CN111393368A - 一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法和应用，所述茚并吡唑盐酸盐类衍生物具有式I所示结构：
Figure DDA0002498489100000011
其中，X为CH或N，n为1或2。本发明的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在抑制微管蛋白聚集的同时能够靶向肿瘤细胞信号通路，抑制cMet和Akt激酶的磷酸化，具有较好的抗肿瘤活性，并且该类化合物水溶性好，对减少毒副作用和防止耐药性等都有很重要的意义。

Description

一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化合技术领域，具体涉及一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
微管蛋白是抗肿瘤药物研究的有效靶点之一。微管蛋白抑制剂类药物已经成为一类主要的化疗药物，广泛用于临床各类肿瘤的治疗中。目前，临床上应用的微管抑制剂主要有以紫杉醇为代表的抑制微管蛋白解聚药物和以长春碱类为代表的抑制微管蛋白聚合药物。但这些药物存在一定的毒副作用，并在临床使用中出现耐药等问题。另外，这些药物水溶性差，在制剂中需要添加大量助溶剂。
比如，中国发明专利(CN104610149A)中公开了两个茚并吡唑类微管蛋白抑制剂N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-氨甲酰甲氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(化合物LL01)和N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟氨基甲酰甲氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(化合物LL02)，其对人肝癌HepG2细胞、人***癌PC3细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人白血病K562细胞具有较好的增殖抑制活性，能有效的抑制微管蛋白聚合。化合物LL01和化合物LL02抑制微管蛋白聚合IC50分别为4.62μM和5.33μM，但是发明人发现化合物LL01和化合物LL02仍存在水溶性差等问题。
Figure BDA0002498489080000011
信号通路在肿瘤细胞生长、增殖、侵袭和转移中起着重要的作用。其中，cMet在肿瘤的生存、生长、侵袭及转移中起着重要的作用，它通过激活下游效应分子诱导肿瘤细胞增殖***，黏附浸润，促进肿瘤血管形成，引起肿瘤的发生、发展、浸润与转移。cMet、Akt信号转导通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。阻断cMet、Akt等细胞信号通路的激活，可以有效抑制肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移，降低耐药性产生，并有效地增加化疗药物对癌细胞的敏感性。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物及其制备方法与应用，该类化合物具有微管蛋白抑制活性，并且能够同时靶向肿瘤细胞信号转导通路，抑制cMet和/或Akt激酶的磷酸化，具有较好的抗肿瘤活性，对耐药肿瘤细胞也具有较好的抑制活性，且具有较好的水溶性，对减少毒副作用和抗肿瘤多药耐药等具有重要意义。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供了一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其具有式I所示结构：
Figure BDA0002498489080000021
其中，X为CH或N，n为1或2。
具体包括以下结构：
Figure BDA0002498489080000031
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物的方法，其包括：以N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺为起始原料，与N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺发生Williamson成醚反应后，在乙酰氯和乙醇的混合溶液中，脱去叔丁氧甲酰基(Boc)，制备式I所示茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其中，X为CH，n为1。
所述合成路线如下所示：
Figure BDA0002498489080000032
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：
(1)将N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式1)溶于丙酮中，加入碳酸钾，搅拌5min后，加入N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺，70℃搅拌反应10h。加水淬灭反应，用乙酸乙酯提取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析，得N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式2)；
其中，N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺、N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺加入量的比为1.36g:1.77g。
(2)将乙酰氯加入乙醇中，搅拌15min后，加入到N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺中，反应20min，静置40min。抽滤，得盐酸-N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-(3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(化合物ID01)。
以及，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物的方法，其包括：以5-乙氧基-6-叔丁基二甲基硅氧基-1-茚酮为原料，经双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)处理后，与2-乙氧基-6-异硫氰酸吡啶酯反应后，再与水合肼反应环合，将吡唑上NH甲基化，得到茚并吡唑中间体N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式4)；该中间体脱去叔丁基二甲基硅基(TBS)保护基后，与N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺发生Williamson成醚反应后，在乙酰氯和乙醇的混合溶液中，脱去Boc保护，制备式I所示的茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其中，X为N，n为2。
所述合成路线如下所示：
Figure BDA0002498489080000041
在本发明的实施方式中，所述方法包括：
(1)将5-乙氧基-6-叔丁基二甲基硅氧基-1-茚酮(式3)溶于无水四氢呋喃中，-78℃预冷5min后，逐滴加入LiHMDS，搅拌2.5h后，自然升温至-45℃，加入2-乙氧基-6-异硫氰酸吡啶酯的四氢呋喃溶液。自然升室温，继续搅拌反应过夜。用饱和硫酸氢钾溶液调pH至中性，用二氯甲烷提取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析，得硫代甲酰胺中间体粗品。将其溶于二氧六环和乙醇的混合溶剂中，加入水合肼，55℃下搅拌反应20h。加水后，用乙酸乙酯提取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺；
其中，5-乙氧基-6-叔丁基二甲基硅氧基-1-茚酮、双(三甲基硅基)氨基锂、2-乙氧基-6-异硫氰酸吡啶酯、水合肼、加入量的比为300mg：1.76mL：317mg：0.35mL。
(2)将N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺溶于二氯甲烷中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，搅拌反应5min后，加入硫酸二甲酯，继续搅拌反应8h。加水后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，硅胶柱层析，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式4)；
其中，N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H，4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺、N,N-二异丙基乙胺、硫酸二甲酯加入量的质量比为200mg：0.17mL：0.10mL。
(3)将N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式4)溶于四氢呋喃中，加入四丁基氟化铵(TBAF)，搅拌1h。加水，过滤，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式5)；
其中，N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺、四丁基氟化铵加入量的质量比为120mg：110mg。
(4)将N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式5)溶于丙酮中，加入碳酸钾，搅拌5min后，加入N-叔丁氧羰基-3-溴丙胺，70℃搅拌反应10h。加水后，用乙酸乙酯提取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式6)；
其中，N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺、N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺加入量的比为90mg:116mg。
(5)将乙酰氯加入乙醇中，搅拌15min后，加入到N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(式6)中，反应20min。静置40min后，抽滤，得盐酸-N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-(3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(化合物ID02)。
在本发明的第三方面，提供了药物组合物，其包含上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物。
在本发明的第四方面，提供了一种药物制剂，其包含上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物和至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物或药物制剂中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂、防腐剂、粘合剂、填充剂等等。本发明所述药物组合物或药物制剂中还可以含有常用的赋形剂或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的，所述赋形剂包括但不局限于：磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糊精、淀粉、凝胶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐或聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体或者可由本领域技术人员根据实际情况能够确定的，所述载体包括但不局限于：生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它们的组合物；载体在药物组合物或药物制剂中的含量可以是1重量％-98重量％，通常大约占到80重量％。
本发明所述药物制剂可以为口服制剂和肠胃外给药制剂，可以为片剂、丸剂、胶囊剂或注射剂。
口服制剂比如片剂、胶囊和丸剂可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，***胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸；润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土；崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。
肠胃外给药制剂，液态剂型通常由化合物和一种消毒的载体制成。载体首选水。依照所选载体和药物浓度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成悬浮溶液，在制成注射用溶液时先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口瓶或安瓿中。
可使用本领域技术人员公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或制剂。除本文提到的以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，作者(英)R.C.罗(Raymond C Rowe)(美)P.J.舍斯基(Paul J Sheskey)。
在本发明的第四方面，提供了上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备微管蛋白抑制剂药物中的应用。所述微管蛋白抑制剂能够抑制微管蛋白的聚合。
本发明所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物除了具有较好的抑制微管蛋白聚合的活性外，相较于现有的微管蛋白抑制剂，具有改善的水溶性，水溶性大于1mg/mL(pH 7.4)，在抑制微管蛋白聚合的同时，能够抑制cMet和/或Akt激酶的磷酸化，毒副作用更小，不易耐药。
在本发明的第五方面，提供了上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、结肠癌。尤其地，所述肺癌为非小细胞肺癌，包括耐紫杉醇的非小细胞肺癌。
本发明的化合物对正常肝细胞具有较低的毒性，并且对于耐紫杉醇的人非小细胞肺癌A549细胞依然具有很强的增殖抑制活性，具有一定抗多药耐药作用。
在本发明的第六方面，本发明提供了上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抗肿瘤和抑制微管蛋白聚合的药物中的应用。
在本发明的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、结肠癌。尤其地，所述肺癌为非小细胞肺癌，包括耐紫杉醇的非小细胞肺癌。
在本发明的第七方面，提供了上述第一方面中所述茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抑制cMet和/或Akt激酶的磷酸化的药物或试剂中的应用。
在本发明的第八方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括将受试者施用治疗有效量的上述第一方面中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物或其药物组合物或药物制剂，所述癌症包括但不限于肝癌、肺癌、结肠癌。所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
本发明所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织***、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
所述治疗是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。
本发明化合物的最佳给药剂量和间隔是由化合物性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
相较于现有技术，本发明的有益效果包括但不限于：
(1)本发明的茚并吡唑盐酸盐类衍生物，相较于现有的微管蛋白抑制剂具有改善水溶性，水溶性大于1mg/mL(pH 7.4)，水溶性的改善对减少毒副作用和防止耐药性等都有很重要的意义，而且良好的水溶性更易于药用。
(2)本发明的茚并吡唑盐酸盐类衍生物为结构新颖的小分子微管蛋白抑制剂，对人肝癌HepG2细胞、人非小细胞肺癌A549细胞和人结肠癌HCT16细胞有很强的增值抑制活性，并且对于耐紫杉醇的人非小细胞肺癌A549细胞依然具有很强的增殖抑制活性，具有一定抗多药耐药作用。
(3)本发明的茚并吡唑盐酸盐类衍生物能够同时靶向肿瘤细胞信号通路，抑制cMet和Akt激酶的磷酸化。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中化合物ID01的微管蛋白聚合实验结果；
图2为实施例2中化合物ID02的微管蛋白聚合实验结果；
图3为实施例1中化合物ID01对于cMet/Akt激酶磷酸化影响的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1化合物ID01的制备
(1)将N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(1.36g，3.7mmol)溶于丙酮(30mL)中，加入碳酸钾(1.54g，7.4mmol)，搅拌反应5min，加入N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺(1.77g，7.4mmol)，70℃搅拌反应10h。加水100mL，乙酸乙酯提取(390mL)，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺1.35g，产率为71％。熔点：137-138℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.36(s,1H),7.29(s,1H),7.21(s,1H),7.06(t,J＝8.0Hz,1H),6.98(s,1H),6.89-6.71(m,2H),6.28(d,J＝8.0Hz,1H),4.19–4.02(m,4H),3.99(q,J＝6.7Hz,2H),3.96(s,3H),3.37(s,2H),3.14(q,J＝6.0Hz,2H),1.89–1.82(p,J＝6.0Hz,2H),1.38(s,9H),1.37-1.27(m,6H)。MS(ESI)calcd.for C29H39N4O5[M+H]+:523.3,found:523.1。
(2)将乙酰氯(2.5mL)加入乙醇(5mL)中，搅拌15min后，取4mL加入N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(110mg)中，反应20min，静置40min，抽滤，得白色固体87mg。收率91％。熔点：156-158℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.20(s,3H),7.43(s,1H),7.27(s,1H),7.13(t,J＝8.1Hz,1H),6.92(t,J＝2.2Hz,1H),6.83(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),6.41(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),4.20(t,J＝6.2Hz,2H),4.08(q,J＝7.0Hz,2H),4.03(s,3H),3.99(q,J＝7.0Hz,2H),3.42(s,2H),3.12-2.90(m,2H),2.16–2.03(p,J＝6.2Hz,2H),1.36(t,J＝7.0Hz,3H),1.32(t,J＝7.0Hz,3H)。HRMS(ESI)calcd.for C24H31N4O3[M+H]+:423.2391,found:423.2394。
实施例2化合物ID02的制备
(1)将5-乙氧基-6-叔丁基二甲基硅氧基-1-茚酮(300mg，0.98mmol)溶于无水四氢呋喃(10mL)中，–78℃预冷5min，逐滴加入LiHMDS(1.76mL,2.05mmol)，搅拌2.5h后，升温至–45℃，加入溶于无水四氢呋喃(8mL)中的2-乙氧基-6-异硫氰酸吡啶酯(317mg，1.76mmol)，缓慢升至室温，搅拌反应过夜。用饱和硫酸氢钾溶液调pH至中性，加水40mL,用二氯甲烷(180mL)萃取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，得硫代甲酰胺中间体327mg(327mg，0.70mmol)。将其溶于无水二氧六环和无水乙醇的混合溶剂(14mL，体积比：1:1)中，加入水合肼(0.35mL，5.40mmol)，55℃搅拌20h。加水50mL，用乙酸乙酯(240mL)提取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺200mg(200mg，0.43mmol)。将其溶于二氯甲烷中(6mL)，加入DIPEA(0.17mL，0.86mmol)，搅拌反应5min后，加入硫酸二甲酯(0.10mL，0.86mmol)，继续搅拌反应8h。加水20mL，用二氯甲烷(60mL)萃取，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺85mg，收率18％。熔点：147–148℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.88(s,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.20(s,1H),7.11(s,1H),6.90(d,J＝7.9Hz,1H),6.09(d,J＝7.9Hz,1H),4.22(q,J＝7.0Hz,2H),4.04(q,J＝7.0Hz,2H),3.91(s,3H),3.46(s,2H),1.36(t,J＝7.0Hz,3H),1.29(t,J＝7.0Hz,3H),1.00(s,9H),0.16(s,6H)。MS(ESI)calcd.for C26H37N4O3Si[M+H]+:481.3,found:481.5。
(3)将N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(120mg，0.25mmol)溶于四氢呋喃(8mL)中，加入四丁基氟化铵(110mg，0.50mmol)，搅拌反应1h。加水(40mL)后，析出固体。过滤，真空干燥，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺70mg，产率81％。熔点：201–202℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.86(s,1H),8.82(s,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.14(s,1H),7.12(s,1H),6.92(d,J＝7.9Hz,1H),6.09(d,J＝7.9Hz,1H),4.23(q,J＝7.0Hz,2H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),3.91(s,3H),3.42(s,2H),1.35(t,J＝7.0Hz,3H),1.29(t,J＝7.0Hz,3H)。MS(ESI)calcd.for C20H23N4O3[M+H]+:367.2,found:367.1。
(4)将N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(90mg，0.25mmol)溶于丙酮(10mL)中，加入碳酸钾(68mg，0.50mmol)，搅拌反应5min后，加入N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺(116mg，0.50mmol)，70℃搅拌反应10h。加水(30mL)，用乙酸乙酯提取(120mL)，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩、硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1-1:1)，得N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺70mg，产率为55％。熔点：155–156℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.89(s,1H),7.47(t,J＝7.9Hz,1H),7.29(s,1H),7.20(s,1H),6.92(d,J＝7.9Hz,1H),6.83(t,J＝5.2Hz,1H),6.09(d,J＝7.9Hz,1H),4.23(q,J＝7.0Hz,2H),4.16-4.02(m,4H),3.97(s,3H),3.45(s,2H),3.14(q,J＝6.4Hz,2H),1.86(p,J＝6.4Hz,2H),1.38(s,9H),1.34(t,J＝7.0Hz,3H),1.29(t,J＝7.0Hz,3H)。MS(ESI)calcd.forC28H38N5O5[M+H]+:524.3,found:524.2。
(5)将乙酰氯(2.5mL)加入乙醇(5mL)中，搅拌15min后，取2mL加入N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-(N-叔丁氧甲酰基-3-氨基丙氧基)-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺(30mg)中，搅拌反应20min。静置40min后，抽滤，得25mg白色固体。收率86％。熔点：230-231℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.17(s,3H),7.61(t,J＝8.0Hz,1H),7.43(s,1H),7.27(s,1H),6.90(d,J＝8.0Hz,1H),6.25(d,J＝8.0Hz,1H),4.28(q,J＝7.0Hz,2H),4.20(t,J＝6.1Hz,2H),4.09(q,J＝7.0Hz,2H),4.05(s,3H),3.53(s,2H),3.04-2.98(m,2H),2.11-2.00(p,J＝6.1Hz,2H),1.36(t,J＝7.0Hz,3H),1.32(t,J＝7.0Hz,3H)。HRMS(ESI)calcd.for C23H30N5O3[M+H]+:424.2343,found:424.2346。
实施例3抗肿瘤细胞增殖实验
1.实验药物：实施例1制备的化合物(记为化合物ID01)、实施例2制备的化合物(记为化合物ID02)和化合物LL01。
2、实验方法：
将人肝癌HepG2细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人结肠癌HCT16细胞、紫杉醇耐药A549/Tax细胞分别给予不同浓度的化合物ID01化合物(实施例1制备)、化合物ID02(实施例2制备)和化合物LL01，置于培养箱中孵育72h，用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定化合物对肿瘤细胞的抑制率。
3、试验结果见表1。由表1可看出，实施例1和实施例2制备的化合物对于测试的三株肿瘤细胞HepG2、A549、HCT116均有极强的抗增殖活性，明显优于化合物LL01，并对耐紫杉醇A549细胞依然有效，具有一定抗多药耐药作用。
表1.本发明化合物对不同细胞的抗增殖活性
Figure BDA0002498489080000131
a表示三次实验的平均值±标准偏差(SD)
实施例4微管蛋白聚合实验
1.实验药物：实施例1制备的化合物(记为ID01)、实施例2制备的化合物(记为ID02)、秋水仙碱和二甲基亚砜(DMSO)。
2.实验方法：
微管蛋白聚合实验根据Cytoskeleton公司的Tubulin Polymerization AssayKit说明书进行操作。
3.实验结果分别见图1和图2。由图1和图2可以看出，实施例1制备的化合物和实施例2制备的化合物均可以抑制微管蛋白聚合。化合物ID01和化合物ID02抑制微管蛋白聚合IC50分别为3.65μM和3.13μM，与LL01(4.62μM)和LL02(5.33μM)相比，抑制微管蛋白聚合的作用效果更为显著。
实施例5 cMet、Akt信号通路抑制实验
1.实验药物：实施例1制备的化合物(记为化合物ID01)和二甲基亚砜(DMSO)。
2.实验方法：
将人肝癌HepG2细胞分别给予不同浓度的化合物ID01(实施例1制备)，置37℃，5％CO2的培养箱中孵育24h，收集细胞并提取细胞样本全蛋白进行Western blot分析。20μg蛋白质用10％聚丙烯酰胺进行凝胶电泳。蛋白质转移到PVDF膜上，加入含5％脱脂奶粉的封闭液封闭1h。将膜放入含一抗(用western一抗稀释液稀释)的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜。洗膜，用化学发光法检测免疫反应蛋白。
3.实验结果见图3，由图3可以看出化合物ID01可以抑制cMet和AKT的磷酸化，而对cMet和AKT的表达没有直接抑制作用。
实施例6溶解度测试
1.实验药物：实施例1制备的化合物(记为化合物ID01)、实施例2制备的化合物(记为化合物ID02)和化合物LL01、LL02。
2.实验方法：
溶解度的测定：用DMSO将化合物配成浓度为10mg/mL的母液，用甲醇等倍稀释成5个浓度梯度的溶液，使用高效液相色谱(HPLC)测定不同浓度下的峰面积，建立标准曲线。取适量母液加到1mL缓冲溶液(pH＝7.4)中配制成饱和溶液，测定化合物饱和溶液的吸收峰面积，使用标曲方程，计算化合物的饱和溶解度。
3.实验结果见表2。由表2可看出化合物ID01和化合物ID02水溶性很好，与化合物LL01、LL02相比，水溶性显著提高。
表2.化合物的溶解度
Figure BDA0002498489080000141
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其具有式I所示结构：
Figure FDA0002498489070000011
其中，X为CH或N，n为1或2。
2.根据权利要求1所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其特征在于，所述化合物包括：
Figure FDA0002498489070000012
3.一种制备权利要求1或2所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物的方法，其包括：以N-(3-乙氧基苯基)-6-乙氧基-7-羟基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺为起始原料，与N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺发生Williamson成醚反应后，在乙酰氯和乙醇的混合溶液中，脱去叔丁氧甲酰基(Boc)，制备式I所示茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其中，X为CH，n为1。
4.一种制备权利要求1或2所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物的方法，其包括：以5-乙氧基-6-叔丁基二甲基硅氧基-1-茚酮为原料，经双(三甲基硅基)氨基锂处理后，与2-乙氧基-6-异硫氰酸吡啶酯反应后，再与水合肼反应环合，将吡唑上NH甲基化，得到茚并吡唑中间体N-(3-乙氧基-2-吡啶基)-6-乙氧基-7-叔丁基二甲基硅氧基-1-甲基-1H,4H-茚并[1,2-c]吡唑-3-胺；该中间体脱去叔丁基二甲基硅基保护基后，与N-叔丁氧甲酰基-3-溴丙胺发生Williamson成醚反应后，在乙酰氯和乙醇的混合溶液中，脱去Boc保护，制备式I所示的茚并吡唑盐酸盐类衍生物，其中，X为N，n为2。
5.药物组合物，其包含权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物。
6.药物制剂，其包含权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物和至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
7.权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备微管蛋白抑制剂药物中的应用；
优选地，所述微管蛋白抑制剂能够抑制微管蛋白的聚合。
8.权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠癌；
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌，包括耐紫杉醇的非小细胞肺癌。
9.权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抗肿瘤和抑制微管蛋白聚合的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠癌；
优选地，所述肺癌为非小细胞肺癌，包括耐紫杉醇的非小细胞肺癌。
10.权利要求1或2中所述的茚并吡唑盐酸盐类衍生物在制备抑制cMet和/或Akt激酶的磷酸化的药物或试剂中的应用。
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