CN111172263A - 一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法，属于临床检验学和生物技术领域。一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，用DNA片段化因子酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。本发明得到的含有不同染色体非整倍体cfDNA片段与含正常染色体数目cfDNA片段混合制作的无创产前检测参考物质，提供了一种可用于制造室内质量控制和室间质量评价的参考物质的方法。这种利用不同酶消化产生的含不同染色体非整倍体cfDNA片段与含正常染色体数目cfDNA混合制作参考物质的方法在国内外尚属首例。这种方法也能用于制作一系列的用于其他无创检测的混合cfDNA样本参考物质。

Description

一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法
技术领域
本发明公开了一种应用于无创产前检测的参考物质及其制备方法，属于临床检验学和生物技术领域。
背景技术
胎儿染色体非整倍体主要是由染色体数目或结构异常所引起的疾病，临床上主要以21-三体(唐氏综合症)、18-三体(爱德华氏综合征)、13-三体(帕陶氏综合征)最常见和最易出现，患儿通常表现为智力障碍、发育迟缓或成年后生育障碍等，该类疾病的发病率随着孕妇年龄的增高而增高，且目前尚无有效的治疗方法。因此广泛开展染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对于降低出生缺陷、实现优生优育和提高人口质量具有重要意义。
现有的产前诊断技术包括侵入性检测方法和无创检测方法，前者如羊膜穿刺或绒毛膜取样获取胎儿组织，进行染色体核型分析，但缺点是均为有创性，具有引起流产等风险；国内外广泛采用的传统无创检测方法包括孕妇血清生化标志物筛查和超声检查，但该类手段准确率较低，检测结果的假阳性率和假阴性率都较高，同时大量的假阳性给孕妇及其家庭也带来巨大焦虑，可能引起后代神经发育和精神异常。
1997年，卢煜明教授发现在孕妇血浆中含有胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)，这为无创产前检测领域开启了新的时代。目前临床上已广泛采用基于游离DNA的胎儿染色体非整倍体无创产前筛查(non-invasive prenatal testing，NIPT)。目前最常用的检测方法是高通量测序(next-generation sequencing，NGS)，具体是通过提取孕妇外周血血浆中的游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)，分析NGS产生的大量测序数据，计算单条染色体测序reads数在全部染色体总reads数的占比，然后将该比值与参考数据库中正常孕妇血浆的相应比值比较，采用相关的统计学方法判断该胎儿是否存在非整倍体异常。与传统检测手段相比，这种针对母血中微量胎儿游离DNA的检测方法更加安全、简便和稳定，且准确率和灵敏度均显著提高。
尽管游离DNA进行无创产前检测准确率高，有很好的应用前景，但是目前在方法建立和实验室检测上，仍面临较大挑战。首先，进行无创产前检测，必须能够在母亲遗传信息干扰的情况下，实现对极少量胎儿游离DNA的准确分析。在进行胎儿遗传异常的检测时，大多是微小差异的比较，对检测的准确性和重复性有很高的要求。第二，无创产前检测的流程复杂，多个环节均会对结果造成影响，包括游离DNA的提取效率、影响测序准确性的因素如文库的质量、测序的覆盖深度和均一性、GC偏倚的校正、生物信息学算法等。第三，目前模拟母亲样本是通过超声随机打断DNA的方法所制备，这种模拟cfDNA样本具有随机性，片段含有的序列信息、片段长度和分布均与真实样本不符；而通过最常用的MNase酶切所得模拟cfDNA样本则片段长度为146bp左右，相对真实血浆样本中母亲cfDNA组分长度(主峰分布在166bp)较短，故MNase无法制备模拟母亲cfDNA组分样本。
因此，目前广泛开展的无创产前检测亟需标准化，而与真实临床样本一致的参考物质是实现标准化、进行方法学验证、室内质量控制和室间质量评价最重要的前提条件。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分。
本发明要解决的第三个技术问题是提供无创产前检测参考物质的制备方法。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种能应用于无创产前检测的参考物质。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，用DNA片段化因子(DNAfragmentation factor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。该模拟母亲cfDNA组分可用于模拟临床上孕妇血浆中的母亲cfDNA组分。
DFF片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)是细胞凋亡过程中参与DNA片段化的关键核酸酶。DFF本身不具有核酸酶切活性，但它能在细胞凋亡蛋白酶(如细胞凋亡蛋白酶-3)的作用下生成大小分别为40千道尔顿和45千道尔顿的两个亚基，其中40千道尔顿的亚基，即DFF片段化因子40(DNA fragmentation factor 40，DFF40)具有内源性核酸酶切活性，能特异性切割核小体间的连接区，最终产生以单个核小体长度为主的DNA片段。
通过构建DFF原核表达质粒，转化感受态细胞，表达出完整的DFF并纯化，纯化后的DFF在合适的反应条件下被细胞凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)作用产生DFF40，同时DFF40可酶切相应的染色质底物，实现在体外模拟细胞凋亡末期DNA片段化的过程。上述有关重组DFF表达质粒的构建、DFF的表达及纯化的具体方法均为现有技术，参见美国专利US6165737，DNA片段化因子参与细胞凋亡(US Patent Number 6165737，DNA FRAGMENTATION FACTORINVOLVED IN APOPTOSIS)。
所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系。
所述人细胞系为永生化细胞系。例如人B淋巴细胞。
所述酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核的方法是：
(1)取模拟母亲样本细胞系的细胞核约1×107个，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g 4℃离心5min，弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核，得到细胞核溶液；
缓冲液A的组分为20mM Hepes-KOH(pH 7.5)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA钠，1mM EGTA钠，1mM DTT，0.1mM PMSF；
(2)配制消化反应体系，于37℃孵育2小时；
消化反应体系为：浓度为0.585mg/ml的DFF溶液30μL，浓度为95ng/μL的人caspase-3 45μL，缓冲液A 28μL，步骤(1)得到的细胞核溶液10μL；
(3)加入25ul反应终止液终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1h；终止液的组成为0.6％SDS，50mM EDTA，6mg/ml蛋白酶K；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布。
另一方面，本发明提供一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分。
采用上述方法制备得到的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分。模拟母亲cfDNA的长度为160bp左右，与临床孕妇血浆中的母亲cfDNA的长度160-170bp接近。本专利中模拟母亲cfDNA组分的制备提供了一种通用的制备模拟正常健康人血浆cfDNA样本的方法，同时该模拟母亲cfDNA组分不仅应用于制备无创产前胎儿染色体非整倍体检测参考物质，还可以应用在其他基于cfDNA无创检测领域，例如制备单基因遗传病检测cfDNA参考物质。
另一方面，本发明提供一种无创产前检测的参考物质的制备方法，用微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease，MNase)酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核，得到模拟胎儿cfDNA组分(作为模拟临床上孕妇血浆中的胎儿cfDNA组分)；用DNA片段化因子(DNAfragmentation factor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA组分；将模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分按质量比为1∶99～30∶70混合，得到模拟混合cfDNA组分；将模拟混合cfDNA组分加入到人造血浆中，制成模拟混合cfDNA浓度为1-100ng/ml的参考物质。
所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系，所述模拟胎儿样本细胞系为染色体非整倍体阳性人细胞系或正常染色体数目的人细胞系。
所述人细胞系为永生化细胞系。
所述人造血浆是含有浓度为5％的人血浆白蛋白的模拟体液。
所述用微球菌核酸酶酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核的方法如下，
(1)取模拟胎儿样本细胞系的细胞核1×107个，用2-3ml MNase反应缓冲液洗涤细胞核，重复洗涤3次，120g 4℃离心10min，弃去上清后，用100μl MNase反应缓冲液重悬细胞核，得到细胞核悬液；
MNase反应缓冲液成分为1×Micrococcal Nuclease反应缓冲液，9％(v/v)2-ME，1片/10ml蛋白酶抑制剂，100μg/ml BSA；
(2)在上述细胞核悬液中加入300U MNase于37℃水浴孵育10min；
(3)向反应管中加入20μl MNase终止液，室温静置5min；MNase终止液成分为250mmol/L EDTA，250mmol/L EGTA；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布；
所述酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核的方法如下，
(1)取模拟母亲样本细胞系的细胞核约1×107个，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g 4℃离心5min，弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核，得到细胞核溶液；
缓冲液A的组分为20mM Hepes-KOH(pH 7.5)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA钠，1mM EGTA钠，1mM DTT，0.1mM PMSF；
(2)配制消化反应体系，于37℃孵育2小时；
消化反应体系为：浓度为0.585mg/ml的DFF溶液30μL，浓度为95ng/μL的人caspase-3 45μL，缓冲液A 28μL，步骤(1)得到的细胞核溶液10μL；
(3)加入25ul反应终止液终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1h；终止液的组成为0.6％SDS，50mM EDTA，6mg/ml蛋白酶K；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布。
另一方面，本发明提供一种应用于无创产前检测的参考物质。
以上述任意一种方法制备的一种应用于无创产前检测的参考物质，所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目人细胞系GM12878、正常染色体数目人细胞系GM23087、正常染色体数目人细胞系AG09387中的一种或多种；所述模拟胎儿样本细胞系为21-三体阳性人细胞系AG09394、18-三体阳性人细胞系GM02732、13-三体阳性人细胞系GM02948、正常染色体数目人细胞系GM23086中的一种或多种。
本发明中的细胞系包括但不限于上述细胞系。其中GM12878是标准细胞系，即DNA序列已经明确测定过的细胞系，GM23087、GM23086、AG09387均为经核型鉴定的细胞系。AG09394、GM02732、GM02948均为经核型鉴定的细胞系。
更具体的，本发明提供一种应用于无创产前检测的参考物质，由3个阳性混合样本和1个正常对照样本组成；每个阳性混合样本和正常对照样本均由模拟母亲cfDNA组分、模拟胎儿cfDNA组分和人造血浆组成，其中模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分的质量百分比为1∶99～30∶70，人造血浆是含有浓度为5％的人血浆白蛋白的模拟体液，模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分之和在人造血浆中的浓度为1-100ng/ml；
3个阳性混合样本分别是21-三体阳性混合样本、18-三体阳性混合样本和13-三体阳性混合样本；21-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系AG09387的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的21-三体阳性人细胞系AG09394的cfDNA；18-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM12878的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的18-三体阳性人细胞系GM02732的cfDNA；13-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM12878的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的13-三体阳性人细胞系GM02948的cfDNA；
正常对照样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM23087的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM23086的cfDNA。
本发明选取正常染色体数目人细胞系GM12878、或正常染色体数目人细胞系GM23087、或正常染色体数目人细胞系GM23086、或正常染色体数目人细胞系AG09387，以及21-三体阳性人细胞系AG09394、或18-三体阳性人细胞系GM02732、或13-三体阳性人细胞系GM02948，将细胞培养达到一定数量，提取细胞核；利用MNase酶对不同染色体非整倍体阳性细胞系或正常染色体数目人细胞系GM23086来源的细胞核进行消化产生相应的cfDNA片段，同时利用DFF对正常染色体数目人细胞系GM12878或GM23087或AG09387来源的细胞核进行消化产生相应的cfDNA片段，回收得到相应的DNA片段后，将每种染色体非整倍体阳性细胞系来源的cfDNA片段与相应的正常染色体数目人细胞系来源的cfDNA片段按一定比例混合，将人血浆白蛋白以5％浓度与模拟体液混合制备人造血浆(人血浆白蛋白占人造血浆的浓度(w/v)，单位为g/100ml)，再将上述混合cfDNA片段与模拟血浆按一定浓度混合得到混合cfDNA血浆样本，建立含有3个染色体非整倍体阳性混合样本和1个由正常染色体数目人细胞系来源的cfDNA片段组成的正常对照样本的NIPT参考物质样品盘。
这种通过MNase消化产生的含有染色体非整倍体cfDNA片段与DFF消化产生的含有正常染色体数目cfDNA片段混合制备的参考物质cfDNA质量高，稳定性好，能够人为控制和选择所需的不同染色体非整倍体类型，不同酶消化产生的cfDNA片段符合真实孕妇血浆中的母子来源cfDNA的各项生化特征，同时通过选择细胞系来源可以制备母子配对样本，克服了传统NIPT参考物质的不足。通过利用含有染色体非整倍体cfDNA片段与含有正常染色体数目cfDNA混合制作的参考物质操作简便，合成周期短，能够大批量生产。本研究制作的参考物质能够作为应用于无创产前检测的参考物质，能广泛应用于方法学验证、室内质量控制和室间质量评价，并且具用较好的重复性和一致性，有利于实现无创产前检测的标准化。
本发明的创新点在于：
1.本发明首次发现并证实了使用DFF酶切模拟母亲样本细胞的细胞核，能够得到模拟真实临床中孕妇血浆样本的母亲来源cfDNA的参考物质，因此彻底解决了现有技术中用其他物质酶切无法得到符合要求的可检测cfDNA参考物质的问题，使大规模制备人工模拟血浆cfDNA标准化检测参考物质成为现实。
2.本发明得到的混合cfDNA血浆样本参考物质可以模拟临床真实标本。通过MNase消化细胞核产生与孕妇血浆中胎儿cfDNA相似的cfDNA片段，通过DFF消化细胞核产生与孕妇血浆中母亲cfDNA相似的cfDNA片段，上述二者按一定比例混合后即可得到与孕妇血浆cfDNA相似的混合cfDNA片段，因此，我们将混合cfDNA片段与制备的人造血浆混合即可得到模拟真实孕妇血浆的参考物质，可以用于一系列方法学验证、室内质量控制和室间质量评价。我们的研究中得到的含有染色体非整倍体cfDNA片段与含有正常染色体数目cfDNA片段混合制作的参考物质提供了一种可应用于无创产前检测的参考物质的方法。这种利用不同酶消化产生的含有染色体非整倍体cfDNA片段与含有正常染色体数目cfDNA片段混合制作参考物质的方法尚属首例。这种方法也能用于制作一系列的用于其他无创检测的混合cfDNA样本参考物质。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属于本发明保护范围。
附图说明
图1为是实施例2中制备得到的DFF电泳结果。
图2A为MNase酶(微球菌核酸酶，Micrococcal nuclease，MNase)消化细胞核所得cfDNA片段的Agilent 2100电泳峰图。
图2B为DFF(DNA片段化因子，DNA fragmentation factor，DFF)消化细胞核所得cfDNA片段的Agilent 2100电泳峰图。
图2C为MNase酶和DFF消化产物混合cfDNA片段的Agilent 2100电泳峰图。
图2D为真实孕妇血浆cfDNA片段的Agilent 2100电泳峰图。
具体实施方式
正常染色体数目人细胞系GM12878、正常染色体数目人细胞系GM23087、正常染色体数目人细胞系GM23086、正常染色体数目人细胞系AG09387、21-三体阳性人细胞系AG09394、18-三体阳性人细胞系GM02732、13-三体阳性人细胞系GM02948，购于CoriellCell Repositories，美国
Nonidet P-40裂解液，Sigma-Aldrich，美国
人caspase-3蛋白，北京义翘神州科技有限公司，中国
Micrococcal Nuclease(下称MNase)，New England Biolabs，美国
10×Micrococcal Nuclease反应缓冲液(Micrococcal Nuclease ReactionBuffer)，New England Biolabs，美国
小牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)，New England Biolabs，美国
DNA片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)，重组DFF表达质粒pET-15b-DFF由北京生命科学研究所王晓东教授惠赠，按实施例2所列文献方法表达和纯化。
β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，2-ME)，Sigma-Aldrich，美国
乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，Sigma-Aldrich，美国
乙二醇二***二胺四乙酸(glycol-bis-(2-aminoethylether)-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA)，Sigma-Aldrich，美国
蛋白酶抑制剂混合片，Roche，瑞士
蛋白酶K(proteinase K)，Life Technologies，美国
十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，国药集团化学试剂有限公司，中国
大肠杆菌感受态细胞BL21(pLysS)，天根生化科技(北京)有限公司，中国
人血浆白蛋白，Sigma-Aldrich，美国
模拟体液，中科迈晨(北京)科技有限公司，中国
大肠杆菌感受态细胞BL21(pLysS)，根生化科技(北京)有限公司，中国
MagMAXTM游离DNA提取试剂盒，Thermo Fisher Scientific，美国
实施例1：培养细胞系，提取细胞核
一、方法
1.细胞培养：
正常染色体数目人细胞系GM12878、GM23087、GM23086、AG09387分别培养，用含15％胎牛血清RPIM-1640培养液培养，培养基中含有15％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％CO2的恒温细胞培养箱中悬浮培养，细胞传代无需蛋白酶消化，将细胞扩大培养至107-108并处于对数生长期。21-三体阳性人细胞系AG09394，用含15％胎牛血清RPIM-1640培养液培养，培养基中含有15％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％C02的恒温细胞培养箱中悬浮培养，细胞传代无需蛋白酶消化，将细胞扩大培养至107-108并处于对数生长期。18-三体阳性人细胞系GM02732、13-三体阳性人细胞系GM02948，用含15％胎牛血清EMEM培养液培养，培养基中含有15％胎牛血清，100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素；在37℃含5％C02的恒温细胞培养箱中贴壁培养，细胞传代需0.05％胰蛋白酶消化，将细胞扩大培养至107-108并处于对数生长期。
2.细胞核提取：
对于每种悬浮培养的细胞(GM12878、GM23087、GM23086、AG09387、AG09394)，分别收集细胞于一只15ml离心管中培养瓶，1600rpm离心6min，吸去培养液，加入10ml预冷的1×PBS洗涤，充分混匀后吸取10μl镜下计数，吸取约1×107个细胞于4℃300g离心10min；吸去上清后，将细胞沉淀重悬于5ml预冷的NP-40裂解液中，冰上静置5min后，120g 4℃离心10min，小心吸去上清，得到细胞核，分装后于-80℃保存。
对于贴壁培养的细胞(GM02732、GM02948)，先吸取约500μl 0.05％胰蛋白酶加入培养瓶中消化至镜下细胞变圆，分别收集培养瓶中的细胞于一只15ml离心管中，1600rpm离心6min，吸去培养液，加入10ml预冷的1×PBS洗涤，充分混匀后吸取10μl镜下计数，吸取约1×107个细胞于4℃ 300g离心10min；吸去上清后，将细胞沉淀重悬于5ml预冷的NP-40裂解液中，冰上静置5min后，120g4℃离心10min，小心吸去上清，得到细胞核，分装后于-80℃保存。
二.结果
结果得到不同细胞系来源的细胞核，收集并保存于-80℃中，以备下一步经不同核酸酶消化制备cfDNA片段。
实施例2：不同酶消化细胞核产生相应的cfDNA片段
一.方法
1.MNase消化细胞核产生模拟胎儿样本细胞系的cfDNA片段：
利用MNase分别针对提取的21-三体阳性人细胞系AG09394、18-三体阳性人细胞系GM02732、13-三体阳性人细胞系GM02948和正常染色体数目人细胞系GM23086的细胞核进行消化，得到相应的模拟孕妇血浆中胎儿cfDNA片段。具体步骤如下：
(1)取1管提取好的细胞核(约1×107个)，用2-3ml MNase反应缓冲液(1×Micrococcal Nuclease反应缓冲液，9％(v/v)2-ME，1片/10ml蛋白酶抑制剂，100μg/mlBSA)洗涤细胞核，重复洗涤3次，120g 4℃离心10min，小心弃去上清后，用100μl MNase反应缓冲液重悬细胞核，得到细胞核悬液；
(2)在上述细胞核悬液中加入300U MNase于37℃水浴孵育10min；
(3)孵育相应时间后反应管中加入20μl MNase终止液(250mmol/L EDTA，250mmol/L EGTA)，室温静置5min；
(4)采用Qubit 3.0测定反应产物中DNA浓度，通过Agilent 2100电泳观察核酸片段大小分布。
2.DFF消化细胞核产生模拟母亲样本细胞系的cfDNA片段：
利用DFF分别针对提取的正常染色体数目人细胞系GM12878、正常染色体数目人细胞系GM23087和正常染色体数目人细胞系AG09387的细胞核进行消化，得到相应的模拟孕妇血浆中母亲cfDNA片段。
(1)DFF蛋白表达及纯化：
利用重组DFF表达质粒pET-15b-DFF(按照美国专利US6165737或下述文献方法制备)转化大肠杆菌感受态细胞BL21(pLysS)，挑取单个阳性菌落于LB培养液，37℃摇动过夜培养；取5ml菌液加入300ml新鲜LB培养基于37℃ 220rpm培养4小时，然后加入IPTG继续摇动培养4小时。将所得培养液离心后去上清，菌体经含有10％甘油的缓冲液A(20mM Hepes-KOH，pH 7.5，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA钠，1mM EGTA钠，1mM DTT，0.1mM PMSF)重悬，超声破碎后以10,000g离心30min，离心后上清经镍离子柱亲和层析纯化，由含有250Mm咪唑的缓冲液A洗脱得到纯化后的DFF，将纯化后的DFF进行蛋白定量和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，分装后于-80℃保存；
DFF的表达和纯化参照以下文献方法，为现有技术。
(1)Widlak P，Li P，Wang X，Garrard WT.Cleavage preferences of theapoptotic endonuclease DFF40(caspase-activated DNase or nuclease)on naked DNAand chromatin substrates.J Biol Chem 2000；275：8226-32.Widlak P，Li P，Wang X，Garrard WT.凋亡相关内源性核酸酶DNA片段化因子40(经凋亡蛋白酶激活的DNA酶或核酸酶)酶切消化裸DNA和染色质底物的位点偏好性研究.生物化学期刊，2000；275；8226-32.
(2)Liu X，Li P，Widlak P，Zou H，Luo X，Garrard WT，Wang X.The 40-kDasubunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatincondensation during apoptosis.Proc Natl Acad Sci U S A 1998；95：8461-6.Liu X，Li P，Widlak P，Zou H，Luo X，Garrard WT，Wang X.DNA片段化因子中的40千道尔顿亚基在细胞凋亡进程中诱导DNA片段化和染色质固缩.美国国家科学院学报，1998；95：8461-6.
(2)DFF消化细胞核：获得纯化后的DFF后，配制反应体系，对相应的细胞核进行消化，具体步骤如下：
①取1管提取好的细胞核(约1×107个)，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g 4℃离心5min，小心弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核；
②取1只10μg规格的人caspase-3蛋白干粉，加入105μl去离子水溶解，根据DFF蛋白浓度定量结果(0.585mg/ml)，配制消化反应体系(表1)，于37℃反应2小时；
表1：DFF消化细胞核反应体系
Figure BDA0001861548740000121
③37℃水浴孵育相应时间后在反应管中加入25ul反应终止液(0.6％SDS，50mMEDTA，and 6mg/ml蛋白酶K)终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1小时。
④采用Qubit 3.0测定反应产物中DNA浓度，通过Agilent 2100电泳观察核酸片段大小分布。
二.结果
本实施例中，表达纯化后的DFF经蛋白定量后浓度为0.585mg/ml，SDS-PAGE结果如图1所示(其中泳道1为纯化后的DFF电泳结果，泳道2为未纯化的DFF电泳结果)；
经检测所得胎儿cfDNA片段浓度分别为：AG09394(38ng/μl)，GM02732(28ng/μl)，GM02948(23ng/μl)，GM23086(26ng/μl)；母亲cfDNA片段浓度分别为：AG09387(32ng/μl)，GM12878(33ng/μl)，GM23087(50ng/μl)。
实施例3：制备应用于无创产前检测的参考物质
一.方法
1.制备人造血浆：称取一定量人血浆白蛋白干粉，按5％浓度加入相应体积的模拟体液中，充分溶解后于4℃保存；
2.制备应用于无创产前检测的参考物质：
将实施例2得到的MNase消化产生的含有染色体非整倍体或正常染色体数目的cfDNA片段作为胎儿cfDNA成分，分别与相应作为母亲cfDNA成分的DFF消化产生的含有正常染色体数目的cfDNA片段按一定胎儿cfDNA比例混合，再将混合cfDNA片段以一定浓度加入人造血浆中，建立NIPT参考物质样品盘，每套共含3个染色体非整倍体阳性混合样本和1个由正常染色体数目人细胞系来源的cfDNA片段组成的正常对照样本；
1号、2号和3号样本中细胞系并非随机搭配。其中1号为胎儿21三体阳性样本，两种细胞系为真实母子配对细胞系；2号为胎儿18三体阳性样本，3号为胎儿13三体阳性样本，2号和3号的母亲细胞系都是GM12878，而GM12878与这两种胎儿三体阳性细胞系并无关系，这里只是将GM12878人为视作该18或13三体阳性细胞系的母亲细胞系安排配对。
4号样本是正常三体阴性母子配对样本，作为阴性对照，这两种细胞系(GM23087和GM23086)为真实母子配对细胞系，且染色体数目正常。因此4号样本是特定组合作为阴性对照。
总共有4个样本的原因：1、2和3号分别为21、18和13三体阳性样本，对应为临床上最常见的三种染色体非整倍体情况，4号作为正常阴性对照。
3.根据测得的各cfDNA片段浓度，计算使得各混合cfDNA血浆样本中胎儿cfDNA比例为8％(w/w)，混合cfDNA片段总浓度为25ng/ml。
根据实施例2中所测得的各cfDNA片段浓度，取相应体积的母亲cfDNA片段和胎儿cfDNA片段组成母子cfDNA混合样本，该cfDNA混合样本满足胎儿cfDNA所占比例为8％，且总cfDNA的量为25ng，然后将配制好的各母子cfDNA混合样本分别加入1ml人造血浆中，制备成相应的浓度为25ng/ml的混合cfDNA血浆样本。
表2：应用于无创产前检测的参考物质样品盘组成
Figure BDA0001861548740000141
4.提取真实孕妇血浆中cfDNA及毛细管电泳：
临床采集孕妇血液样本，在4℃下先以1600g离心10min，再以16000g离心10min，两步离心后吸取上清即得到血浆样本。按照MagMAXTM游离DNA提取试剂盒进行cfDNA的提取，具体步骤如下：
(1)取600μl血浆样本，分别依此加入12μl蛋白酶K(20mg/ml)、30μl20％SDS，充分混匀后在60℃水浴20min，水浴结束后将样本管置于冰上5min平衡至室温；
(2)准备磁珠结合试剂混合物：吸取10μl磁珠加入750μl磁珠结合液充分混匀，将磁珠结合液混合物加入每支样本管中，上下颠倒混匀，涡旋振荡10min；
(3)将样本管置于磁力架上5min，直至液体恢复澄清，小心吸去上清，轻轻拍打几次样本管，吸去管底残留液体；
(4)将磁珠重悬于1ml MagMAXTM cfDNA冲洗液中，将含有磁珠的洗液加入1只新的1.5ml EP管中，将其置于磁力架上20s，收集上清重新冲洗样本管后加至EP管中；
(5)将含磁珠的EP管放在磁力架上吸附2min后，小心弃去上清，轻轻拍打5次EP管，彻底吸去管底残留液体；
(6)向其中再次加入1ml MagMAXTM cfDNA冲洗液，涡旋混匀30s，将EP管置于磁力架上2min，小心弃去上清，轻轻拍打5次EP管，彻底吸去管底残留液体；
(7)向其中加入1ml 80％乙醇，涡旋混匀30s，将EP管置于磁力架上2min，小心弃去上清，轻轻拍打5次EP管，彻底吸去管底残留液体；
(8)重复80％乙醇洗涤1次；
(9)弃去残留液体后打开管盖，空气干燥5min；
(10)向其中加入50μl MagMAXTM cfDNA洗脱液，涡旋混匀5min；
(11)将EP管置于磁力架上2min，所得上清含有cfDNA；
(12)采用Aglient Bioanalyzer 2100进行毛细管电泳，
二.结果
Agilent 2100电泳验证结果：两种酶消化产生的cfDNA片段毛细电泳结果显示均符合预期结果，与真实血浆cfDNA片段大小分布特征近似。cfDNA电泳峰图结果见图2A-图2D。
实施例4：用Illumina测序平台对应用于无创产前检测的参考物质进行验证
一.方法：利用NextSeq 550AR测序平台进行验证
取实施例3得到的一套参考物质样品盘(表2)，将其视为常规临床孕妇血浆标本在安诺优达基因科技(北京)有限公司进行常规胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测，经cfDNA提取、文库制备、上机测序和生物信息学分析等步骤得出检测结果。
该实施例中常规胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测范围及相应的质控指标要求见表3。
表3
Figure BDA0001861548740000161
Z检验(Z Test)是一般用于大样本平均值差异性检验的方法。它是用标准正态分布的理论来推断差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著。当样本量较大以及数据符合正态分布时，可以通过计算检验统计量Z值(Z-score)来进行比较。
在常用的Z值算法中，使用序列比对软件将测序获得的数据比对到人类参考基因组(如NCBI build37)，采用唯一比对的序列进行后续统计。获得大样本样品的总有效数据(Total mapped readsn)以及比对各个染色体有效数据(Mapped to chromosomenm)，分别将各个染色体的有效数据除以总有效数据即获得有效数据百分比(Unique Reads ratio，UR％)，计算公式如下：
Figure BDA0001861548740000162
其中m为染色体编号，m∈(1…22，X，Y)，n为大样本数目。计算大样本样品的UR均值及方差，计算公式如下：
Figure BDA0001861548740000163
Figure BDA0001861548740000164
计算每个样品各个染色体的Z值，计算公式如下：
Figure BDA0001861548740000171
根据统计学原理，出现在Z值为正负3以外的数值，则有99.9％的可能为阳性，故通常将Z值＝3定为参考值分界点。Z值＞3则判断为胎儿染色体非整倍体阳性；而当Z值＜3则判断为胎儿染色体非整倍体阴性。例如某个样品的染色体chr21的Z值大于3，则认为该样品的chr21的UR显著(d＜0.005)离群，即chr21-三体。
此外，在实践中为使结果达到一定可信度，通常规定使用一定数量的真实的大样本的测量结果来设定合理的阈值或参考值，也可以加灰区来帮助设定可信度，再用一定数量的样本对设定的Z值进行验证。
二.结果：检测结果见表4。
表4
Figure BDA0001861548740000172
本实施例检测结果显示，安诺优达基因科技(北京)有限公司利用NextSeq 550AR测序平台能检测出本次样本盘中所含全部染色体非整倍体类型，且所报告的胎儿cfDNA比例也基本与预期相符，即通过Illumina测序平台对该应用于无创产前检测的参考物质进行了验证。本发明可用作基于Illumina测序平台的无创产前检测的参考物质。
实施例5：用Complete Genomics测序平台对应用于无创产前检测的参考物质进行验证
一.方法：利用BGISEQ-500测序平台进行验证
取实施例3得到的一套参考物质样品盘(表2)，将其视为常规临床孕妇血浆标本在深圳华大基因科技有限公司进行常规胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测，经cfDNA提取、文库制备、上机测序和生物信息学分析等步骤得出检测结果。
本实施例中常规胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测范围及相应的质控指标要求见表5。
表5
Figure BDA0001861548740000181
二.结果
检测结果见表6：
表6
Figure BDA0001861548740000182
本实施例检测结果显示，深圳华大基因科技有限公司利用BGISEQ-500测序平台能检测出本次样本盘中所含全部染色体非整倍体类型，所报告的胎儿cfDNA比例也基本与预期相符；即通过Complete Genomics测序平台对该应用于无创产前检测的参考物质进行了验证。本发明可用作基于Complete Genomics测序平台的无创产前检测的参考物质。

Claims (11)

1.一种用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：用DNA片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA(核酸短片段)组分。
2.根据权利要求1所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系。
3.根据权利要求1所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于：所述人细胞系为永生化细胞系。
4.根据权利要求1至3中任何一项所述的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分的制备方法，其特征在于，所述酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核的方法是：
(1)取模拟母亲样本细胞系的细胞核约1×107个，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g 4℃离心5min，弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核，得到细胞核溶液；
缓冲液A的组分为20mM Hepes-KOH(pH7.5)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA钠，1mMEGTA钠，1mM DTT，0.1mM PMSF；
(2)配制消化反应体系，于37℃孵育2小时；
消化反应体系为：浓度为0.585mg/ml的DFF溶液30μL，浓度为95ng/μL的人caspase-3(细胞凋亡蛋白酶-3)45μL，缓冲液A 28μL，步骤(1)得到的细胞核溶液10μL；
(3)加入25ul反应终止液终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1h；终止液的组成为0.6％SDS，50mM EDTA，6mg/ml蛋白酶K；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布。
5.权利要求1至4中任何一种方法制备得到的用于无创产前检测的模拟母亲cfDNA组分，模拟母亲cfDNA的长度为160bp左右，与临床孕妇血浆中的母亲cfDNA的长度160-170bp接近。
6.一种无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：用微球菌核酸酶(Micrococcal nuclease，MNase)酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核，得到模拟胎儿cfDNA组分；用DNA片段化因子(DNA fragmentation factor，DFF)酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核，得到模拟母亲cfDNA组分；将模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分按质量比为1∶99～30∶70混合，得到模拟混合cfDNA组分；将模拟混合cfDNA组分加入到人造血浆中，制成模拟混合cfDNA浓度为1-100ng/ml的参考物质。
7.根据权利要求6所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目的人细胞系，所述模拟胎儿样本细胞系为染色体非整倍体阳性人细胞系或正常染色体数目的人细胞系。
8.根据权利要求6所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：所述人细胞系为永生化细胞系，所述人造血浆是含有浓度为5％的人血浆白蛋白的模拟体液。
9.根据权利要求6至8中任何一项所述的无创产前检测的参考物质的制备方法，其特征在于：
所述用微球菌核酸酶酶切模拟胎儿样本细胞系的细胞核的方法如下，
(1)取模拟胎儿样本细胞系的细胞核1×107个，用2-3ml MNase反应缓冲液洗涤细胞核，重复洗涤3次，120g 4℃离心10min，弃去上清后，用100μl MNase反应缓冲液重悬细胞核，得到细胞核悬液；
MNase反应缓冲液成分为1×Micrococcal Nuclease反应缓冲液，9％(v/v)2-ME，1片/10ml蛋白酶抑制剂，100μg/ml BSA；
(2)在上述细胞核悬液中加入300U MNase于37℃水浴孵育10min；
(3)向反应管中加入20μl MNase终止液，室温静置5min；MNase终止液成分为250mmol/LEDTA，250mmol/L EGTA；
(4)测定反应产物中DNA浓度，电泳观察核酸片段大小分布；
所述酶切模拟母亲样本细胞系的细胞核的方法如下，
(1)取模拟母亲样本细胞系的细胞核约1×107个，用1ml缓冲液A洗涤细胞核，重复洗涤2次，200g 4℃离心5min，弃去上清后，用100μl缓冲液A重悬细胞核，得到细胞核溶液；
缓冲液A的组分为20mM Hepes-KOH，(pH 7.5)，10mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM EDTA钠，1mMEGTA钠，1mM DTT，0.1mM PMSF；
(2)配制消化反应体系，于37℃孵育2小时；
消化反应体系为：浓度为0.585mg/ml的DFF溶液30μL，浓度为95ng/μL的人caspase-345μL，缓冲液A 28μL，步骤(1)得到的细胞核溶液10μL；
(3)加入25ul反应终止液终止反应，颠倒混匀，50℃孵育1h；终止液的组成为0.6％SDS，50mM EDTA，6mg/ml蛋白酶K；
(4)测定反应产物中DNA浓度，毛细管电泳观察核酸片段大小分布。
10.根据权利要求6至9中的任意一种方法制备的一种应用于无创产前检测的参考物质，其特征在于：所述模拟母亲样本细胞系为正常染色体数目人细胞系GM12878、正常染色体数目人细胞系GM23087、正常染色体数目人细胞系AG09387中的一种或多种；所述模拟胎儿样本细胞系为21-三体阳性人细胞系AG09394、18-三体阳性人细胞系GM02732、13-三体阳性人细胞系GM02948、正常染色体数目人细胞系GM23086中的一种或多种。
11.一种应用于无创产前检测的参考物质，其特征在于：由3个阳性混合样本和1个正常对照样本组成；每个阳性混合样本和正常对照样本均由模拟母亲cfDNA组分、模拟胎儿cfDNA组分和人造血浆组成，其中模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分的质量百分比为1∶99～30∶70，人造血浆是含有浓度为5％的人血浆白蛋白的模拟体液，模拟胎儿cfDNA组分与模拟母亲cfDNA组分之和在人造血浆中的浓度为1-100ng/ml；
3个阳性混合样本分别是21-三体阳性混合样本、18-三体阳性混合样本和13-三体阳性混合样本；21-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系AG09387的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的21-三体阳性人细胞系AG09394的cfDNA；18-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM12878的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的18-三体阳性人细胞系GM02732的cfDNA；13-三体阳性混合样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM12878的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的13-三体阳性人细胞系GM02948的cfDNA；
正常对照样本中的模拟母亲cfDNA组分为DFF酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM23087的cfDNA，模拟胎儿cfDNA组分为MNase酶切得到的正常染色体数目人细胞系GM23086的cfDNA。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831555A (zh) * 2021-02-01 2021-05-25 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用
CN113684267A (zh) * 2021-08-06 2021-11-23 菁良基因科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用
CN113699225A (zh) * 2021-08-06 2021-11-26 菁良基因科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复非配对参考品及其制备和应用
CN115651974A (zh) * 2022-11-11 2023-01-31 纳昂达(南京)生物科技有限公司 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113046430B (zh) * 2021-03-15 2022-02-01 北京阅微基因技术股份有限公司 一种染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及其应用
CN113930512A (zh) * 2021-11-02 2022-01-14 苏州水木济衡生物技术有限公司 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531842A (zh) * 2014-11-27 2015-04-22 中山大学达安基因股份有限公司 一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法
US20150147815A1 (en) * 2013-09-27 2015-05-28 Natera, Inc. Cell free dna diagnostic testing standards
US20160333416A1 (en) * 2014-04-21 2016-11-17 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
CN109112209A (zh) * 2017-06-25 2019-01-01 国家卫生计生委科学技术研究所 用于无创产前检测胎儿非整倍体染色体的参考品

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016015058A2 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 University Of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free dna, and methods of identifying a disease or disorder using same
CN107922959A (zh) * 2015-07-02 2018-04-17 阿瑞玛基因组学公司 混合物样品的精确分子去卷积
EP3118323A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-18 Cartagenia N.V. System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150147815A1 (en) * 2013-09-27 2015-05-28 Natera, Inc. Cell free dna diagnostic testing standards
US20160333416A1 (en) * 2014-04-21 2016-11-17 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
CN104531842A (zh) * 2014-11-27 2015-04-22 中山大学达安基因股份有限公司 一种无创产前检测胎儿21、18和13三体综合征的阳性质控品及其制备方法
CN109112209A (zh) * 2017-06-25 2019-01-01 国家卫生计生委科学技术研究所 用于无创产前检测胎儿非整倍体染色体的参考品

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGLAI LIU ET AL.: "Multiplex Cell-Free DNA Reference Materials for Quality Control of Next-Generation Sequencing-Based In Vitro Diagnostic Tests of Colorectal Cancer Tolerance", 《J CANCER》 *
JONATAN BLAIS ET AL.: "Development of Reference Materials for Noninvasive Prenatal Aneuploidy Testing by Massively Parallel Sequencing: A Proof-of-Concept Study", 《J APPL LAB MED》 *
P WIDLAK ET AL.: "Cleavage preferences of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and chromatin substrates", 《J BIOL CHEM》 *
RUI ZHANG ET AL.: "External Quality Assessment for Detection of Fetal Trisomy 21, 18, and 13 by Massively Parallel Sequencing in Clinical Laboratories", 《J MOL DIAGN》 *
RUI ZHANG ET AL.: "Generation of Highly Biomimetic Quality Control Materials for Noninvasive Prenatal Testing Based on Enzymatic Digestion of Matched Mother-Child Cell Lines", 《CLIN CHEM》 *
丁健生: "基于母子细胞系及其酶消化的胎儿染色体非整倍体无创产前检测游离DNA参考物质的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
李士谔 等: "小鼠腹水肝癌细胞增殖酶及分化酶基因染色质构象的变化及其与酶基因表达的关系", 《中国科学》 *
杨新: "乳腺癌循环肿瘤DNA高通量测序检测参考物质及其应用于分析性能确认的研究", 《万方学位论文》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112831555A (zh) * 2021-02-01 2021-05-25 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用
CN113684267A (zh) * 2021-08-06 2021-11-23 菁良基因科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用
CN113699225A (zh) * 2021-08-06 2021-11-26 菁良基因科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复非配对参考品及其制备和应用
CN113699225B (zh) * 2021-08-06 2023-11-21 菁良科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复非配对参考品及其制备和应用
CN113684267B (zh) * 2021-08-06 2024-04-16 菁良科技(深圳)有限公司 无创产前筛查微缺失或微重复配对参考品及其制备和应用
CN115651974A (zh) * 2022-11-11 2023-01-31 纳昂达(南京)生物科技有限公司 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用
CN115651974B (zh) * 2022-11-11 2024-03-08 纳昂达(南京)生物科技有限公司 人工模拟cfDNA标准品及其制备方法与应用

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