CN111398478B - 一种水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法 - Google Patents
一种水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于检测领域，公开了一种水样中氨氮及其同位素含量的气‑质谱色谱联用检测方法。该方法通过向待测水样中加入中性甲醛进行反应生成稳定的亚胺，然后通过GC‑MS进行检测。该方法避开了以气体为检测对象，通过对14NH4 +和15NH4 +在与中性甲醛反应后使质谱信号出现了较大区别，从而可以使用常规的气‑质谱色谱联用检测方法直接定性和定量。而且本发明操作过程中只需控制好操作酸碱度，在权利所述时间范围内具有良好的回收率，方法简单，且精度和准确性高。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，特别涉及一种水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法。
背景技术
氨氮是水体富营养化的主要指标之一，也是我国饮用水、地表水等控制的主要指标之一。氨氮的主要来源于生活废水，这些含氨氮废水的大量排放，使得水体中的氮含量增高导致水体富营养化，水中的生化反应导致水体逐渐缺氧，鱼类及其它生物大量死亡，水质恶化而黑臭。目前，研究环境中氮污染源、氮循环和归趋均需使用氮同位素进行示踪，但由于氨氮本身和氨氮同位素直接的化学物理性质一致而无法有效的通过常规方法监测，必须借助于同位素分析仪器进行定性定量。很显然，简便、快速、高效的检测方法对于大批量采样进行氨氮及其同位素检测分析是十分重要的。
目前，测定氨氮同位素的主要方法有高效液相色谱法、同位素质谱法等。高效液相色谱法主要是通过柱后衍生方法把氨氮转化成其他可以被紫外或者荧光响应的物质，但是分离色谱柱填料需要特定材料和定制，在很多研究机构不易实现。同位素质谱法是通过对氨氮进行氧化或者还原转化成稳定的同位素如15N2、15N2O等，然后通过同位素质谱仪进行表征的方法。此种方法在转化过程中因为检测目标为气体，操作过程中容易被损失，需要使用到昂贵的同位素质谱仪等不易被普及和使用。因此，开发一种容易在常规仪器上使用且避开以气体为检测目标、经济快速的方法，对于大批量样品进行检测分析是很有必要的。而氮同位素之间质量仅仅相差1，其物理化学性质近乎一模一样，因此用常规的GC-MS，或者HPLC-MS进行上述同位素的分离是无法实现的。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种简单、成本低、可普遍推广应用且准确性高的水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法，包括以下步骤：
(1)取体积为Vb的待测水样，调节pH<2.0后过滤，然后浓缩至体积为Va；
(2)调节步骤(1)中浓缩后的待测水样的pH值为5.5～6.5，加入中性甲醛进行反应，反应结束后将所得反应液的pH调节至8.5-9.5，然后浓缩至近0.5mL，再用甲醇定容至体积为1ml，存放于-20℃冰箱中，待测；
(3)取体积为Vb的二次蒸馏水，然后浓缩至体积为Va，再用浓缩后的二次蒸馏水代替步骤(2)中浓缩后的待测水样并进行步骤(2)的操作，得到用甲醇定容至体积为1ml的空白溶液，存放于-20℃冰箱中，待测；
(4)配置不少于5份14NH4 +浓度在0～200μmol/L范围内的(14NH4)2SO4水溶液以及不少于5份15NH4 +浓度在0～200μmol/L范围内的(15NH4)2SO4水溶液作为标准工作液，或者配制不少于5份14NH4 +浓度和15NH4 +浓度均在0～200μmol/L范围内的(14NH4)2SO4和(15NH4)2SO4混合水溶液作为标准工作液，然后对标准工作液重复步骤(2)的操作，得到用甲醇定容至1.0ml的标准液，存放于-20℃冰箱中，待测；
(5)设置好GC-MS仪器测量参数，按照仪器序列进样步骤(4)所得的待测溶液，进样体积为1μl，以m/z为140(14N)和144(15N)定性，以14NH4 +对应的色谱峰面积或峰高作为纵坐标，以标准工作液中14NH4 +浓度为横坐标绘制14N的标准曲线进行定量；以15NH4 +对应的色谱峰面积或峰高作为纵坐标，以标准工作液中15NH4 +浓度为横坐标绘制15N的标准曲线进行定量；
(6)按照步骤(5)对步骤(2)中的待测样品溶液和步骤(3)中的待测空白溶液进行检测工作，根据步骤(5)标准曲线以及色谱峰面积或峰高得出待测样品溶液含量ρ0以及待测空白溶液含量ρ空白。
(7)样品中氨氮14N或15N含量用ρs表示，结果按照如下公式计算
其中，ρs：待测水样中14NH4 +或15NH4 +浓度(μmol/L)；ρ0：标准曲线上读到待测样品溶液中14NH4 +或15NH4 +的浓度(μmol/L)；Va：浓缩后的待测水样的体积(ml)；Vb：待测水样的取样体积(ml)；ρ空白：空白对照在校准曲线上读到的14NH4 +或15NH4 +值(μmol/L)。
步骤(1)中所述的调节pH优选用6mol/L的硫酸进行调节，调节pH的目的在于稳定氨氮及其同位素在样品中的含量。
步骤(1)中所述的过滤优选为用0.45μm过滤膜进行过滤。
步骤(1)中所述的浓缩优选为使用冷冻干燥、旋转蒸发、氮气吹气浓缩等方法进行浓缩，浓缩的比例为不少于1000倍。
步骤(2)中所述的中性甲醛是指不含游离酸的甲醛，可通过向甲醛中加碱中和游离酸至甲醛为中性，纯度为分析纯及更优纯。
步骤(2)中所述的中性甲醛的用量满足中性甲醛的体积至少为0.3Va，确保反应体系中甲醛为过量。
步骤(2)中所述的反应是指在常温～45℃反应5～60min；
步骤(2)中所述的浓缩至近0.5ml优选为利用液液萃取或固相萃取方法进行初浓缩，再将所得浓缩液在不高于40℃的条件下用氮气吹干至近0.5ml；
步骤(2)中所述的液液萃取中所用的溶剂为三氯甲烷，纯度为分析纯或更优纯度。
步骤(2)中所述的固相萃取中，固相萃取小柱填料为C18，萃取前依次用10ml甲醇和10ml二次蒸馏水进行活化，活化过程中小柱不能留空变干(若留空变干则需重新活化)。固相萃取过程中，待萃取的溶液过C18固相萃取小柱的流速为5ml/min；润洗盛装分析样品的容器的水体积为3.0ml；淋洗液为二次蒸馏水和HPLC级甲醇，体积各为3.0ml；洗脱液为体积比为5:95的氨水-甲醇混合液，体积为15ml；
步骤(4)中所述的(14NH4)2SO4和(15NH4)2SO4的纯度均为99％以上，称量精确到0.1mg；
步骤(5)中所述的GC-MS仪器测量参数为：进样口温度：280℃；进样模式：分流进样，分流比为10:1；升温程序：50℃保持2min，以10℃/min的速率升温至125℃，保持1min，再以40℃/min的速率升温至280℃，保持1min；载气：He，流速为1.0ml/min；质谱端传输线温度：280℃；离子源温度：280℃；扫描方式为全扫描(Scan)或选择离子扫描(SIM)，扫描范围为50-300amu，SIM模式扫描所用特征离子的分别为140和144。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
1、本发明避开了以气体为检测对象，通过反应生成相对稳定的亚胺，且在水环境中具有较好的产率，减少了操作过程中的操作损失。
2、本发明通过对14NH4 +和15NH4 +在与中性甲醛反应后使质谱信号出现了较大区别，从而可以使用常规的气-质谱色谱联用检测方法直接定性和定量。检测仪器使用的是常见气相色谱质谱联用仪，其适用范围广，容易在普通实验室推广应用。
3、本发明操作过程中只需控制好操作酸碱度，在权利所述时间范围内具有良好的回收率，方法简单，且精度和准确性高。
附图说明
图1为以色谱峰面积(峰高)作为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标绘制的工作曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
实施例1：利用已知浓度的硫酸铵溶液评价本发明检测方法的准确性
第一步：取样
用二次蒸馏水配置含有50μmol的(14NH4)2SO4和50μmol的(15NH4)2SO4的混合溶液1000mL，准确移取10.0ml样品作为样品溶液。
第二步：制备空白对照溶液
准确移取10.0ml二次蒸馏水作为空白对照溶液。
第三步：将第一步所制备的样品溶液中分别加入3ml的中性甲醛混合摇匀，反应约30min，所得产物用6mol/L氢氧化钠将pH调节至9.0，然后以5ml/min经过C18固相萃取小柱，固相萃取小柱使用前依次分别用10ml甲醇(HPLC级)，10ml水活化。待分析样品溶液全部通过C18小柱后，用3.0ml纯水润洗装分析样品溶液容器，并全部转移过固相萃取小柱，完成富集。再使用3.0ml高纯水和3.0ml甲醇依次通过固相萃取小柱润洗。最后使用15.0ml氨水-甲醇(体积比5:95)洗脱液洗脱固相萃取小柱，用K-D浓缩器收集洗脱液。洗脱液在恒温40℃水浴条件下用氮气吹干至近0.5ml，用甲醇定容至1ml，待测。
第四步：将第三步中“第一步所制备的样品溶液”替换为“第二步制备的空白对照溶液”，然后重复第三步的操作，得到用甲醇定容至1mL的待测空白溶液；
第五步：制备标准溶液的待测溶液
分别精密称取50.0μmol(14NH4)2SO4(精确到0.1μmol)和50.0μmol(15NH4)2SO4(精确到0.1μmol)于100ml容量瓶中，用二次蒸馏水定容至100ml，用移液管0.0ml，1.1ml，1.7ml，2.2ml，2.8ml，5.6ml于6个100ml容量瓶中，并用二次蒸馏水稀释后定容，得(14NH4)2SO4和(15NH4)2SO4的混合标准工作液。用移液管分别移取6份上述标准系列10ml，向所得标准工作液中分别加入3.0ml中性甲醛，搅拌反应30min，反应结束后将所得反应液的pH调节至8.5-9.5，然后利用液液萃取或固相萃取方法进行浓缩，所得浓缩液在不高于40℃的条件下用氮气吹干至近0.5mL，用甲醇定容至1mL(V0)，存放于-20℃冰箱中，待测；
第六步：绘制标准曲线
设置好GC-MS仪器测量参数(进样口温度260℃，分流比为10:1，载气为He，流速为1.0ml/min，柱温箱起始温度为60℃，保持4min，10℃/min升温至180℃，保持0min，40℃/min升温至260℃，保持2min。质谱传输线280℃，离子源280℃，质谱扫描50～300amu。)，按照仪器序列进样第五步所得的待测溶液，以m/z为140(14N)和144(15N)定性，以色谱峰面积(峰高)作为纵坐标，以标准工作液中14NH4或15NH4浓度为横坐标绘制标准曲线进行定量(参考曲线图见图1)。
第七步：测定样品中(14NH4)2SO4和(15NH4)2SO4含量
按照第六步中设置好的GC-MS仪器测量参数对第四步制备的待测空白溶液进行检测工作，根据标准曲线以及测量得到的14NH4 +或者15NH4 +对应峰面积得到待测空白溶液中14NH4或15NH4浓度ρ空白；
按照第六步中设置好的GC-MS仪器测量参数对第三步制备的待测样品溶液进行检测工作，根据标准曲线以及测量得到的14NH4 +或者15NH4 +对应峰面积得到得出待测样品中14NH4或15NH4浓度ρ0。
待测样品溶液中14NH4或15NH4的实际测试浓度即为ρ0-ρ空白。
再平行取样5次，重复上述的第一步到第七步，所得到的14NH4或15NH4的实际测试浓度以及精密度分别如下表1所示；
取含有50μmol/L14NH4 +的(14NH4)2SO4水溶液或者含有50μmol/L 15NH4 +的(15NH4)2SO4水溶液，逐级稀释，按照实施例1中的第三步制备待测溶液，然后再按第六步中的GC-MS仪器测量参数进行测试，当色谱峰噪音峰高为方法仪器极限噪音3倍时，定为本方法对14NH4 +或者15NH4 +的检出限，结果如下表1所示，从表1中可以看出，本发明方法检出限为1μmol/L，SD小于10％，回收率在82.8％-93.4％。
表1本发明实施例的方法的检测结果
实施例2：测定未知浓度试样的氨氮及同位素含量
第一步，取样
取位于广州河段河涌6个水样10000ml，用6mol/L硫酸调节pH<2.0，以稳定氨氮及其同位素在样品中的含量，用旋转蒸发仪在70℃水浴下浓缩至10.0ml，过滤除去溶液中的沉淀。
第二步：制备空白对照溶液
准确移取10000ml二次蒸馏水，按照第一步方法浓缩至10.0ml，作为空白对照溶液。
第三步：将第一步所制备的样品溶液分别加入3ml的分析纯中性甲醛混合摇匀，反应约30min，所得产物用6mol/L氢氧化钠将pH调节至9.0，所得溶液用5ml/min经过C18固相萃取小柱，固相萃取小柱使用前依次分别用10ml甲醇溶液，10ml水活化。待分析样品溶液全部通过C18小柱后，用3.0ml纯水润洗装分析样品溶液容器，并全部转移过固相萃取小柱，完成富集。再使用3.0ml高纯水和3.0ml甲醇依次通过固相萃取小柱淋洗，弃去淋洗液。最后使用15.0ml氨水-甲醇(体积比为5:95)洗脱液洗脱固相萃取小柱，用K-D浓缩器收集洗脱液。洗脱液在恒温40℃水浴条件下用氮气吹干近0.5ml，用甲醇定容至1ml，待测。
第四步：将第三步中“第一步所制备的样品溶液”替换为“第二步制备的空白对照溶液”，然后重复第三步的操作，得到用甲醇定容至1mL的待测空白溶液；
第五步：制备标准曲线，步骤与实施例1中第五步和第六步一致，所得也标准曲线如图1所示；
第六步：测定样品中(14NH4)2SO4或(15NH4)2SO4含量
按照实施例1第六步中设置好的GC-MS仪器测量参数对第四步制备的待测空白溶液进行检测工作，根据标准曲线以及测量得到的14NH4 +或者15NH4 +对应离子峰面积得到待测空白溶液中14NH4或15NH4浓度ρ空白；
按照实施例1第六步中设置好的GC-MS仪器测量参数对第三步制备的待测样品溶液进行检测工作，根据标准曲线以及测量得到的14NH4 +或者15NH4 +对应离子峰面积得到得出待测样品中14NH4或15NH4浓度ρ0。
第七步：计算
样品中氨氮14N和15N含量用ρs表示，结果按照如下公式计算
其中，ρs：取样样品中14NH4 +或15NH4 +浓度(μmol/L)；ρ0：标准曲线上读到的待测样品溶液中14NH4 +或15NH4 +的浓度(μmol/L)；Va：浓缩后的待测水样的体积(ml)，本实施例中为10ml；Vb：待测水样的取样体积(ml),本实施例中为10000ml；ρ空白：空白对照在校准曲线上读到待测空白溶液中14NH4 +或15NH4 +值(μmol/L)。
将本发明的方法测试的结果与稳定同位素质谱仪检测结果进行对比，结果如下表2所示，从表2中可以看出本发明的方法与本领域公认的稳定同位素质谱仪检测结果的误差不超过7％，因此本发明的方法具有较好的准确性。
表2本发明方法和稳定同位素质谱仪检测结果误差
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取体积为Vb的待测水样，调节pH<2 .0后过滤，然后浓缩至体积为Va；
(2)调节步骤(1)中浓缩后的待测水样的pH值为5.5～6.5，加入中性甲醛进行反应，反应结束后将所得反应液的pH调节至8.5-9.5，然后浓缩至近0.5mL，再用甲醇定容至体积为1ml，存放于-20℃冰箱中，待测；
(3)取体积为Vb的二次蒸馏水，然后浓缩至体积为Va，再用浓缩后的二次蒸馏水代替步骤(2)中浓缩后的待测水样并进行步骤(2)的操作，得到用甲醇定容至体积为1ml的空白溶液，存放于-20℃冰箱中，待测；
(4)配置不少于5份14NH4 +浓度在0～200μmol/L范围内的(14NH4)2SO4水溶液以及不少于5份15NH4 +浓度在0～200μmol/L范围内的(15NH4) 2SO4水溶液作为标准工作液，或者配制不少于5份14NH4 +浓度和15NH4 +浓度均在0～200μmol/L范围内的(14NH4) 2SO4和(15NH4) 2SO4混合水溶液作为标准工作液，然后对标准工作液重复步骤(2)的操作，得到用甲醇定容至1.0ml的标准液，存放于-20℃冰箱中，待测；
(5)设置好GC-MS仪器测量参数，按照仪器序列进样步骤(4)所得的待测溶液，进样体积为1μl，以m/z为140和144定性，以14NH4 +对应的色谱峰面积或峰高作为纵坐标，以标准工作液中14NH4 +浓度为横坐标绘制14N的标准曲线进行定量；以15NH4 +对应的色谱峰面积或峰高作为纵坐标，以标准工作液中15NH4 +浓度为横坐标绘制15N的标准曲线进行定量；
(6)按照步骤(5)对步骤(2)中的待测样品溶液和步骤(3)中的待测空白溶液进行检测工作，根据步骤(5)标准曲线以及色谱峰面积或峰高得出待测样品溶液含量ρ0以及待测空白溶液含量ρ空白；
(7)样品中氨氮14N或15N含量用ρs表示，结果按照如下公式计算
其中，ρs：待测水样中14NH4 +或15NH4 +浓度，μmol/L；ρ0：标准曲线上读到待测样品溶液中14NH4 +或15NH4 +的浓度，μmol/L；Va：浓缩后的待测水样的体积，ml；Vb：待测水样的取样体积，ml；ρ空白：空白对照在校准曲线上读到的14NH4 +或15NH4 +值，μmol/L；
步骤(2)中所述的中性甲醛是指不含游离酸的甲醛；
步骤(2)中所述的浓缩至近0.5ml指利用液液萃取或固相萃取方法进行初浓缩，再将所得浓缩液在不高于40℃的条件下用氮气吹干至近0.5ml；
步骤(2)中所述的液液萃取中所用的溶剂为三氯甲烷；
步骤(2)中所述的固相萃取中，固相萃取小柱填料为C18，萃取前依次用10ml甲醇和10ml二次蒸馏水进行活化，活化过程中小柱不能留空变干；固相萃取过程中，待萃取的溶液过C18固相萃取小柱的流速为5ml/min；润洗盛装分析样品的容器的水体积为3.0ml；淋洗液为二次蒸馏水和HPLC级甲醇，体积各为3.0ml；洗脱液为体积比为5:95的氨水-甲醇混合液，体积为15ml；
步骤(5)中所述的GC-MS仪器测量参数为：进样口温度：280℃；进样模式：分流进样，分流比为10:1；升温程序：50℃保持2min，以10℃/min的速率升温至125℃，保持1min，再以40℃/min的速率升温至280℃，保持1min；载气：He，流速为1.0ml/min；质谱端传输线温度：280℃；离子源温度：280℃；扫描方式为全扫描或选择离子扫描，扫描范围为50-300amu，选择离子扫描模式扫描所用特征离子的分别为140和144。
2.根据权利要求1所述的水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的调节pH用6mol/L的硫酸进行调节；
步骤(1)中所述的过滤为用0.45μm过滤膜进行过滤；
步骤(1)中所述的浓缩为使用冷冻干燥、旋转蒸发或氮气吹气浓缩进行浓缩，浓缩的比例为不少于1000倍。
3.根据权利要求1所述的水样中氨氮及其同位素含量的气-质谱色谱联用检测方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的中性甲醛的用量满足中性甲醛的体积至少为0.3Va；
步骤(2)中所述的反应是指在常温～45℃反应5～60min。
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