CN111423419B - 一种小分子化合物cyy-260及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子化合物cyy‑260及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该小分子化合物为一种JAKs抑制剂，结构如式(I)所示，其在非小细胞肺癌的发生发展中的抑制作用。实验证明，cyy‑260可以成浓度依赖型地抑制肺癌细胞增殖，克隆形成以及迁移，诱导凋亡。较低浓度达到抗肿瘤生物学活性。

Description

一种小分子化合物cyy-260及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小分子化合物cyy-260及其制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肺癌是一组异质性肿瘤，由50多种组织形态学亚型组成。在过去的几十年中，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)是最常用的肺癌诊断术语，主要是由于治疗选择有限，通常不需要进一步的区分形态学亚型。
NSCLC约占所有肺癌的80％，其中腺癌(ADC)和鳞状细胞癌(SqCC)是NSCLC的主要组织学亚型。临床上，只有一小部分经过早期诊断(I或II期)的NSCLC患者可以通过外科手术来切除。在诊断时，超过60％的肺癌患者出现局部晚期或转移性疾病(III或IV期)，此时可能无法选择手术切除。直到现在，常规化学疗法和放射疗法仍是肺癌患者治疗的主要手段。因此，开发新型抗肺癌药物对控制肺癌进展有重大意义。
发明内容
本发明提供了一种小分子化合物cyy-260及其在制备抗肿瘤药物中的应用，该小分子化合物cyy-260可用于抑制肺癌的发生发展。
一种小分子化合物cyy-260，结构如式(I)所示：
Figure BDA0002372268310000021
该小分子化合物的分子式为C23H26N8。
本发明还提供了一种所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明通过研究小分子化合物cyy-260的药理作用，发现该小分子化合物cyy-260具有显著的抗肿瘤作用，具体地，该小分子化合物可以用于控制或者治疗肺癌，进一步的研究表明，该小分子化合物可以用于抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成，抑制肺癌细胞迁移，诱导肺癌细胞发生细胞凋亡，抑制肺癌细胞JAKs蛋白表达。
附图说明
图1为实施例2中cyy-260化合物的MTT试验的结果；
图2为实施例2中cyy-260化合物的克隆形成试验结果；
图3为实施例3中cyy-260化合物的抑制肺癌细胞迁移试验的结果；
图4为实施例4中Hoechst染色试验结果；
图5为实施例4中Annexin V-FITC/PI双染法试验结果；
图6为实施例5中Cyy-260抑制肺癌细胞JAKs蛋白表达结果。
具体实施方式
实施例1
(1)将2,4-二氯-5-甲基嘧啶(323.96mg，2.0mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(516.96mg，4mmol)溶解在DMF(4mL)中并冷却至0℃。再向混合液中逐滴加入溶于DMF(2mL)中的6-氨基吲唑(266.3mg，2mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌约1小时。接下来，移去冰浴，将反应混合物在室温下搅拌，并在通过TLC监测反应，将所得混合物用EtOAc(3×25mL)萃取，用饱和食盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩,通过硅胶柱层析得到中间产物。表征数据如下：
N-(2-chloro-5-methylpyrimidin-4-yl)-1H-indazol-6-amine
以二氯甲烷：甲醇＝16：1为洗脱剂，得到黄色固体(163.5mg，21.0％yield)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ13.06(s,1H),8.97(s,1H),8.10(s,1H),8.03(s,2H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.35(d,J＝6.8Hz,1H),2.24(s,3H)。
反应式如下：
Figure BDA0002372268310000031
(2)将步骤(1)的中间产物(259.7mg，1mmol)和4-(4-甲基哌嗪)苯胺(191.27mg，1mmol)溶解在4ml甲醇中,再加入TFA(148.56μL，2mmol)，升温至80℃，并在通过TLC监测反应。反应完成后冷却至室温,将所得混合物用饱和碳酸氢钠调PH至中性，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，饱和食盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩,通过硅胶柱层析得到产物cyy-260。表征数据如下：
4-(4-((4-((1H-indazol-6-yl)amino)-5-methylpyrimidin-2-yl)amino)phenyl)thiomor-pholine 1,1-dioxide
以二氯甲烷：甲醇＝16：1为洗脱剂，得到灰色固体(140.9mg，81.4％yield)。1HNMR(500MHz,DMSO)δ13.00(s,1H),8.83(s,1H),8.45(s,1H),8.01–7.84(m,3H),7.67(d,J＝8.5Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,2H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,2H),3.62(s,4H),3.11(s,4H),2.14(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ159.39,158.85,158.29,155.68,142.01,138.02,134.28,133.10,119.84,119.67,119.11,117.52,116.69,105.32,102.49,49.91,47.86,13.56；ESI-MS m/z:450.17(M﹢H)﹢,calcd for C22H23N7O2S,found 450.14.
Figure BDA0002372268310000041
实施例2抑制肺癌细胞增殖及克隆形成试验
我们通过MTT实验以及克隆实验分析cyy-260对肺癌细胞增殖的影响。选取三株人肺癌细胞PC-9、A549、H1975，收集对数期细胞，在96孔板中按3000个/孔铺入细胞，待细胞贴壁单层铺满孔底后加入不同cyy-260浓度(D、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20μM)，药物作用48h后加入25μl/孔MTT溶液(5mg/ml)，继续培养箱孵育4小时后终止培养。弃上清后，加入150ul DMSO/孔溶解结晶物。在多功能酶标仪OD490nm测定各孔光吸收值，并用GraphPadPrism计算半抑制浓度(IC50值)。实验结果如图1所示，结果显示cyy-260作用48h后能够剂量依赖性地抑制肺癌细胞株的增殖。
肿瘤细胞能够无限增殖形成细胞集落，通过克隆形成实验，我们发现cyy-260能抑制肺癌细胞克隆形成。取对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。我们按照1000个/孔将细胞均匀铺入6孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度cyy-260药物，终浓度分别为1、2、4μM，作用24h后撤去药物，加入新鲜培养基继续培养，待细胞形成肉眼可见的集落，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次。用4％多聚甲醛固定之后用结晶紫溶液染色，回收结晶紫后后空气干燥。比较各孔间集落的大小和数量，结果如图2所示。结果显示，cyy-260能浓度依赖性地限制肺癌细胞克隆形成。
实施例3抑制肺癌细胞迁移试验
我们利用transwell实验来评估cyy-260对细胞迁移侵袭的影响。将肺癌细胞PC-9、H1975培养至对数生长期，在下室(即24孔板底部)加入600－800μl含10％血清的培养基，上室加入100－200μl细胞悬液(无血清)，细胞数3×104-4×104/孔，隔天加药，继续在孵箱培养24后，终止培养，弃去培养液，用4％多聚甲醛固定之后用结晶紫溶液染色，在显微镜下拍照记录。结果如图3所示。结果显示，cyy-260能显著地并呈浓度依赖性地抑制肺癌细胞迁移和侵袭。
实施例4诱导肺癌细胞凋亡试验
Hoechst是一种膜通透性的荧光染料，故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。我们利用Hoechst33258凋亡染色试剂盒对细胞核进行染色，通过观察细胞核的荧光染色情况判断细胞核形变程度，从而反映细胞凋亡的情况。取普通洁净盖玻片于70％乙醇中浸泡5分钟或更长时间，将盖玻片至于六孔板内，种入肺癌细胞培养过夜，使约为50％左右满。cyy-260刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入4％多聚甲醛固定，用Hoechst33258染色，在荧光显微镜下拍照记录。结果如图4所示，cyy-260可以呈浓度依赖性地诱导肺癌细胞凋亡。
接下来，我们利用流式细胞术再次评估cyy-260对肺癌细胞凋亡的影响。我们将肺癌细胞均匀铺入6孔板中，不同浓度的cyy-260(1,2,4μM)作用36h后，利用Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测cyy-260诱导肺癌细胞凋亡的效果。结果如图5所示，cyy-260能够呈剂量依赖性地诱导肺癌细胞产生凋亡。
实施例5 Cyy-260抑制肺癌细胞JAKs蛋白表达
JAK/STAT3通路在细胞的增殖、侵袭及凋亡的过程中有重要作用，在多种肿瘤中高表达。我们通过Western Blot实验评估cyy-260对肺癌细胞JAKs蛋白的表达。实验结果如图6所示，cyy-260抑制肺癌细胞JAK以及STAT3蛋白表达，并具有浓度依赖性。

Claims (6)

1.一种小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，结构如式(I)所示：
Figure FDA0002979832620000011
所述的抗肿瘤药物用于控制或者治疗肺癌。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成。
4.根据权利要求1所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制肺癌细胞迁移。
5.根据权利要求1所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于诱导肺癌细胞发生细胞凋亡。
6.根据权利要求1所述的小分子化合物cyy-260在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物用于抑制肺癌细胞JAKs蛋白表达。
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