤S1-4，孵育完成后，将EP管***磁分离架上吸附15min后弃掉上清液，加入第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂各20μL，混匀避光染色15min。
步骤S1-5，染色完成后，加1mLPBS洗涤磁分离10min后弃掉上清液，再加1mL双蒸水洗涤磁分离10min后弃掉清液；向EP管中加入20μL去离子水重悬细胞-磁球混合液，均匀涂于防脱载玻片上，待液滴自动晾干后在荧光显微镜下观察计数。
图1是本发明的实施例二中模拟实验的结果图。
如图1所示，本实施例中，5组实验组中的EGFR免疫磁球对的人肺癌细胞(H1975)的捕获率高达80％以上。
<实施例三>
本实施例提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测方法，即利用实施例一中的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒对肺癌患者的血液进行CTC分离，并对分离后的CTC进行鉴定和计数实验。
本实施例中的血液样本采集：用医用抗凝采血管采集医院癌症患者血液，抗凝剂为EDTA■K2。4℃保存，在存储、处理和运输过程中避免冷冻，48h内进行检测(样本采集单位有科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与患者签署知情同意书)。
图2是本发明的实施例三中的肺癌循环肿瘤细胞检测流程图。
如图2所示，本实施例中的肺癌循环肿瘤细胞检测方法的具体过程为：
步骤S2-1，制作外周血样本。即：将抗凝采血管中收集的肺癌肿瘤患者3.25mL全血2500rpm离心10min；取中上层液置于15mL EP管中后，加入与其等体积的PBS(pH＝7.4)充分混匀，得到外周血样本。
步骤S2-2，EGFR免疫磁球分离CTC。即，向外周血样本中加入EGFR免疫磁球20μL，室温孵育30min，每5min混匀一次；将EP管***磁分离架上吸附15min，吸弃上清液，取出EP管，得到吸附了CTC的EGFR免疫磁球，简称CTC-EGFR磁球。然后加入1mLPBS对CTC-EGFR磁球进行磁分离洗涤1次。
步骤S2-3，CTC免疫染色。即，向洗涤后的CTC-EGFR磁球中加入第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂各20μL，混匀避光染色15min。
步骤S2-4，CTC免疫荧光鉴定、计数。即，向染色后的混合液中加1mLPBS洗涤磁分离10min后弃掉上清液，再加1mL双蒸水洗涤磁分离10min后弃掉清液；向EP管中加入20μL去离子水重悬细胞-磁球混合液，均匀涂于防脱载玻片上，待液滴自动晾干后在荧光显微镜下观察、计数。结果如图2所示。
图3是本发明的实施例三中的CTC免疫荧光鉴定结果图。
如图3所示，在荧光显微镜的照射下，DAPI检测结果为阳性(细胞呈蓝光)，CK19-FITC检测结果为阳性(细胞呈绿光)，CD45-PE检测结果为阴性(视场黑暗，无法观测到细胞)，因此表明该细胞为肺癌细胞。并且，在荧光显微镜共检测到如图2所示的3个肺癌细胞。
此外，按照本实施例的上述方法对同一肺癌肿瘤患者的30份全血样本进行检测，结如图4所示。
图4是本发明的实施例三中的CTC免疫荧光计数结果统计图。
如图4所示，从图中可以看出，该肺癌肿瘤患者的外周血在这一测试体系中的肺癌细胞的数目约为三个，表明该检测方法比较可靠、稳定。
<实施例四>
本实施例提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测方法，即利用实施例一中的肺癌循环肿瘤细胞检测试***对肺癌患者的血液进行CTC分离，并对分离后的CTC进行高通量测序实验。
本实施例中的血液样本采集：用医用抗凝采血管采集医院癌症患者血液，抗凝剂为EDTA·K2。4℃保存，在存储、处理和运输过程中避免冷冻，48h内进行检测(样本采集单位有科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与患者签署知情同意书)。
图5是本发明的实施例四中的肺癌循环肿瘤细胞检测流程图。
如图5所示，本实施例中的肺癌循环肿瘤细胞检测方法的具体过程为：
步骤S3-1，制作外周血样本。即：将抗凝采血管中收集的肺癌肿瘤患者3.25mL全血2500rpm离心10min；取中上层液置于15mL EP管中后，加入与其等体积的PBS(pH＝7.4)充分混匀，得到外周血样本。
步骤S3-2，EGFR免疫磁球分离CTC。即，向外周血样本中加入EGFR免疫磁球20μL，室温孵育30min，每5min混匀一次；将EP管***磁分离架上吸附15min，吸弃上清液，取出EP管，得到吸附了CTC的EGFR免疫磁球，简称CTC-EGFR磁球。然后加入1mLPBS对CTC-EGFR磁球进行磁分离洗涤1次。
步骤S3-3，获取基因组DNA。即，通过Genomic DNA Purification Kit，Cat.No.:B0007，EZBioscience试剂盒，对CTC-EGFR磁球进行处理从而提取CTC中的DNA，具体按照EZBioscience试剂盒说明书步骤进行，所得DNA留在离心管中，冷藏保存。
步骤S3-4，构建高通量测序文库。即，
步骤(1)，将步骤S3-3得到的DNA使用covaris S220破碎至300bp左右，使用QiagenPCR试剂盒回收打碎产物，具体按照Qiagen试剂盒操作说明书进行。
打碎仪器参数设置：
Figure BDA0001960295720000131
将打碎的产物DNA回收，进行产物纯化。
步骤(2)，打碎产物DNA 30μL，10*Blunting Buffer 5μL，1mM的dNTP 10μL，QuickBlunting kit Enzyme Mix 1μL，ddH2O 9μL，总体积50μL，在30℃条件下孵育30min。用1.6倍体积的Ampure XP beads对补平产物进行纯化(DNA纯化试剂盒Zymo Genomic DNAClean&Concentrator货号：D4011)。
步骤(3)，末端修复。对步骤(2)的纯化产物进行加入dATP，反应体系及条件如下：取上述补平产物20μL，100mM dATP 1μL，10*NEB Buffer23μL，Klenow exo(NEB)(50000units/mL)0.5μL，ddH2O 5.5μL，总体积30μL；在37℃孵育30min，75℃20min热失活。
步骤(4)，加dATP产物，加接头。
具体条件如下：修复产物24μL，2*Quick Ligation Buffer 30μL，Quick T4DNALigase1.2μL，8μM接头组5μL，总体积60μL，室温下连接30min。用1.6倍体积的AmpureXPbeads对连接产物进行纯化。
步骤(5)，将纯化后的连接产物迸行Qubit定量，按照测序数据量将不同样品的连接产物进行等量混合。
步骤(6)，配制1％的琼脂糖凝胶电泳，将混合的连接产物进行切胶选择片段大小，采用Qiagen公司的胶回收试剂盒进行回收；对回收产物进行Qubit定量，用于下一步PCR扩增。
PCR扩增：
将上述回收的产物，精准定量10ng用于PCR反应，得到的PCR产物，即为所构建的高通量测序文库。反应体系和条件如下：DNA样品3μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×PhusionPCR Master Mix 25μL，H2O 20μL，总共50μL，应条件为：95℃1min；然后设置94℃10s，60℃30s，72℃10s共12个循环；最后72℃延伸5min。
将PCR产物等体积AWP ure XP Beads纯化两次；纯化过程严格按照使用说明书进行；取出1μL进行2100检测，结果表明，得到的高通量测序文库的大小一般为200～350bp。
步骤S3-5，使用高通量测序仪进行测序。
<实施例五>
本实施例提供了一种肺癌循环肿瘤细胞检测方法，即利用实施例一中的肺癌循环肿瘤细胞检测***对肺癌患者的血液进行CTC分离，并对分离后的CTC进行鉴定、计数以及高通量测序实验。
本实施例中的血液样本采集：用医用抗凝采血管采集医院癌症患者血液，抗凝剂为EDTA·K2。4℃保存，在存储、处理和运输过程中避免冷冻，48h内进行检测(样本采集单位有科研合作项目，经医院伦理委员会同意，并与患者签署知情同意书)。
本实施例中的肺癌循环肿瘤细胞检测方法的具体过程为：
步骤S4-1，制作外周血样本。即：将抗凝采血管中收集的肺癌肿瘤患者7mL全血2500rpm离心10min；取中上层液置于15mL EP管中后，加入与其等体积的PBS(pH＝7.4)充分混匀，得到外周血样本。
步骤S4-2，将外周血样本平均分成两份，一份按照实施例三中的步骤进行CTC分离和鉴定，另一份按照实施例四中的步骤进行CTC分离和高通量测序。
实施例的作用与效果
根据实施例一所涉及的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，因为具有EGFR免疫磁球，该EGFR免疫磁球通过首先将乳化剂二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与链接分子的骨架材料胆固醇与磁珠溶液混合，然后加入基质材料二油酰磷脂酰胆碱溶液以及表面活性剂羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液进行室温超声，最后加入EGFR抗体从而制备而成的，因此，该EGFR免疫磁球能够对血液中的循环肿瘤细胞(CTC)进行特异性靶向快速分离从而捕获CTC，进而方便后续对所捕获的CTC进行检测和分析，尤其是进行高通量测序分析，对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。
另外，由于在EGFR免疫磁球的制备过程中，EGFR抗体是最后添加进去的，避免了提前添加抗体后的后续步骤对抗体的活性产生不利的影响使其活力降低从而影响所制备的EGFR免疫磁球对肺癌循环肿瘤细胞的捕获效率的问题，因此，在模拟体系中，本实施例中的EGFR免疫磁球对肺癌循环肿瘤细胞的捕获效率能高达80％以上。此外，整个EGFR免疫磁球的制备过程在室温条件下即可完成，制备工艺简单，生产成本较低。
进一步地，因为实施例一中的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐)是通过本实施例中的制备方法制得的，所以，本实施例的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐)有高纯度、高活性，是制备优质高效的EGFR免疫磁球最佳选择。
进一步地，实施例一中的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒还包括第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂，第一染色剂为DAPI，第二染色剂包括CK8-FITC、CK18-FITC以及CK19-FITC，第三染色剂为CD45-PE，因此通过这三种染色剂能够对被捕获的CTC进行染色，染色效果好且长时间不褪色、有利于后续通过荧光显微镜对被捕获的CTC进行鉴定和计数。并且，由于第二染色剂包括CK8-FITC、CK18-FITC以及CK19-FITC这三种细胞角蛋白的异硫氰酸荧光素标记，因此能够更大限度地保证CTC被特异性地染色，进而使得CTC的鉴定和计数结果更加准确。
根据本实施例一所涉及的肺癌循环肿瘤细胞检测***，因为包括肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒以及高通量测序仪，通过肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒能够捕获血液中的CTC，然后对捕获的CTC构建高通量测序文库，然后通过高通量测序仪进行高通量测序，因此能够对血液中非常稀少的CTC进行精确、快速、通量高的基因序列分析，从而提供肿瘤形成、分化、转移的本质信息，对肿瘤诊断、预后判断、转移、个体化治疗提供更多的信息。
综上，通过本实施例所涉及的肺癌循环肿瘤细胞检测***能够从细胞层面上以及基因层面上快速准确检测受检者血液中的循环肿瘤细胞。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：
EGFR免疫磁球，用于捕获所述循环肿瘤细胞，其制备过程如下：
步骤一，按二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵：胆固醇＝1:1的质量比，将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵和胆固醇进行混合，得到第一混合物；
步骤二，按去乙醇后的磁珠溶液：CH2Cl2＝1：1～1：5的体积比，将去乙醇后的磁珠溶液溶解于CH2Cl2，得到第一溶液；
步骤三，按所述第一溶液：所述第一混合物＝1：5～1：10的体积质量比，将所述第一溶液和所述第一混合物进行混合，得到第二溶液；
步骤四，按二油酰磷脂酰胆碱溶液：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液：所述第二溶液＝1：1：5～1：1：12的体积比，将二油酰磷脂酰胆碱溶液、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液以及所述第二溶液进行混合，得到第三溶液；
步骤五，将所述第三溶液进行室温超声后除去残留的CH2Cl2，得到第四溶液；
步骤六，按照EGFR抗体：所述第四溶液＝1：16～1：20的质量体积比，将EGFR抗体和所述第四溶液进行混合，得到所述EGFR免疫磁球。
2.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液中的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐的制备过程如下：
按环氧十六季铵盐：羧甲基壳聚糖＝30:1的质量比，将环氧十六季铵盐和羧甲基壳聚糖共溶于dd H2O中，同时加入等体积的异丙醇，50℃～55℃搅拌过夜，然后用分子量为10000道尔顿的透析袋透析24h，再进行冻干，即得到所述羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐。
3.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，还包括：
染色剂，用于对所述EGFR免疫磁球所捕获的所述循环肿瘤细胞进行染色，包括第一染色剂、第二染色剂以及第三染色剂，
其中，所述第一染色剂为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，
所述第二染色剂为细胞角蛋白8、18、19标记的异硫氰酸荧光素，
所述第三染色剂为白细胞共同抗原CD45标记的藻红蛋白。
4.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于还包括：
用于构建高通量测序文库的接头组以及引物组，
其中，所述接头组包括第一接头和第二接头，
所述第一接头的序列为5’-gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcactgcagtatctcgtatgccgtcttctgcttg-3’，
所述第二接头的序列为5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’，
所述引物组包括上游引物和下游引物，
所述上游引物的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’，
所述下游引物的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
5.根据权利要求4所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述高通量测序文库的大小为300～450bp。
6.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，还包括：
RNase-Free ddH2O以及2×Blood Direct PCR Master Mix。
7.一种肺癌循环肿瘤细胞检测***，用于检测已经脱离肺癌实体瘤进入外周血中的循环肿瘤细胞，其特征在于，包括：
肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒以及高通量测序仪，
其中，所述肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒为权利要求1～6中任意一项所述的肺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789302A (zh) * 2021-09-15 2021-12-14 南昌大学第二附属医院 用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒
CN114276992A (zh) * 2021-12-14 2022-04-05 南通举健生物科技有限公司 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102234658A (zh) * 2010-04-23 2011-11-09 上海市肿瘤研究所 靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用
CN105785005A (zh) * 2016-04-13 2016-07-20 杭州华得森生物技术有限公司 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及其应用
CN106635995A (zh) * 2017-03-10 2017-05-10 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法
CN108031442A (zh) * 2017-12-29 2018-05-15 猎源（上海）生物医药科技有限公司 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102234658A (zh) * 2010-04-23 2011-11-09 上海市肿瘤研究所 靶向性季铵盐类阳离子高分子脂质基因载体、制备方法及应用
CN105785005A (zh) * 2016-04-13 2016-07-20 杭州华得森生物技术有限公司 一种循环肿瘤细胞的检测试剂盒及其应用
CN106635995A (zh) * 2017-03-10 2017-05-10 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种循环肿瘤细胞阴性富集方法
CN108031442A (zh) * 2017-12-29 2018-05-15 猎源（上海）生物医药科技有限公司 一种纳米脂质磁球及其制备方法、分离提取游离dna的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱立平，陈学清: "《免疫学常用实验方法》", 31 March 2000 *
梁晓飞,王汉杰,田惠,罗浩,常津: "新型载药壳聚糖季铵盐的合成、结构与性能", 《物理化学学报》 *
石远凯等: "《临床路径释义 上 肿瘤疾病分册 2018版》", 31 August 2018, 中国协和医科大学出版社 *
闫国超等: "《肿瘤疾病临床检验与诊断》", 30 April 2017, 科学技术文献出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789302A (zh) * 2021-09-15 2021-12-14 南昌大学第二附属医院 用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒
CN114276992A (zh) * 2021-12-14 2022-04-05 南通举健生物科技有限公司 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法

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