CN103808836B - 一种尿液中3-烷化腺嘌呤dna加合物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的测定方法其特征在于：其测试过程是24小时尿液在室温下解冻，混合均匀离心过滤，通过OasisMCX固相萃取小柱净化富集，混匀后引入LC-MS/MS***分析，可准确检测出尿液中3-MeA、3-EtA和3-HOEtA的含量水平。本发明为全新的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，采用氘代标准品作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差、串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。
Description
技术领域：
本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)DNA加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪（LC-ESI-MS/MS）测定尿液中3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)的方法。
背景技术：
3-烷化腺嘌呤是外源性化合物体内代谢生成的自由基与腺嘌呤结合后的产物。由于尿中内源性3-烷化腺嘌呤本底值低，又能较为准确的反映原型化合物的特性，因此作为生物监测指标广泛用于环境烷基化污染物的生物监测。据报道，尿液中3-烷化腺嘌呤与吸烟水平有较强的相关性，能够用于评价烟气中有害成分亚硝胺的接触水平。
目前，关于尿液中DNA加合物的分析检测方法的报道较多，Prevost等人在1996年报道了使用气相色谱-质谱法(GC-MS)检测3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤的方法。此方法需要样品化学衍生化前处理过程复杂费时，并且GC-MS法的灵敏度与液相色谱-串联质谱法相差甚远。目前提取、净化、检测尿液基质中3种烷基化加合物（3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤）的高通量分析方法尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的一种3-烷化腺嘌呤(3-甲基腺嘌呤3-MeA；3-乙基腺嘌呤3-EtA; 3-羟乙基腺嘌呤3-HOEtA)DNA加合物的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于尿液中3-烷化腺嘌呤的定性定量分析。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中, 所述混合内标为d3-3-MeA和 d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3-MeA为100 ng/ml, d5-3-EtA为2ng/ml；
固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水溶液活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液(47.5: 47.5: 5)洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析；
b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；
c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS***，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
色谱条件是：选取Waters HILIC色谱柱（150 mm x 2.1 mm，2.5 μm），流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5。洗脱条件：流动相A：乙腈溶液，pH 4.0，流动相B：10mM甲酸铵/水溶液，A:B为95:5，pH 4.0；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 μL，洗脱时间：0 ~ 20 min。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V；雾化气(Gasl)压力为344.5 kPa(50 psi)；气帘气(CUR)压力为206.7 kPa(30 psi)；辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi)；离子源温度(TEM)为500℃；去蔟电压(DP)为100 eV；碰撞能(CE)为30 eV；驻留时间为100 ms，监测离子对为3-MeA：150→123（定量离子对），150→108（定性离子对）；内标d3-3-MeA为153→126；3-EtA：164→136（定量离子对），164→119（定性离子对）；内标d5-3-EtA为169→137；3-HOEtA：180→136（定量离子对），180→119（定性离子对）；内标d5-3-EtA为169→137。
本发明具体的工艺过程进一步详述如下：
1、样品前处理
样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入混合内标100 μL（d3-N3-MeA,100 ng/Ml; d5-N3-EtA, 2ng/mL），用水浴锅调节温度到80℃。取超纯水稀释后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取选取Waters Oasis MCX（6 mL, 500 mg）小柱，预先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上样量为8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后1 mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析。
2、 LC-MS/MS测定
（1）LC-MS/MS条件
色谱条件：Waters HILIC (150 mm x 2.1 mm，2.5 μm)色谱柱，流动相A：乙腈溶液，pH 4.0（体积分数），流动相B：甲酸铵/水溶液（10mM），pH 4.0；流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3μL。洗脱条件：0~20min。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式；喷雾(IS)电压为5500 V；雾化气(Gasl)压力为344.5 kPa(50 psi)；气帘气(CUR)压力为206.7 kPa(30 psi)；辅助雾化气(Gas2)压力为310.0 kPa(45 psi)；离子源温度(TEM)为500℃；去蔟电压(DP)为100 eV；碰撞能(CE)为30 eV；驻留时间为40 ms。监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1，2，3 。
表 1 多反应监测模式下3-甲基腺嘌呤及其氘代内标的部分质谱参数
* 定量离子对．
表 2 多反应监测模式下3-乙基腺嘌呤及其氘代内标的部分质谱参数
* 定量离子对．
表 3 多反应监测模式下3-羟乙基腺嘌呤及其氘代内标的部分质谱参数
* 定量离子对．
（2）3-烷化腺嘌呤含量的测定
吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)，3-乙基腺嘌呤（3-EtA）,3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液3 μL，注入LC-ESI-MS/MS。得到3-烷化腺嘌呤的线性回归方程。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中3-烷化腺嘌呤含量。
（3）本发明方法的线性范围和检出限：
用乙腈配制系列标准曲线，3-甲基腺嘌呤(3-MeA)的标准曲线的点为10，20，40，60，100，120，150和180 ng/mL，线性相关系数为0.9993，3-乙基腺嘌呤标准曲线的点为0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5和5 ng/mL，3-乙基腺嘌呤的线性相关系数为0.9999，3-羟乙基腺嘌呤标准曲线的点为0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 ng/mL，线性相关系数为0.9995。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限，3-甲基腺嘌呤(3-MeA)，3-乙基腺嘌呤（3-EtA）,3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的检出限分别为0.04 ng/mL，0.019 ng/mL，0.023 ng/mL。
（4）本发明方法加标回收率和稳定性：
采取样品加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定5次，得到的方法的回收率和稳定性，结果见表4，表5。方法的回收率范围84.0 -110%,日内/日间稳定性均低于10%，证明方法的准确性和稳定性结果较好。
表4 尿液中3-烷化腺嘌呤回收率（n = 5）
表5 日间/日内稳定性
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液中3-烷化腺嘌呤的色谱条件进行了优化，并对LC -MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
① 与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于低含量的尿液中3-烷化腺嘌呤的测定。
② 本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及稳定性好的优点。
③本发明采用氘代标准品作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。
附图说明
图1尿液中3-烷化腺嘌呤的总离子流图。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
一种尿液中3-烷化腺嘌呤的测定方法，其测试过程是24小时尿液在室温下解冻，混合均匀离心过滤，通过C18固相萃取小柱净化富集，混匀后引入LC-MS/MS***分析。
实例1：
1. 仪器与试剂：
安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1367D 自动进样器，G 1312B 二元混合泵和G1316B 柱温箱；API 5500三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物***公司），配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.5软件数据处理***。
氨水为分析纯；甲酸铵、乙酸乙酯、甲醇均为色谱纯（美国TEDIA公司）；Oasis MCX 固相萃取柱（6 mL，美国Waters公司）。
3-甲基腺嘌呤，3-乙基腺嘌呤，3-羟乙基腺嘌呤购自加拿大TRC公司，氘代-3-甲基腺嘌呤，氘代-3-乙基腺嘌呤内标购自美国CIL实验室。
2．样品处理：
尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL内标（100ng/mL），用水浴锅调节温度到80℃。取超纯水稀释后的尿液置于10 mL固相萃取柱中。固相萃取选取Waters Oasis MCX（6 mL, 500 mg）小柱，预先用2 mL的甲醇，5 mL的水活化柱子，上样量为8 mL，用2 mL的10%的甲醇淋洗，然后1 mL乙酸乙酯溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水（47.5: 47.5: 5）洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶液溶解，供LC-MS/MS分离分析。
3．用乙腈配制系列标准曲线，3-甲基腺嘌呤(3-MeA)的标准曲线的点为10，20，40，60，100，120，150和180 ng/mL，线性相关系数为0.9993，3-乙基腺嘌呤标准曲线的点为0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5和5 ng/mL，3-乙基腺嘌呤的线性相关系数为0.9999，3-羟乙基腺嘌呤标准曲线的点为0.1，0.2，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 ng/mL，线性相关系数为0.9995。净化后的样品各3 μL，注入LC-MS/MS***进行分离分析，测得样本中3-烷化腺嘌呤的含量。
实例2：如实施例1所述，利用本研究建立的方法对20个尿液中的3-烷化腺嘌呤含量进行了检测,尿液中3-烷化腺嘌呤的含量见表6。
表6 尿液中3-烷化腺嘌呤的含量
| 序号 | 3-MeA含量/24h（μg） | 3-EtA含量/24h（μg） | 3-HOEtA含量/24h（μg） | 序号 | 3-MeA含量/24h（μg） | 3-EtA含量/24h（μg） | 3-HOEtA含量/24h（μg） |
| 1 | 5.72 | 108.4 | 228.8 | 11 | 25.64 | 955.4 | 120.7 |
| 2 | 13.16 | 417.4 | 364.2 | 12 | 16.48 | 142.9 | 295.9 |
| 3 | 21.75 | 313.0 | 345.6 | 13 | 25.88 | 781.6 | 106.2 |
| 4 | 10.12 | 237.3 | 211.5 | 14 | 28.45 | 939.3 | 332.9 |
| 5 | 6.73 | 546.7 | 726.1 | 15 | 26.87 | 399.5 | 323.2 |
| 6 | 27.73 | 277.3 | 144.7 | 16 | 28.45 | 636.0 | 153.3 |
| 7 | 63.14 | 216.6 | 696.8 | 17 | 24.58 | 494.8 | 154.0 |
| 8 | 12.87 | 245.3 | 281.7 | 18 | 69.58 | 572.5 | 747.0 |
| 9 | 77.35 | 246.7 | 172.6 | 19 | 29.38 | 220.7 | 185.7 |
| 10 | 45.06 | 301.8 | 282.3 | 20 | 18.03 | 421.6 | 194.4 |
Claims (3)
1.一种尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，即3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
a、样品前处理：尿液在室温状态下解冻并混合均匀，取4 mL尿液，加入4mL超纯水，加入100 μL混合内标，用水浴锅调节温度到75-85℃，取超纯水稀释至8 mL后的尿液置于固相萃取柱中；
固相萃取用Waters Oasis MCX固相萃取柱，预先用2 mL甲醇、5 mL水活化，上样量为8 mL，用2 mL 10％甲醇/水溶液淋洗，然后用1 mL乙酸乙酯淋洗，最后用甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液洗脱，收集洗脱液并于60 ℃下用氮气吹至干，然后用100 μL水溶解，供LC-MS/MS分离分析；
b、标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液；
c、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的3-甲基腺嘌呤(3-MeA)标准工作溶液、3-乙基腺嘌呤（3-EtA）标准工作溶液和3-羟乙基腺嘌呤（3-HOEtA）标准工作溶液，注入LC-MS/MS***，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；
选取Waters HILIC色谱柱，规格150 mm x 2.1 mm，2.5 μm，流动相体系选取A:乙腈和B: 10m mol/L甲酸铵/水溶液，A:B为95:5，流速0.25 mL/min；柱温25 °C；进样量3 μL，洗脱时间：0 ~ 20 min；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描方式；喷雾电压为5500 V；雾化气压力为344.5 kPa；气帘气压力为206.7 kPa；辅助雾化气压力为310.0 kPa；离子源温度为500℃；去蔟电压为100 eV；碰撞能为30 eV；驻留时间为100 ms，监测离子对为3-MeA：150→123定量离子对，150→108定性离子对；内标d3-3-MeA为153→126；3-EtA：164→136定量离子对，164→119定性离子对；内标d5-3-EtA为169→137；3-HOEtA：180→136定量离子对，180→119定性离子对；内标d5-3-EtA为169→137。
2.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：所述混合内标为d3-3-MeA和 d5-3-EtA混合溶液，其中d3-3-MeA为100 ng/ml, d5-3-EtA为2ng/ml。
3.根据权利要求1所述的尿液中3-烷化腺嘌呤DNA加合物的测定方法，其特征在于：所述甲醇/乙酸乙酯/氨水混合液的具体配比为47.5: 47.5: 5。
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