CN102980968A - 一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定尿液中肌酐含量的方法，其特征在于：包括样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中肌酐的含量水平。本发明为全新的尿液中肌酐含量的测定方法，采用氘代标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差；串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。
Description
技术领域：
本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体涉及一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法。
背景技术：
连续完全采集志愿者实验期间的24小时尿液能够提供更准确毒物接触剂量水平。尿液样本的完整性是实验组织者首先需要关心的问题，一般采用肌酐的24小时清除率来确定样本的完整性，或者用肌酐比率来校正尿液浓度。近年来，肌酐作为校正因子广泛应用于烟气相关生物标志物的浓度校正，包括可替宁、NNAL和巯基尿酸等。
尿液中肌酐的检测方法主要有Jaffe法、酶解分光光度法、HPLC法、毛细管电泳法、毛细管区带电泳法、GC-MS法和LC-MS/MS法。LC–MS/MS由于其高灵敏度与选择性，被广泛应用于尿液和血液等生物基质中肌酐的检测。Hoskova发展了一种快速分析肌酐的电喷雾-串联质谱法，尿液样本通过固相萃取后直接进入串联质谱检测。此方法虽然省去了尿液样本的分离时间，但是尿液基质只通过固相萃取后就直接进入质谱分析可能会污染仪器，串联质谱的选择分离远不如液相色谱柱。Park报道了一种LC-MS-MS直接分析尿肌酐的方法，尿液只需甲醇稀释与过滤后就可以进样检测。但是，肌酐在反相C18柱上的保留时间是0.59 min，难以与尿液中水溶性的干扰物分开。本发明旨在建立一种简单、快速、选择性好的LC-MS-MS方法测定尿液中的肌酐。
发明内容：
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用LC-MS/MS测定卷烟尿液中肌酐含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中肌酐的含量，测定结果准确、测定干扰少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下工艺步骤：
a、收集志愿者尿液；
b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min，离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜，取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL浓度为1 μg/mL的肌酐-d3，用纯水定容至刻度；
c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的肌酐标准工作溶液
d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的肌酐标准工作溶液，注入LC-MS/MS***，肌酐的线性回归方程为y=0.0106x+0.00615，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
步骤b中的稀释过程依次加入的肌酐-d3和离心过滤后的尿液的体积分别为100 μL和5 μL。
在步骤d中，所述的色谱分析条件为色谱柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），初始流动相体系选取50% 溶剂A（0.1% 乙酸水溶液）和50% 溶剂B（0.1% 乙酸甲醇溶液），分析时间为12 min，进样量为5 μL。
采用色谱柱分析时，选取的洗脱条件：50%的0.1% 乙酸水溶液和50%的0.1% 乙酸甲醇溶液等度洗脱，流动相流速为200 μL/min。
串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压为5000V, 雾化气为40 psi, 气帘气的量为30 psi, 辅助加热气的流速为40 psi, 离子源温度为480 oC，射入电压：10 V, 碰撞能：29 eV； 去簇电压：73 V，驻留时间：100 ms。
本发明具体的工艺过程进一步详述如下：
1 尿液收集
收集志愿者尿液。
2 样品前处理
b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min。离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜。取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL肌酐-d3（1 μg/mL），用纯水定容至刻度，取5 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。
3 LC-MS/MS测定
（1）LC-MS/MS条件
色谱条件： Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流动相A：0.1% 乙酸水溶液（体积分数），流动相B：0.1% 乙酸甲醇溶液（体积分数）；柱温40 oC；进样量5 μL。选取50% A和50%B在流速0.2 ml/min时等梯度洗脱尿液样品，分析时间为12 min。
质谱条件:电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式：IS：5000V，Gas1：40 psi，CUR：30 psi，Gas2：40 psi，TEM：480 oC，EP：10 V，CE：29 eV；CXP：8 V，DP：73 V，驻留时间：100 ms。选取m/z 114/44作为定量离子对，m/z 117/47为对应的氘代内标离子对。
（2）尿液中肌酐含量的测定
吸取配制好的不同浓度的肌酐的混合标准工作溶液5 μL，注入LC-MS/MS。肌酐的线性回归方程为y=0.0106x+0.00615，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中肌酐的含量。
（3）本发明方法的线性范围和检出限：
用处理过的混合空白尿液配制系列标准曲线，肌酐的标准曲线的点为1，2，5，10，20，50，100，200，500和2000 ng/mL，化合物的线性良好，相关系数为0.9995。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。方法的定量限和检出限分别为0. 3 ng/mL和0.99 ng/mL。
（4）本发明方法加标回收率和重复性：
选取肌酐含量为低、中、高的三个尿液样本，检测其中的肌酐含量。每个样本测10个平行得到日内精密度；每个样本连续测定8天，得到日间精密度。方法的日内和日间精密度（CV%）范围分别是1.0%–1.8% 和 1.5%–2.9%（表1）。
表1 方法的精密度
采用尿液基质加标准品的方法测定回收率。选取一个非吸烟者尿液样本，选取三个添加水平（50, 200和400 ng/mL）加入标准品，每个水平做6个平行。方法的回收率范围是98.6%-106.0%（n=6）（表2）。
表2 方法的回收率
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液样本优化了前处理方法，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
① 与传统的液相色谱-荧光法比较，LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，需要的样品量少。
②采用氘代标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差。
③本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
附图说明
图 1. （A）肌酐标准品水溶液的色谱图；（B）肌酐稀释2000倍的尿液中色谱图。
图2 电喷雾串联质谱中肌酐标准品的子离子扫描图（m/z 114）。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
一种尿液中肌酐的测定方法，其测试过程是尿液经稀释后直接引入LC-MS/MS***分析。
实例1：
1．仪器与试剂：安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1329A 自动进样器，G1311A 四元混合泵和G1316A 柱温箱；API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物***公司），配有电喷雾离子源（ESI）和analyst 1.5软件数据处理***；生化分析模块（日立集团，日本）。
肌酐购自美国药典委员会（St. Louis, MO，USA）；肌酐-d3（纯度:98%;同位素纯度:99%, Toronto Research Chemicals Inc.）作为氘带内标（IS）；甲醇和乙酸购自TEDIA company Inc.（Ohio, USA），所有的溶剂均为色谱纯。
2．样品处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min。离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜。取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL肌酐-d3（1 μg/mL），用纯水定容至刻度。
3．测定方法：吸取1，2，5，10，20，50，200，500和2000 ng/mL的标准溶液和稀释过滤后的样品各5 μL，注入LC-MS/MS***进行分离分析，测得样本中肌酐的含量。
实例2：如实施例1所述，留取37个尿液样本。测得尿液中肌酐的含量如表3所示。
表 3 24 h尿液中肌酐的含量水平（mg/mmoL）
| 序号 | 含量 | 序号 | 含量 | |
| 1 | 13333.33 | 15 | 10087.72 | |
| 2 | 12587.72 | 16 | 4008.77 | |
| 3 | 7706.14 | 17 | 11008.77 | |
| 4 | 9605.26 | 18 | 16008.77 | |
| 5 | 5337.72 | 19 | 5342.11 | |
| 6 | 4114.04 | 20 | 3114.04 | |
| 7 | 4236.84 | 21 | 2605.26 | |
| 8 | 13070.18 | 22 | 14429.82 | |
| 9 | 5438.60 | 23 | 7605.26 | |
| 10 | 2578.95 | 24 | 2048.25 | |
| 11 | 12587.72 | 25 | 11052.63 | |
| 12 | 8289.47 | 26 | 4013.16 | |
| 13 | 10789.47 | 27 | 8087.72 | |
| 14 | 13859.65 | 28 | 15000.00 |
Claims (5)
1.一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：
a、收集志愿者尿液；
b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min，离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜，取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL浓度为1 μg/mL的肌酐-d3，用纯水定容至刻度；
c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的肌酐标准工作溶液
d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的肌酐标准工作溶液，注入LC-MS/MS***，肌酐的线性回归方程为y=0.0106x+0.00615，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度，相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
2.根据权利要求1所述的尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：步骤b中的稀释过程依次加入的肌酐-d3和离心过滤后的尿液的体积分别为100 μL和5 μL。
3.根据权利要求1所述的尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：在步骤d中，所述的色谱分析条件采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱色谱柱，初始流动相体系选取50% 溶剂A（0.1% 乙酸水溶液）和50% 溶剂B（0.1% 乙酸甲醇溶液），分析时间为12 min，进样量为5 μL。
4.根据权利要求3所述的尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：采用色谱柱分析时，选取的洗脱条件：50%0.1% 乙酸水溶液和50%的0.1% 乙酸甲醇溶液等度洗脱，流动相流速为200 μL/min。
5.根据权利要求1所述的尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压为5000V, 雾化气为40 psi, 气帘气的量为30 psi, 辅助加热气的流速为40 psi, 离子源温度为480 oC，射入电压：10 V, 碰撞能：29 eV； 去簇电压：73 V，驻留时间：100 ms。
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