CN111323580A - 一种免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
一种免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111323580A CN111323580A CN202010334578.6A CN202010334578A CN111323580A CN 111323580 A CN111323580 A CN 111323580A CN 202010334578 A CN202010334578 A CN 202010334578A CN 111323580 A CN111323580 A CN 111323580A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- quality control
- antibody
- control substance
- solution
- marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种免疫层析试纸条及其制备方法,所述免疫层析试纸条包括设在基底上的样品垫、结合垫和反应膜,结合垫上包被有第一标记物和第二标记物,第一标记物为目标物抗体I偶联于标记微球I的复合物,第二标记物为目标物抗体I和质控物I共同偶联于标记微球II的复合物,检测线包被有目标物抗体II,质控线包被有可特异性结合质控物I的质控物II。本发明的试纸条采用一种新的质控***,不仅消除了T线抗体对C线产生的干扰、常用阻断剂和常见干扰物的干扰,而且随着目标物浓度变化,T线、C线的信号都会随之变化,有效提高了检测的精密度,拓宽了线性检测范围。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术领域,具体涉及一种免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
免疫层析技术是一种出现于80年代初期的免疫分析方式,通常以条状纤维层析材料为固相,通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,通过抗原抗体结合的免疫反应原理,层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测线)通过酶反应或可检测的标记物而得到直观的实验结果。
随着免疫层析技术的发展,现在已经有可以用于定量检测的免疫层析试纸条。以免疫荧光双抗体夹心法检测的层析试纸条为例,在定量检测过程中,样本中待测的目标物与固化在结合垫上的标记抗体结合形成抗原抗体复合物,其在层析作用下沿着硝酸纤维素膜向前移动,被硝酸纤维素膜上检测线(T线)预先包被的另一株抗体捕获形成双抗体夹心复合物。双抗体夹心复合物和未反应的标记物质继续在层析的毛细作用力下往前涌动,未反应的标记物质部分被包被固定在质控线(C线)抗体捕获,形成另一复合物。样本中的待测物越多,检测线上的复合物积聚越多,检测到的荧光信号越强,通过免疫荧光检测仪,检测T线和C线上的信号大小,信号比值T/C反映被捕获的待测物数量,进而拟合计算出样本中待测物的浓度。
在定量检测的层析试纸条中,C线信号可指示检测试条中荧光标记物在NC膜上的流动性,试纸条所用的缓冲液体系、NC膜蛋白质固定,吸水垫吸收情况以及整个检测***反应的变化情况。C线对定量检测的结果起到校正作用,通过C线的校正可以使试条的检测结果更加精准,以符合定量检测的要求。
鼠源性抗体是目前商业化抗体中最常见的抗体形式,来源广泛,成本较低,并且特异性和稳定性好。故在传统的免疫层析试纸条中,往往在结合垫包被抗目标物的鼠源抗体、T线包被鼠源抗体、C线包被羊抗鼠抗体。由于现有工艺条件下NC膜固定抗体的能力有限,包被在NC膜上的T线、C线抗体都会有一部分的抗体随液体的流动而流动,导致T、C线相互产生干扰,因此无法实现定量检测。此外,由于市售的阻断剂大部分为鼠源性蛋白,过量使用时会与C线羊抗鼠抗体反应,降低C线信号值,使得T/C值与样本中待测目标物的浓度不成比例。因此,对于该类质控***,即使加入阻断剂也无法精确定量目标物浓度。
目前用于定量检测的免疫层析试纸条往往采用以下独立质控***:T线包被鼠源抗体、C线包被兔抗或鸡抗***,在结合垫上分别标记两种抗体(能识别目标物的鼠源抗体和能与C线抗体或抗原结合的抗原或抗体)。随着待测物浓度增加,T值信号增加,而C值信号基本不变。这种质控方式可避免传统免疫层析试纸条的缺点,增加T/C值稳定性,提高免疫层析试纸条的精密度和准确度。但由于其C线信号几乎不变,仅通过T值信号增加来改变T/C值,因而检测范围较小。
为了解决现有技术中存在的问题,本领域技术人员希望开发一种具有新的质控***的免疫层析试纸条,以增强免疫层析检测的准确性、灵敏度和检测范围,并具有良好的抗干扰性和稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫层析试纸条及其制备方法,该免疫层析试纸条既具有高精密度和准确度,还具有较宽的检测范围和良好的稳定性。
为此,本发明的第一方面提供一种免疫层析试纸条,所述免疫层析试纸条包括:基底和设在所述基底上的样品垫、结合垫、反应膜,所述样品垫、结合垫、反应膜依次搭接;
所述反应膜上设有互相间隔的检测线和质控线,所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫;
所述结合垫上包被有第一标记物和第二标记物;
所述第一标记物为目标物抗体I偶联于标记微球I的复合物,所述目标物抗体I可特异性结合待测的目标物;
所述第二标记物为目标物抗体I和质控物I共同偶联于标记微球II的复合物;
所述检测线包被有目标物抗体II;所述目标物抗体II可特异性结合目标物;
所述质控线包被有质控物II,所述质控物II可特异性结合所述质控物I,且所述质控物I或所述质控物II不与体系中其他物质发生识别或结合。
本发明所述“特异性结合”的含义符合本领域技术人员的常规理解,在此说明如下:在本发明所述的免疫层析试纸条检测体系中,所述的特异性结合不受是否为游离态的限制,即不要求特异性结合的双方为游离态。例如,所述目标物抗体II可特异性结合目标物,其含义包括以下情况:目标物已经结合了目标物抗体I,所述目标物抗体II仍可以特异性结合该目标物,形成“双抗体夹心”结构。
进一步,所述免疫层析试纸条还包括吸水垫,所述吸水垫搭接在所述反应膜远离所述结合垫的一端。
进一步,所述目标物抗体I为抗目标物的单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步,所述质控物I和质控物II选自以下组:
(i)质控物I和质控物II中一个为抗原,另一个为抗所述抗原的抗体;
(ii)质控物I为生物素化抗体,质控物II为亲和素,优选为链霉亲和素。
进一步,当所述质控物I和质控物II选自所述组(i)时,
所述目标物抗体I和目标物抗体II来自生物种属α;所述质控物I和质控物II分别来自与α不同的生物种属。
进一步,所述目标物抗体I和目标物抗体II来自鼠源,所述质控物I和质控物II的动物源各自独立地选自鸡源、兔源或羊源。
在具体实施方式中,所述质控物I和质控物II选自以下组:
质控物I为兔IgG抗体,质控物II为羊抗兔IgG抗体;
质控物I为羊抗兔IgG抗体,质控物II为兔IgG抗体;
质控物I为羊IgG抗体,质控物II为兔抗羊IgG抗体;
质控物I为兔抗羊IgG抗体,质控物II为羊IgG抗体;
质控物I为鸡IgY抗体,质控物II为兔抗鸡IgY抗体;
质控物I为兔抗鸡IgY抗体,质控物II为鸡IgY抗体;
质控物I为鸡IgY抗体,质控物II为羊抗鸡IgY抗体;
质控物I为羊抗鸡IgY抗体,质控物II为鸡IgY抗体。
进一步,所述标记微球I和标记微球II的粒径为10-1000nm,优选为40-500nm。
进一步,所述标记微球I和标记微球II各自独立地选自荧光微球、彩色微球、磁微球、量子点、上转换发光微球、胶体金、胶体硒、胶体碳、脂质体;优选地,所述荧光微球为时间分辨荧光微球。
进一步,所述样品垫和结合垫各自独立地选自玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布、玻纤与聚酯混合膜。
进一步,所述基底的材料选自聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)或聚苯乙烯(PS);和/或,
所述反应膜为硝酸纤维素膜。
本发明的第二方面,提供所述免疫层析试纸条的制备方法,包括:
将所述第一标记物和所述第二标记物包被在结合垫上;
将所述目标物抗体II包被在反应膜上形成检测线;
将所述质控物II包被在反应膜上形成质控线;
将所述样品垫、包被有第一标记物和第二标记物的结合垫、具有所述检测线和质控线的反应膜依次搭接并设于所述基底上,即制得所述免疫层析试纸条。
进一步,所述免疫层析试纸条还包括吸水垫,其制备方法还包括,将所述吸水垫搭接在具有所述检测线和质控线的反应膜远离结合垫的一端。
进一步,所述第二标记物的制备步骤包括:
制备目标物抗体I和质控物I的均匀混合溶液,作为溶液I;将标记微球II制成标记微球II溶液;将溶液I与标记微球II溶液混合均匀,制成含第二标记物的溶液。优选地,所述标记微球II经过预先活化处理。
由于微球标记反应速度很快,如果向标记微球II溶液分别加入目标物抗体I和质控物I,则无法保证每次制备得到的标记物的均一性和稳定性,所以在本发明的技术方案中先将目标物抗体I和质控物I充分混合均匀,再一同加入微球溶液中进行偶联。
进一步,所述目标物抗体I和质控物I的质量比为1:2-20,例如1:2、1:10、1:20。
进一步,所述标记微球II溶液中,标记微球II的浓度为50-1000μg/100μL,优选为150-500μg/100μL。
进一步,在溶液I与标记微球II溶液混合的步骤中,使目标物抗体I与质控物I的总量与标记微球II溶液的比例为30-200μg/500μL,例如30μg/500μL、、60μg/500μL、90μg/500μL、120μg/500μL、150μg/500μL、180μg/500μL、200μg/500μL;优选为100μg/500μL。
进一步,所述第一标记物的制备步骤包括:
将标记微球I制成标记微球I溶液;将目标物抗体I与标记微球I溶液混合均匀,制成含第一标记物的溶液。优选地,所述标记微球I经过预先活化处理。
进一步,所述标记微球I溶液中,标记微球I的浓度为50-1000μg/100μL,优选为150-500μg/100μL。
进一步,所述目标物抗体I与标记微球I溶液的比例为30-200μg/500μL,例如30μg/500μL、100μg/500μL、150μg/500μL、200μg/500μL;优选为120μg/500μL。
进一步,将所述第一标记物和所述第二标记物包被在结合垫上的步骤包括:
制备所述第一标记物和第二标记物的均匀混合溶液,作为溶液II;采用喷金或浸泡的方式,将所述溶液II附着所述结合垫上;对附着有所述溶液II的结合垫进行固化。
进一步,所述溶液II中,所述第一标记物和所述第二标记物的质量比为10:1-5,例如10:1、5:1、10:3、5:2、2:1;优选为5:1。
进一步,所述溶液II中,所述第一标记物和所述第二标记物的总浓度为0.05-5mg/ml,优选为0.1-0.5mg/ml。
进一步,所述固化的方式为烘干。
进一步,所述制备方法还包括封装步骤;在具体的实施方式中,所述封装步骤包括:将所述免疫层析试纸条裁剪为合适宽度后装入检测卡,将装有免疫层析试纸条的检测卡和干燥剂一同封装于铝箔袋内保存。
本发明的免疫层析检纸条采用了一种全新的内参质控***,原理如下:结合垫上固化了两种标记物,第一标记物上偶联有目标物抗体I,第二标记物上偶联有目标物抗体I和质控物I。加入样品后,样品通过毛细管作用,流经样品垫、结合垫、反应膜(NC膜)、吸水垫,其中,样品流经结合垫时,由于目标物可与目标物抗体I结合,形成了两种复合物:微球-目标物抗体I-目标物的复合物a,微球-目标物抗体I-目标物-质控物I的复合物b。
复合物a、复合物b及未反应的标记物继续向前移动,流经T线时,由于T线包被有目标物抗体II,这两种复合物又分别结合目标物抗体II,形成新的两种复合物:微球-目标物抗体I-目标物-目标物抗体II的复合物a’,微球-目标物抗体I-目标物-目标物抗体II-质控物I的复合物b’,复合物a’和b’在T线产生T线信号。
未反应的标记物继续向前移动,流经C线时,由于C线包被有质控物II,未反应的标记物形成微球-目标物抗体I-质控物I-质控物II复合物c’,复合物c’在C线产生C线信号。由于质控物I或质控物II不与体系中其他物质发生识别或结合,例如在具体实施方式中为生物素-亲和素体系,或非鼠源抗原抗体体系,避免了T线抗体对C线的干扰(因现有工艺制约,T线抗体不可避免会有少量流出),同时也避免了常见阻断剂、干扰物对C线信号的干扰。
此外,由本发明免疫层析试纸条的检测原理可知,随着目标物浓度的变化,T线和C线信号均会产生变化。例如随着目标物浓度增加,T线信号增强,同时由于更多的第二标记物被T线捕获,C线的信号减弱,从而拉开了T/C值的范围值,提高了检测的灵敏度,扩大了检测的线性范围。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的免疫层析试纸条不仅具有独立质控***的优点,即试纸条测试精密度较好,T线、C线信号不相互干扰,样本中的干扰物质和加入的阻断剂对C线几乎没有影响,因而提高试纸条测试准确性;进一步地,本发明还扩大了线性检测的范围:即随着待测物浓度的增加,T线信号增加,C线信号逐渐降低,从而拉开T/C值范围,提高了检测的灵敏度,扩大了检测范围,可获得良好的检测线性范围。
(2)本发明提供的免疫层析试纸条优选非鼠源抗体作为质控物,由于市售阻断剂大多数是鼠源性蛋白,两者不进行免疫反应,因此阻断剂不会和C线反应;血清中最常见的干扰物为人抗小鼠抗体(HAMA),不会与C线包被的非鼠抗多抗反应,因此抗干扰能力强。
(3)本发明所制备的标记物为微球缀合物,可长期保存不容易聚沉,抗加速稳定性好,提高层析试纸条稳定性;另外可以通过微调标记工艺中不同抗体量,以适应不同检测项目的检测灵敏度。
(4)本发明提供的试纸条与现有免疫层系检测***的兼容性好,方案可行易实现,不需要增加额外工艺步骤,不需要更改层析试纸条结构,不需要额外增加工艺设备和检测设备,不需要更改试纸条所用的缓冲液体系,即可方便快捷地应用本发明提供的试纸条进行检测。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本发明的限制。在附图中:
图1为本发明试纸条中第一标记物和第二标记物的示意图,1-标记微球I,2-标记微球II,3-目标物抗体I,4-质控物I;
图2为三种不同AFP试纸条T/C值与AFP(单位ng/mL)浓度关系;
图3为三种质控***T线信号值随着50℃加速天数的变化情况;
图4为三种质控***C线信号值随着50℃加速天数的变化情况;
图5为三种质控***T/C值随着50℃加速天数的变化情况。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式,然而应当理解,可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开,并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
本实施例1提供一种甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条,其结合垫上包被两种标记物,其中第二标记物标记有鼠单克隆抗体Ⅰ和兔IgG抗体,相应地,C线包被羊抗兔IgG抗体,具体制备方法如下:
(一)试剂与仪器
Proclin 300:阿拉丁
PVP:阿拉丁
海藻糖:阿拉丁
蔗糖:成都市科龙化工
BSA:Roche
铕离子荧光微球(粒径300nm,表面官能团为羧基):Bangs Labs
甲胎蛋白AFP抗体:Medix(5108)
甲胎蛋白AFP抗体:Artron(AFP-A51-Ab1)
羊抗鼠抗体:洛阳市百泰科生物
羊抗兔IgG抗体:杭州贤至生物
兔IgG抗体:杭州贤至生物
奥斯龙6614:上海杰一
玻纤CB08:上海金标
硝酸纤维素膜(NC膜):Sartorius CN140
塑料卡壳、吸水垫、聚氯乙烯PVC底板:上海金标
划膜仪、切条机:上海金标
(二)甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条制备
(1)NC膜制备
(1.1)将NC膜粘贴固定在PVC底板的中间部位;
(1.2)用包被缓冲液(20mM PB,pH7.4)分别稀释AFP鼠单克隆抗体Ⅱ(Medix 5108)至1.5mg/ml、羊抗兔IgG抗体至0.5mg/ml,用喷金划膜仪将AFP鼠单克隆抗体Ⅱ包被到NC膜上形成检测线(T线)、将羊抗兔IgG抗体包被到NC膜上形成质控线(C线);
(1.3)将NC膜置于烘箱37℃进行烘干4h,密封保存备用。
(2)样品垫预处理
(2.1)裁切样品垫:样品垫材质为CB08,裁切宽度19mm×300mm,样品垫处理液:20mM Tris-HCL、0.5%Tween-20、2%BSA、5%蔗糖、1.5%PVP、pH 8.5;
(2.2)将样品垫垫浸泡于样品垫处理液1h后取出,置于37℃烘箱中烘干4h,密封保存备用。
(3)结合垫预处理
(3.1)裁切结合垫:结合垫材质玻纤6614,裁切宽度10mm×300mm;
(3.2)结合垫处理液:20mMtris-HCL、BSA0.5%(wt/vol)、海藻糖2.0%(wt/vol)、蔗糖5%(wt/vol)、PVP 0.25%(wt/vol)、TW-20 0.05%(vol/vol)、PEG4000 0.5%(wt/vol)、Proclin300 0.01%(vol/vol),pH8.5。
(3.3)将结合垫浸泡于结合垫处理液2h后取出,置于37℃烘箱中干燥4h,密封保存备用。
(4)第二标记物制备
本步骤将AFP鼠单克隆抗体Ⅰ(Artron AFP-A51-Ab1)和兔IgG抗体共同偶联于标记微球,具体包括以下步骤:
(4.1)清洗微球:取100μL时间分辨微球(固含量1%)于2mL离心管内,用1mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)稀释,超声分散微球,离心机12000rpm离心20min,弃上清;
(4.2)活化微球:加入0.5mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)超声重悬微球,用MES缓冲液(50mM,pH5.5)分别配制Sulfo-NHS和EDC至10mg/mL,分别取5μL和3μL加入到微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床孵育15min,12000rpm离心20min,弃上清,即制得活化微球,将制得的活化微球用于步骤(4.3);
(4.3)标记鼠单克隆抗体Ⅰ溶液和兔IgG抗体:加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液分别配制鼠单克隆抗体Ⅰ溶液和兔IgG至1mg/mL溶液,按鼠单克隆抗体Ⅰ和兔IgG溶液的体积比1:2将两种抗体充分混匀后,取180μL加入到所述微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床反应2h(本步骤中两种抗体不能先后加入微球,需将抗体先混合均匀后同时加入到微球中);
(4.4)封闭微球:加入40μL BSA(质量分数10%,20mM,pH7.4 PB缓冲液稀释)封闭微球,37℃摇床反应2h,12000rpm离心20min,弃上清;
(4.5)保存微球:加入1mL微球清洗缓冲液(20mM Tris-HCL、0.9%NaCl(wt/vol)、0.1%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol)、pH8.0)超声重悬微球,12000rpm离心20min,弃上清,重复该步骤2次,最后加入0.5ml微球保存液(20mM Tris-HCl、1%BSA(wt/vol)、5%海藻糖(wt/vol)、5%蔗糖(wt/vol)、1%PVP(wt/vol)、0.05%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)超声重悬分散重悬微球,4℃密封避光保存。
(5)第一标记物制备
本步骤将AFP鼠单克隆抗体Ⅰ(Artron AFP-A51-Ab1)偶联于标记微球,具体步骤与步骤(4)相同,区别仅在于将(4.3)变更为:
加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液配制浓度为1mg/mL的鼠单克隆抗体Ⅰ溶液,取120μL加入到所述微球溶液,漩涡混匀,37℃摇床反应2h。
(6)结合垫制备
将步骤(4)制备的第二标记物、步骤(5)制备的第一标记物用微球稀释液(20mMTris-HCL、2.5%BSA(wt/vol)、15%海藻糖(wt/vol)、10%蔗糖(wt/vol)、0.2%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)进行稀释,其中第二标记物、第一标记物与微球稀释液的体积比为3:10:100,按3μL/cm浓度用喷金划膜仪喷于经步骤(3)处理好的结合垫上,置于烘箱37℃进行烘干12h,密封保存备用。
(7)试纸条组装
在聚氯乙烯PVC底板上依次搭接样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫,使NC膜上的T线较C线更靠近结合垫;各个功能区域相互搭接的宽度1-2mm,然后将PVC底板及贴附的材料切成宽度4mm的试纸条,并装入卡壳,卡壳上开有加样区和窗口测试区,将卡壳置铝箔袋中加干燥剂密封保存。
实施例2
本实施例2提供一种甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条,其结合垫上包被两种标记物,其中第二标记物标记有鼠单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY抗体,相应地,C线包被羊抗鸡IgY抗体,具体制备方法如下:
(一)试剂与仪器
铕离子荧光微球(粒径200nm,表面官能团为羧基):Bangs Labs
羊抗鸡IgY和鸡IgY:博茵生物
其余试剂原料及设备同实施例1
(二)甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条制备
(1)NC膜制备
(1.1)将NC膜粘贴固定在PVC底板的中间部位;
(1.2)用包被缓冲液(20mM PB,pH7.4)分别稀释AFP鼠单克隆抗体Ⅱ(Medix 5108)至1.5mg/ml、羊抗鸡IgY抗体至1.0mg/ml,用喷金划膜仪将AFP鼠单克隆抗体Ⅱ包被到NC膜上形成检测线(T线)、将羊抗鸡IgY抗体包被到NC膜上形成质控线(C线);
(1.3)将NC膜置于烘箱37℃进行烘干4h,密封保存备用。
(2)样品垫预处理
同实施例1
(3)结合垫预处理
同实施例1
(4)第二标记物制备
本步骤将AFP鼠单克隆抗体Ⅰ(Artron AFP-A51-Ab1)和鸡IgY抗体共同偶联于标记微球,具体包括以下步骤:
(4.1)清洗微球:取100μL时间分辨微球(固含量1%)于2mL离心管内,用1mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)稀释,超声分散微球,离心机12000rpm离心20min,弃上清;
(4.2)活化微球:加入0.5mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)超声重悬微球,用MES缓冲液(50mM,pH5.5)分别配制Sulfo-NHS和EDC至10mg/mL,分别取5μL和3μL加入到微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床孵育15min,12000rpm离心20min,弃上清,即制得活化微球,将制得的活化微球用于步骤(4.3);
(4.3)标记鼠单克隆抗体Ⅰ溶液和鸡IgY抗体:加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液分别配制鼠单克隆抗体Ⅰ溶液和鸡IgY至1mg/mL溶液,按鼠单克隆抗体Ⅰ和鸡IgY溶液的体积比1:20将两种抗体充分混匀后,取100μL加入到所述微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床反应3h(本步骤中两种抗体不能先后加入微球,需将抗体先混匀后同时加入到微球中);
(4.4)封闭微球:加入40μL BSA(质量分数10%,20mM,pH7.4 PB缓冲液稀释)封闭微球,37℃摇床反应2h,12000rpm离心20min,弃上清;
(4.5)保存微球:加入1mL微球清洗缓冲液(20mM Tris-HCL、0.9%NaCl(wt/vol)、0.1%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol)、pH8.0)超声重悬微球,12000rpm离心20min,弃上清,重复该步骤2次,最后加入0.5ml微球保存液(20mM Tris-HCl、1%BSA(wt/vol)、5%海藻糖(wt/vol)、5%蔗糖(wt/vol)、1%PVP(wt/vol)、0.05%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)超声重悬分散重悬微球,4℃密封避光保存。
(5)第一标记物制备
本步骤将AFP鼠单克隆抗体Ⅰ(Artron AFP-A51-Ab1)偶联于标记微球,具体步骤与步骤(4)相同,区别仅在于将(4.3)变更为:
加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液配制浓度为1mg/mL的鼠单克隆抗体Ⅰ溶液,取120μL加入到所述微球溶液,漩涡混匀,37℃摇床反应2h。
(6)结合垫制备
将步骤(4)制备的第二标记物、步骤(5)制备的第一标记物用微球稀释液(20mMTris-HCL、2.5%BSA(wt/vol)、15%海藻糖(wt/vol)、10%蔗糖(wt/vol)、0.2%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)进行稀释,其中第二标记物、第一标记物与微球稀释液的体积比为4:14:100浓度约0.28mg/mL,按3μL/cm浓度用喷金划膜仪喷于经步骤(3)处理好的结合垫上,置于烘箱37℃进行烘干12h,密封保存备用。
(7)试纸条组装
同实施例1。
实施例3
本实施例3提供一种总***特异性抗原TPSA荧光免疫层析试纸条,其结合垫上包被两种标记物,其中第二标记物标记有TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ和生物素化TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ,相应地,C线包被有链霉亲和素,具体制备方法如下:
(一)试剂与仪器
铕离子荧光微球(粒径200nm,表面官能团为羧基):Bangs Labs
总***特异性抗体TPSA抗体:赛图康1006
总***特异性抗体TPSA抗体:赛图康1005
生物素:Thermo
链霉亲和素:Roche
其余试剂原料及设备同实施例1
(二)总***特异性抗原TPSA荧光免疫层析试纸条制备
(1)NC膜制备
(1.1)将NC膜粘贴固定在PVC底板的中间部位;
(1.2)用包被缓冲液(10mM PB,pH7.4)分别稀释TPSA鼠单克隆抗体Ⅱ(郑州赛图康1005)至2.0mg/ml、链霉亲和素稀释至1.2mg/ml,用喷金划膜仪将TPSA鼠单克隆抗体Ⅱ包被到NC膜上形成检测线(T线)、将链霉亲和素包被到NC膜上形成质控线(C线);
(1.3)将NC膜置于烘箱37℃进行烘干4h,密封保存备用。
(2)样品垫预处理
同实施例1
(3)结合垫预处理
同实施例1
(4)生物素偶联TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ
(4.1)称取2mg生物素,用缓冲液(10mM PB,pH7.4)溶解混匀;
(4.2)用缓冲液(10mM PB,pH7.4)将TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ(郑州赛图康1006)稀释至2mg/mL;
(4.3)将生物素溶液加入到待标记的抗体溶液中,迅速混匀,室温放置1h,生物素与TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ的摩尔比为25:1;
(4.4)将标记好的蛋白放入透析袋,用缓冲液(10mM PB,pH7.4)透析多余的生物素,每3小时换一次透析液,透析三次,从透析袋中取出纯化好的蛋白,2~8℃保存待用。
(5)第二标记物制备
本步骤将TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ和生物素化TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ共同偶联于标记微球,具体包括以下步骤:
(5.1)清洗微球:取100μL时间分辨微球(固含量1%)于2mL离心管内,用1mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)稀释,超声分散微球,离心机12000rpm离心20min,弃上清;
(5.2)活化微球:加入0.5mL MES缓冲液(50mM,pH5.5)超声重悬微球,用MES缓冲液(50mM,pH5.5)分别配制Sulfo-NHS和EDC至10mg/mL,分别取5μL和3μL加入到微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床孵育15min,12000rpm离心20min,弃上清,即制得活化微球,将制得的活化微球用于步骤(4.3);
(5.3)标记TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ和生物素化TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ:加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液分别配制TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ溶液和生物素化TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ至1mg/mL溶液,按TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ和生物素化TPSA鼠单克隆抗体溶液的体积比1:10将两种抗体充分混匀后,取150μL加入到所述微球溶液中,漩涡混匀,37℃摇床反应2h(本步骤中两种抗体不能先后加入微球,需将抗体先混合均匀后同时加入到微球中);
(5.4)封闭微球:加入40μL BSA(质量分数10%,20mM,pH7.4 PB缓冲液稀释)封闭微球,37℃摇床反应2h,12000rpm离心20min,弃上清;
(5.5)保存微球:加入1mL微球清洗缓冲液(20mM Tris-HCL、0.9%NaCl(wt/vol)、0.1%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol)、pH8.0)超声重悬微球,12000rpm离心20min,弃上清,重复该步骤2次,最后加入0.5ml微球保存液(20mM Tris-HCl、1%BSA(wt/vol)、5%海藻糖(wt/vol)、5%蔗糖(wt/vol)、1%PVP(wt/vol)、0.05%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)超声重悬分散重悬微球,4℃密封避光保存。
(6)第一标记物制备
本步骤将TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ偶联于标记微球,具体步骤与步骤(5)相同,区别仅在于将(5.3)变更为:
加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液配制浓度为1mg/mL的TPSA鼠单克隆抗体Ⅰ溶液,取120μL加入到所述微球溶液,漩涡混匀,37℃摇床反应2h。
(7)结合垫制备
将步骤(5)制备的第二标记物、步骤(6)制备的第一标记物用微球稀释液(20mMTris-HCL、2.5%BSA(wt/vol)、15%海藻糖(wt/vol)、10%蔗糖(wt/vol)、0.2%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)进行稀释,其中第二标记物、第一标记物与微球稀释液的体积比为2:10:100浓度约0.2mg/mL,按3μL/cm浓度用喷金划膜仪喷于经步骤(3)处理好的结合垫上,置于烘箱37℃进行烘干12h,密封保存备用。
(8)试纸条组装
同实施例1的步骤(7)试纸条组装。
实施例4
本实施例4提供一种癌胚抗原CEA胶体金免疫层析试纸条,采用胶体金作为标记微球,其结合垫上包被两种标记物,其中第二标记物标记有CEA鼠单克隆抗体Ⅰ和兔IgG抗体,相应地,C线包被羊抗兔IgG抗体,具体制备方法如下:
(一)试剂与仪器
氯金酸、柠檬酸三钠、碳酸钾:阿拉丁
癌胚抗体CEA抗体:杭州贤至CEA-7A8
癌胚抗体CEA抗体:杭州贤至CEA-6D4
其余试剂原料及设备同实施例1
(二)癌胚抗原CEA胶体金免疫层析试纸条制备
(1)NC膜制备
(1.1)将NC膜粘贴固定在PVC底板的中间部位;
(1.2)用包被缓冲液(20mM PB,pH7.4)分别稀释CEA鼠单克隆抗体Ⅱ(杭州贤至CEA-6D4)至1.5mg/ml、羊抗兔抗体至1.5mg/ml,用喷金划膜仪将CEA鼠单克隆抗体Ⅱ包被到NC膜上形成检测线(T线)、将羊抗兔抗体包被到NC膜上形成质控线(C线);
(1.3)将NC膜置于烘箱37℃进行烘干4h,密封保存备用。
(2)样品垫预处理
同实施例1。
(3)结合垫预处理
同实施例1。
(4)胶体金制备
采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将质量百分浓度为1%的氯金酸溶液和质量百分浓度为1%的柠檬酸三钠溶液按体积比1:1混合并煮沸,制备浓度为0.01%的胶体金溶液;胶体金粒径约40nm,将制备得到的胶体金用于步骤(5)、步骤(6)。
(5)第二标记物制备
本步骤将CEA鼠单克隆抗体Ⅰ和兔IgG抗体共同偶联于标记微球,具体包括以下步骤:
加入0.2M碳酸钾溶液适量调整胶体金pH,加入经稀释的1mg/mL CEA鼠单克隆抗体Ⅰ(杭州贤至CEA-7A8)和1mg/mL兔IgG按体积比1:5混合抗体,旋涡混合均匀,保持2-8℃静置反应过夜,继续加入1%BSA,封闭1小时以上,以4℃、13000rpm离心20分钟,弃上清;用微球保存液(20mM Tris-HCl、1%BSA(wt/vol)、5%海藻糖(wt/vol)、5%蔗糖(wt/vol)、1%PVP(wt/vol)、0.05%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)超声重悬分散重悬胶体金,4℃密封避光保存。
(6)第一标记物制备
加入0.2M碳酸钾溶液适量调整胶体金pH,加入CEA鼠单克隆抗体Ⅰ(杭州贤至CEA-7A8),混合均匀,保持2-8℃静置反应过夜,继续加入1%BSA,封闭1小时以上,以4℃、3000rpm离心20分钟,弃上清;用微球保存液(20mM Tris-HCl、1%BSA(wt/vol)、5%海藻糖(wt/vol)、5%蔗糖(wt/vol)、1%PVP(wt/vol)、0.05%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)超声重悬分散重悬胶体金,4℃密封避光保存。
(7)结合垫制备
将步骤(5)制备的第二标记物、步骤(6)制备的第一标记物用稀释液(20mM Tris-HCL、2.5%BSA(wt/vol)、15%海藻糖(wt/vol)、10%蔗糖(wt/vol)、0.2%Tween-20(vol/vol)、0.05%Proclin-300(vol/vol),pH8.5)进行稀释,其中第二标记物、第一标记物与稀释液的体积比为5:20:100(浓度约为0.5mg/mL),按3μL/cm浓度用喷金划膜仪喷于经步骤(3)处理好的结合垫上,置于烘箱37℃进行烘干12h,密封保存备用。
(8)试纸条组装
同实施例1步骤(7)试纸条组装。
对比例1
本对比例提供一种甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条,其结合垫上只包被了第一标记物,其制备方法除以下区别外,同实施例1:
步骤(1)中的(1.2)变更为:用包被缓冲液(20mM PB,pH7.4)分别稀释AFP鼠单克隆抗体Ⅱ(Medix 5108)至1.5mg/ml、羊抗鼠抗体至2.0mg/ml,用喷金划膜仪将AFP鼠单克隆抗体Ⅱ包被到NC膜上形成检测线(T线)、将羊抗鼠抗体包被到NC膜上形成质控线(C线)。
不包含原步骤(4);原步骤(6)中,将第一标记物用微球稀释液进行稀释,其中第一标记物与微球稀释液的体积比为13:100。
对比例2
本对比例提供一种甲胎蛋白AFP荧光免疫层析试纸条,其结合垫上包被了第一标记物和兔IgG抗体微球,其制备方法除以下区别外,同实施例1:
步骤(4)中的(4.3)变更为:加入0.5mL PB标记缓冲液(20mM,pH7.4)超声重悬活化微球,制得微球溶液;用PB标记缓冲液配制兔IgG抗体至1mg/mL溶液,取60μL加入到所述微球溶液,漩涡混匀,37℃摇床反应2h。步骤(4)制备得到兔IgG抗体微球。
步骤(6)变更为:将步骤(4)制备的兔IgG抗体微球、步骤(5)制备的第一标记物用微球稀释液进行稀释,其中兔IgG抗体微球、第一标记物与微球稀释液的体积比为3:10:100(浓度约为0.23mg/ml),按3μL/cm浓度用喷金划膜仪喷于经步骤(3)处理好的结合垫上,置于烘箱37℃进行烘干12h,密封保存备用。
实验例1检测范围
本实验例对实施例1-4、对比例1-2制备得到的试纸条的检测范围进行测试。
实施例1-2、对比例1-2采用经过罗氏电化学发光仪检测的AFP质控品进行测试,浓度分别为2.8ng/ml、8.3ng/ml、14.5ng/ml、22.3ng/ml、56.2ng/ml,99.0ng/ml、222.1ng/ml、330.7ng/ml、399.8ng/ml、518.3ng/ml,每个浓度测试用荧光分析仪测试5条试纸条,并计算平均值。为便于比较,实施例1和对比例1-2的结果如表1和图2所示,实施例2的结果如表2所示。
表1实施例1、对比例1-2试纸条T线、C线信号值及T/C值
从表1和图2可知,随着AFP浓度增加,本发明内参质控***与对比例1的质控***类似,在500ng/mL以内T/C随着浓度的变化几乎成一条直线(R2>0.999),检测范围较宽;而对比例2在高值部分,T/C值在300ng/mL以上趋近于平缓,增值幅度较小,检测范围较小。
表2实施例2试纸条T线、C线信号值及T/C值
由表2可知,实施例2的试纸条在500ng/mL以内T/C随着浓度的变化几乎成一条直线(R2>0.999),具有较宽的检测范围。
实施例3采用经过罗氏电化学发光仪检测的TPSA质控品进行检测范围测试,实施例4采用经过罗氏电化学发光仪检测的CEA质控品进行检测范围测试,每个浓度测试用荧光分析仪测试5条试纸条,并计算平均值。实施例3检测的质控品浓度及检测结果见表3所示,实施例4检测的质控品浓度及检测结果见表4所示:
表3实施例3试纸条T线、C线信号值及T/C值
表4实施例4试纸条T线、C线信号值及T/C值
由表3、表4可知,实施例3、4制备得到试纸条均具有较宽的检测范围。
实验例2精密度
对实施例1-4、对比例1-2制备得到的试纸条的精密度进行测试。
对实施例1-2、对比例1-2的测试,采用AFP参考品的浓度分别为20ng/mL、100ng/mL,每个浓度点分别测试10条试纸条,分别计算T线、C线信号值及T/C值CV,为便于比较,实施例1和对比例1-2的结果见表5。
表5试纸条T线、C线信号值及T/C值的CV
从表5可得,通过比较本发明内参质控***、对比例1和对比例2的T线信号值、C线信号值、T/C值,本发明实施例1内参质控***层析试纸条精密度显著更好,不精密度≤6%,检测重复性效果更优,非常适合精确定量免疫层析产品。另外,实施例2制备得到的试纸条也具有良好的精密度,其不精密度CV≤8%(具体检测数值未记载于表5)。
对于实施例3的测试,采用TPSA参考品的浓度分别为2.5ng/mL、10ng/mL,每个浓度点分别测试10条试纸条,其不精密度CV≤7.2%,具有良好的精密度。
对实施例4的测试,采用CEA参考品的浓度分别为5ng/mL、100ng/mL,每个浓度点分别测试10条试纸条,其不精密度CV≤6.7%,具有良好的精密度。
实验例3加速稳定性
将实施例1-4、对比例1-2制备得到的试纸条分别装入带有干燥剂的铝箔袋,封装后放入50℃烘箱进行加速试验。实施例1-2采用测试AFP参考品的浓度约为50ng/mL,实施例3采用TPSA参考品的浓度为10ng/mL,实施例4采用CEA参考品的浓度为100ng/mL;每种试纸条测试5条并计算平均值。
实施例1、对比例1-2的层析试纸条在50℃加速60天的T/C值变化情况见图3-图5所示。
从图3-图5可得,本发明试纸条的内参质控***T线信号值、C线信号值随着加速天数的变化影响非常小,因此T/C比值趋于稳定;对比例1试纸条虽然T/C值变化很小,但是其T线信号值、C线信号值随着加速天数的增加,呈逐渐下降趋势,当测试低值浓度样本时,容易造成测试T线、C线信号偏差较大,测试结果偏离真实值;对比例2试纸条的T/C值变化较大。综上,本发明的层析试纸条的稳定性非常好,特别适合用于荧光层析定量产品。
另外,经测试,实施例2-4的试纸条在50℃加速60天的条件下也具有良好稳定性,实施例2在测试期间的信号值变化幅度为±10%,实施例3为±10%,实施例4为±7.4%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种免疫层析试纸条,其特征在于,所述免疫层析试纸条包括:基底和设在所述基底上的样品垫、结合垫和反应膜,所述样品垫、结合垫和反应膜依次搭接;
所述反应膜上设有互相间隔的检测线和质控线,所述检测线较所述质控线更靠近所述结合垫;
所述结合垫上包被有第一标记物和第二标记物;
所述第一标记物为目标物抗体I偶联于标记微球I的复合物,所述目标物抗体I可特异性结合待测的目标物;
所述第二标记物为目标物抗体I和质控物I共同偶联于标记微球II的复合物;
所述检测线包被有目标物抗体II;所述目标物抗体II可特异性结合目标物;
所述质控线包被有质控物II,所述质控物II可特异性结合所述质控物I,且所述质控物I或所述质控物II不与体系中其他物质发生识别或结合。
2.如权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述目标物抗体I为抗目标物的单克隆抗体或多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述质控物I和质控物II选自以下组:
(i)质控物I和质控物II中一个为抗原,另一个为抗所述抗原的抗体;
(ii)质控物I为生物素化抗体,质控物II为亲和素,优选为链霉亲和素。
4.如权利要求3所述的免疫层析试纸条,其特征在于,当所述质控物I和质控物II选自所述组(i)时,
所述目标物抗体I和目标物抗体II来自生物种属α;所述质控物I和质控物II分别来自与α不同的生物种属;
优选地,所述目标物抗体I和目标物抗体II来自鼠源,所述质控物I和质控物II的动物源各自独立地选自鸡源、兔源或羊源;
进一步优选地,所述质控物I和质控物II选自以下组:
质控物I为兔IgG抗体,质控物II为羊抗兔IgG抗体;
质控物I为羊抗兔IgG抗体,质控物II为兔IgG抗体;
质控物I为羊IgG抗体,质控物II为兔抗羊IgG抗体;
质控物I为兔抗羊IgG抗体,质控物II为羊IgG抗体;
质控物I为鸡IgY抗体,质控物II为兔抗鸡IgY抗体;
质控物I为兔抗鸡IgY抗体,质控物II为鸡IgY抗体;
质控物I为鸡IgY抗体,质控物II为羊抗鸡IgY抗体;
质控物I为羊抗鸡IgY抗体,质控物II为鸡IgY抗体。
5.如权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述标记微球I和标记微球II的粒径为10-1000nm,优选为40-500nm;
优选地,所述标记微球I和标记微球II各自独立地选自荧光微球、彩色微球、磁微球、量子点、上转换发光微球、胶体金、胶体硒、胶体碳、脂质体;更优选地,所述荧光微球为时间分辨荧光微球。
6.如权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述样品垫和结合垫各自独立地选自玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、无纺布、玻纤与聚酯混合膜;
优选地,所述基底的材料选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯;和/或,
所述反应膜为硝酸纤维素膜。
7.权利要求1-6任一项所述免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
将所述第一标记物和所述第二标记物包被在结合垫上;
将所述目标物抗体II包被在反应膜上形成检测线;
将所述质控物II包被在反应膜上形成质控线;
将所述样品垫、包被有第一标记物和第二标记物的结合垫、具有所述检测线和质控线的反应膜依次搭接并设于所述基底上,即制得所述免疫层析试纸条。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述第二标记物的制备步骤包括:
制备目标物抗体I和质控物I的均匀混合溶液,作为溶液I;将标记微球II制成标记微球II溶液;将溶液I与标记微球II溶液混合均匀,制成含第二标记物的溶液;
优选地,所述标记微球II经过预先活化处理;
优选地,所述目标物抗体I和质控物I的质量比为1:2-20;
优选地,所述标记微球II溶液中,标记微球II的浓度为50-1000μg/100μL,更优选为150-500μg/100μL;
优选地,在溶液I与标记微球II溶液混合的步骤中,使目标物抗体I与质控物I的总量与标记微球II溶液的比例为30-200μg/500μL。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述第一标记物的制备步骤包括:
将标记微球I制成标记微球I溶液;将目标物抗体I与标记微球I溶液混合均匀,制成含第一标记物的溶液;
优选地,所述标记微球I经过预先活化处理;
优选地,所述标记微球I溶液中,标记微球I的浓度为50-1000μg/100μL,更优选为150-500μg/100μL;
优选地,所述目标物抗体I与标记微球I溶液的比例为30-200μg/500μL,例如30μg/500μL、100μg/500μL、150μg/500μL、200μg/500μL;优选为120μg/500μL。
10.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,将所述第一标记物和所述第二标记物包被在结合垫上的步骤包括:
制备所述第一标记物和第二标记物的均匀混合溶液,作为溶液II;采用喷金或浸泡的方式,将所述溶液II附着所述结合垫上;对附着有所述溶液II的结合垫进行固化;
优选地,所述溶液II中,所述第一标记物和所述第二标记物的质量比为10:1-5;
优选地,所述溶液II中,所述第一标记物和所述第二标记物的总浓度为0.05-5mg/ml,更优选为0.1-0.5mg/ml;
优选地,所述固化的方式为烘干。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010334578.6A CN111323580B (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010334578.6A CN111323580B (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111323580A true CN111323580A (zh) | 2020-06-23 |
CN111323580B CN111323580B (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=71169818
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010334578.6A Active CN111323580B (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111323580B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112198310A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-01-08 | 南京申基医药科技有限公司 | 一种c反应蛋白和血清淀粉样蛋白a联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法 |
CN112763717A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-05-07 | 北京中海生物科技有限公司 | 一种金标探针复溶液,其制备方法及应用 |
CN113238044A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-08-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测卡 |
CN113588959A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-02 | 河南农业大学 | 一种用于检测T-2毒素的turn-on型试纸条及其制备方法 |
CN113933514A (zh) * | 2021-09-08 | 2022-01-14 | 清华珠三角研究院 | 一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用 |
CN116125068A (zh) * | 2023-02-10 | 2023-05-16 | 广州国家实验室 | 侧流层析免疫检测试剂盒及其应用 |
WO2024088374A1 (zh) * | 2022-10-27 | 2024-05-02 | 利多(香港)有限公司 | 用于检测样品中分析物的方法和免疫分析试条 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5580794A (en) * | 1993-08-24 | 1996-12-03 | Metrika Laboratories, Inc. | Disposable electronic assay device |
CN102192983A (zh) * | 2011-05-19 | 2011-09-21 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用 |
CN106771255A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 用于检测crp浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒 |
CN107102144A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-08-29 | 深圳市梓健生物科技有限公司 | 快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 |
CN108918884A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-30 | 广州海孚医疗科技有限公司 | 定量检测犬c反应蛋白的免疫层析试纸条及其制备方法 |
CN109459574A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-12 | 北京康思润业生物技术有限公司 | 用于检测糖化血红蛋白含量的免疫层析试纸条及包含其的免疫分析检测装置 |
CN109541234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-29 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 一种精确定量检测免疫层析试纸条的制备方法 |
CN110749739A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-04 | 海卫特(广州)医疗科技有限公司 | 皮质醇检测免疫试纸及其制备方法 |
CN110873800A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-10 | 海卫特(广州)医疗科技有限公司 | 糖化血红蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和试剂盒 |
CN110988338A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-04-10 | 南京市产品质量监督检验院 | 一种可定量检测多种基质中甲氧苄啶残留量的量子点试纸 |
CN111024948A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 东莞市东阳光诊断产品有限公司 | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 |
-
2020
- 2020-04-24 CN CN202010334578.6A patent/CN111323580B/zh active Active
Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5580794A (en) * | 1993-08-24 | 1996-12-03 | Metrika Laboratories, Inc. | Disposable electronic assay device |
CN102192983A (zh) * | 2011-05-19 | 2011-09-21 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用 |
CN106771255A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-31 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 用于检测crp浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒 |
CN107102144A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-08-29 | 深圳市梓健生物科技有限公司 | 快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 |
CN108918884A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-30 | 广州海孚医疗科技有限公司 | 定量检测犬c反应蛋白的免疫层析试纸条及其制备方法 |
CN109541234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-29 | 东莞东阳光科研发有限公司 | 一种精确定量检测免疫层析试纸条的制备方法 |
CN109459574A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-12 | 北京康思润业生物技术有限公司 | 用于检测糖化血红蛋白含量的免疫层析试纸条及包含其的免疫分析检测装置 |
CN110749739A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-02-04 | 海卫特(广州)医疗科技有限公司 | 皮质醇检测免疫试纸及其制备方法 |
CN110873800A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-10 | 海卫特(广州)医疗科技有限公司 | 糖化血红蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和试剂盒 |
CN110988338A (zh) * | 2019-12-09 | 2020-04-10 | 南京市产品质量监督检验院 | 一种可定量检测多种基质中甲氧苄啶残留量的量子点试纸 |
CN111024948A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 东莞市东阳光诊断产品有限公司 | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
赵露晶等: "基于上转磷光颗粒的AFP免疫层析定量检测", 《现代生物医学进展》 * |
钱存等: "荧光层析定量检测tPSA和fPSA方法研究", 《轻工学报》 * |
陈振华: "新型量子点纳米材料在免疫诊断领域的研发与应用", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112198310A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-01-08 | 南京申基医药科技有限公司 | 一种c反应蛋白和血清淀粉样蛋白a联合检测试纸条、试剂盒及试纸条的制备方法 |
CN112763717A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-05-07 | 北京中海生物科技有限公司 | 一种金标探针复溶液,其制备方法及应用 |
CN113238044A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-08-10 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种产气荚膜梭菌ε毒素快速定量检测卡 |
CN113933514A (zh) * | 2021-09-08 | 2022-01-14 | 清华珠三角研究院 | 一种基于时间分辨荧光微球的高灵敏度免疫检测方法及其应用 |
CN113588959A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-11-02 | 河南农业大学 | 一种用于检测T-2毒素的turn-on型试纸条及其制备方法 |
WO2024088374A1 (zh) * | 2022-10-27 | 2024-05-02 | 利多(香港)有限公司 | 用于检测样品中分析物的方法和免疫分析试条 |
CN116125068A (zh) * | 2023-02-10 | 2023-05-16 | 广州国家实验室 | 侧流层析免疫检测试剂盒及其应用 |
CN116125068B (zh) * | 2023-02-10 | 2023-10-27 | 广州国家实验室 | 侧流层析免疫检测试剂盒及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111323580B (zh) | 2023-04-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111323580B (zh) | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 | |
USRE29955E (en) | Method of detecting antigens or antibodies | |
KR920005963B1 (ko) | 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 | |
CN107907679A (zh) | 一种免疫层析试纸条及其制作方法与应用 | |
Prusak-Sochaczewski et al. | A new approach to the development of a reusable piezoelectric crystal biosensor | |
JPH08101197A (ja) | 制御された感度の免疫クロマトグラフィー検定 | |
CN111024948A (zh) | 一种免疫层析试纸条及其制备方法 | |
KR20120017884A (ko) | 자성입자의 항체고정화 방법 및 이를 이용해 제조되는 진단스트립, 진단키트 | |
Suri et al. | Development of piezoelectric crystal based microgravimetric immunoassay for determination of insulin concentration | |
CN102735842A (zh) | 一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测小分子物质的方法 | |
CN104777315A (zh) | 一种基于金磁微粒的化学发光免疫学检测s100的方法 | |
CN110749739A (zh) | 皮质醇检测免疫试纸及其制备方法 | |
ATE320604T1 (de) | Homogene nachweisverfahren zur bestimmung von subpopulationen eines analyten | |
CN110231488A (zh) | 一种基于羧基修饰多壁碳纳米管标记的试纸条生物传感器及使用方法 | |
CN107782898B (zh) | 一种荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法 | |
Zeng et al. | Quantitative immunochromatographic strip biosensor for the detection of carcinoembryonic antigen tumor biomarker in human plasma | |
WO2020067233A1 (ja) | イムノクロマト用試験片 | |
US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
US5043288A (en) | Immobilize molecular binding partners to contact activating supports | |
US9151753B2 (en) | Method and test strip for detection of residues | |
JP4783872B2 (ja) | 免疫測定方法 | |
CN116930489A (zh) | 层析试纸条、检测试剂盒及方法 | |
JP6464308B1 (ja) | イムノクロマト用試験片 | |
JPH1068730A (ja) | イムノクロマト法用試験用具 | |
JP2020052028A (ja) | イムノクロマト用試験片 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |