CN110988338A - 一种可定量检测多种基质中甲氧苄啶残留量的量子点试纸 - Google Patents
一种可定量检测多种基质中甲氧苄啶残留量的量子点试纸 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可定量检测多种食物基质如肉蛋奶中甲氧苄啶的量子点免疫层析试纸的建立方法，该试纸由样品垫、标记物垫、层析膜、缓冲垫相互重叠1‑2mm依次粘贴在PVC底板上制得，所述层析膜为承载有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线包被有甲氧苄啶抗原、质控线包被有DNP单克隆抗体；所述标记物垫上承载有偶联有甲氧苄啶抗体和偶连有BSA的DNP多抗的量子点。当样本中含有甲氧苄啶时，流经T线位置会与T线包被的抗原竞争结合标记物垫上的抗体，从而改变检测的荧光强度来进行定量检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种可定量检测多种食品基质中甲氧苄啶残留量的量子点免疫层析试纸。
背景技术
甲氧苄啶是一种合成的广谱抗菌剂，其抗菌谱和磺胺类药物相似但抗菌作用较磺胺类药物强，对多种常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有效，但对绿脓杆菌无效，缺点是单用易引起细菌耐药性，故主要与磺胺类试剂一起使用，作为联合抗菌剂药组成复方制剂，因此它又被称为磺胺增效剂，用于扩大抗菌谱，增强抗菌活性。随着磺胺类药物在兽药中的不合理的使用，甲氧苄啶等抗菌增效剂也应用越来越广泛。农业部235号公告中明确规定了甲氧苄啶的限量要求，但食品动物不同，限量要求不同，对检测的要求也较高，因此为了加强对动物性食品中次类药物的监控，建立一种准确定量、快速、方便的甲氧苄啶残留量检测方法很有必要。
目前针对甲氧苄啶残留的检测方法有很多，法检方面主要为高效液相色谱、液相色谱与质谱联用、毛细管电泳分析法等为代表的大型仪器检测法，其灵敏度高，但需要使用大型仪器，针对不同基质处理复杂，人员要求较高；快速检测方面以胶体金试纸条为代表的传统快速检测方法，操作简便、用时较短，但甲氧苄啶检测基质复杂，传统试纸条抗基质干扰能力低、对于提取剂含有冰醋酸、乙醇等物质材料易受损等局限性，且仅能针对特定食品基质开发单一的试剂盒进行定性检测；以化学发光免疫法为代表的新型检测方法，检测灵敏度高，结果易观察，但过程较复杂，生产成本较高。因此，针对检测基质多样，且限量要求复杂的情况，理应开发一种多种食品基质都适用且针对奶制品灵敏度高的简单快速、可准确定量的检测方法。量子点免疫层析技术是以量子点作为示踪标志物应用于免疫层析法中，它一方面利用了量子点的独特荧光作为观测信号，具有灵敏度高、快速的优点，另一方面利用了免疫层析技术的简便、特异性强、费用低等优点结合于一体，用于精准的定量检测各食品基质中甲氧苄啶的含量。目前国内对快速定量检测甲氧苄啶的新技术研究较少，将量子点与检测技术、食品基质的适应性相结合的研究较少，本方法的建立具有很大的创新性，适用于大批量筛查原材料中甲氧苄啶的含量，对快检技术的发展具有一定的推动作用。
发明内容
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一种可以检测多种食品基质中甲氧苄啶残留量的量子点免疫层析试纸，量子点作为一种新型的电子纳米荧光材料，较少应用于食品检测中，需要研究相关技术进行配适。通过研究活性材料与量子点标记结合技术，减少食品基质和前处理试剂对量子点以及活性材料的影响，在通过活性材料固定研究、浓度优化研究、原辅材料处理方法筛选等一系列技术，建立一种精准的定量检测甲氧苄啶残留量的量子点免疫层析方法，以期减少不同种类食品基质和前处理试剂对量子点检测的干扰，进一步提高其处理方法的简便性，实现简便精准的快检操作。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测食品中甲氧苄啶的量子点免疫层析试纸，由样品垫、标记物垫、层析膜、缓冲垫相互重叠1-2mm依次粘贴在PVC底板上制得，所述层析膜为承载有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；其中，所述检测线包被有甲氧苄啶抗原、质控线包被有DNP单克隆抗体；所述标记物垫上承载有偶联有甲氧苄啶抗体和DNP-BSA的量子点。
所述层析膜粘贴在PVC底板上，缓冲垫粘贴在层析膜一侧，相互重叠部分为1～1.5mm；所述标记物垫和样品垫粘贴在层析膜另一侧，相互重叠部分为1～1.5mm，所有部分均紧密粘贴在PVC底板上。
进一步地，所述样品垫选用棉浆纸，所述缓冲垫和标记物垫选用玻璃纤维素膜。
进一步地，所述偶联有甲氧苄啶抗体和DNP-BSA的量子点是将活化后的量子点依次与甲氧苄啶抗体、DNP-BSA进行偶联后，加入酪蛋白溶液封闭得到。
上述层析试纸的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备标记物垫：
1)向玻璃纤维素膜滴加第一处理试剂，烘干，得到预处理的玻璃纤维素膜；
2)取100μL 10mg/mL的量子点原液，超声分散；
3)量子点微球活化，取50μL分散后的量子点原液，与450μL 0.05M pH6.0的MES缓冲液混匀，加入3μL 50mg/mL的EDC混匀，加入3μL 75mg/mL的NHS混匀，垂直混匀0.5h；
4)重悬，将步骤3)得到的混合液12000rp离心5min，弃上清，加入500μL 0.02MpH7.0的MOPS重悬，超声分散；
5)抗体偶联：向步骤4)得到的分散液中加入40μg甲氧苄啶抗体，混匀偶联1h，再加入50μg DNP-BSA，偶联1小时；
6)封闭：向步骤5)得到的混合液加入5μL 10％乙醇胺混匀后，再加入500μL 5％酪蛋白溶液，室温垂直混匀以封闭多余位点；
7)重悬：将步骤6)得到的混合液12000prm离心5min，加入500μL量子点稀释液定容到1mg/mL，超声分散，4℃保存；
8)稀释：将步骤7)得到的量子点-抗体稀释到0.5mg/mL，超声分散，备用；
9)将稀释好的量子点-抗体稀释液加入0.05％胭脂红喷到预处理的玻璃纤维素膜上，烘干，得到标记物垫；
步骤2，向配制好的T线包被液按0.5mg/mL加入甲氧苄啶抗原、向配制好的C线包被液按1mg/mL加入DNP单克隆抗体，分别喷至硝酸纤维素膜制备T线和C线，烘干，制得层析膜；
步骤3，向玻璃纤维素膜滴加第二处理试剂，烘干，制得缓冲垫；
步骤4，向棉浆纸滴加第三处理试剂，烘干，制得样品垫；
步骤5，将样品垫、标记物垫、层析膜、缓冲垫组装，即得。
进一步地，所述第一处理试剂是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入5％蔗糖、0.3％PVPK-30、1％Tween-20、0.2％Proclin-300后制得。
进一步地，所述第二处理试剂是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入0.3％PVPK-30、1％Triton X-100、0.2％Proclin-300后制得。
进一步地，所述第三处理试剂是向0.05M pH8.5的Tris-Base缓冲溶液中加入5％海藻糖、0.8％Tween-20、3.2mM EDTANa2、0.2％酪蛋白后制得。
进一步地，所述T线包被液是向0.2M pH8.0的Hepes缓冲溶液中加入2％蔗糖和8％甲醇后制得。
进一步地，所述C线包被液是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入8％甲醇、2％蔗糖、0.5％BSA、0.1％Proclin-300后制得。
进一步地，所述量子点稀释液是向0.1M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入15％蔗糖、0.5％Tween-20、3％BSA、1％甘露醇、0.1％Proclin-300后制得。
本发明的试纸用于定量检测食品中甲氧苄啶的含量，采用量子点(纳米上转荧光物质)作为示踪物质，灵敏度高特异性强，采用免疫层析的方法反向竞争法进行检测：T线包被一定浓度的甲氧苄啶抗原，C线作为质控先线包被有特定的鼠单抗体，量子点偶联甲氧苄啶抗体和相关鼠抗DNP抗体通过喷金仪均匀分布在标记物垫上，当原料中含有甲氧苄啶时，流经T线位置会与T线包被的抗原竞争结合标记物垫上的抗体，从而改变检测的荧光强度来进行定量检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.较传统胶体金检测试剂盒灵敏度高，稳定性好，可实现精准定量检测，较法检所用仪器方法，简便快速，操作简单，适用于大批量筛查食品原料，可满足现有要求。
2.通过一系列技术探索和优化，可实现奶制品原料无前处理直接样本上样检测，肉制品蛋类简单破碎后含一定量冰醋酸溶剂处理后上样，前处理简单，基质效益小。
3.经过一系列技术研发和配适，可满足肉蛋奶等多种食品基质可准确定量的要求。
附图说明
图1为实施例2中以奶基质建立的检测甲氧苄啶标准曲线。
图2为实施例2中其他基质建立的检测甲氧苄啶标准曲线。
图3为实施例2中以奶基质建立的检测甲氧苄啶回归曲线。
图4为实施例2中其他基质建立的检测甲氧苄啶回归曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
定量检测食品原料中甲氧苄啶的量子点免疫层析试纸的制备：
1、试剂及原辅材料
辅材：硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维素膜，PVC底板，棉浆纸。
NC膜：承载T/C线活材。
缓冲垫(玻璃纤维素膜)：处理试剂：0.05M pH为8.0的Tris-Base缓冲溶液+0.3％PVPK-30+1％Triton X-100+0.2％Proclin-300防腐剂溶液。每10cm*30cm面积均匀添加处理试剂15mL，放置37℃烘箱24h。
样品垫(棉浆纸)：0.05M pH为8.5的Tris-Base缓冲溶液+5％海藻糖+0.8％Tween-20+3.2mM EDTANa2+0.2％酪蛋白，每10cm*30cm面积均匀添加处理试剂20mL，放置45℃烘箱24h。
标记物垫(玻璃纤维素膜，与缓冲垫的玻璃纤维素膜密度不同)：0.05M pH为8.0的Tris-Base缓冲溶液+5％蔗糖+0.3％PVPK-30+1％Tween-20+0.2％Proclin-300防腐剂溶液每10cm*30cm面积均匀添加处理试剂16mL，放置37℃烘箱24h。
标记试剂：0.02M MOPS缓冲液pH＝7.0；0.05M MES缓冲液pH＝6.0；1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；10％酪蛋白溶液；10％乙醇胺溶液。
包被液：
T线：0.2M Hepes缓冲液pH8.0+8％甲醇+2％蔗糖；
C线：0.05M pH为8.0的Tris-Base缓冲溶液+8％甲醇+2％蔗糖+0.5％BSA+0.1％Proclin-300。
量子点-抗体稀释液：0.1M TB pH8.0+15％蔗糖+0.5％Tween-20+3％BSA+1％甘露醇+0.1％Proclin-300。
抗体：甲氧苄啶抗体(标记所用)。
抗原：DNP-BSA(标记所用)。
2、实验方法和步骤
2.1配制包被液
T线包被液：0.2M Hepes 8.0+2％蔗糖+8％甲醇
C线包被液：0.05M TB 8.0+8％甲醇+2％蔗糖+0.5％BSA+0.1％Proclin-300
2.2膜制备，各种抗体制备1条30cm
1)包被液配制
C线包被物：1mg/mL DNP单抗固定化
T线包被物：0.5mg/mL甲氧苄啶抗原固定化
2)划膜
0.6μL/cm喷量，37℃烘箱烘干16-24小时
2.3量子点标记活性材料
制备步骤约各需要抗体40μg(甲氧苄啶抗体/DNP-BSA)
1)取100μL量子点原液(10mg/mL)超声2min，检测并记录粒径分散系数(标准粒径<400nm，分散系数<0.1)；
2)量子点微球活化：取50μL检测后的量子点原液(10mg/mL)+450μL pH6.0的0.05MMES缓冲液混匀，加入3μL EDC(50mg/mL)，混匀，加入3μL NHS(75mg/mL)混匀，垂直混匀0.5h。
3)重悬：12000rpm 5min离心，弃上清；加500μL 0.02M MOPS 7.0重悬，超声分散2min；检测并记录粒径分散系数(标准粒径<400nm，分散系数<0.1)；
4)抗体偶联：加入40μg甲氧苄啶抗体，混匀偶联1h，再加入50μg DNP-BSA，偶联1小时；
5)封闭：加入5μL 10％乙醇胺混匀后，加500μL 10％酪蛋白溶液，室温垂直混匀以封闭多余位点0.5h；
6)重悬：12000prm离心5min,加入500μL量子点稀释液定容到1mg/mL，超声分散；检测并记录粒径分散系数(标准粒径<400nm，分散系数<0.1)，4度保存；
7)稀释：量子点-抗体稀释到0.4mg/mL，超声分散，检测并记录粒径分散系数(标准粒径<400nm，分散系数<0.1)；
8)喷标记物垫：使用喷金仪将稀释好的量子点-抗体稀释液喷到处理后的标记物垫上。
加入0.05％的胭脂红；
浓度0.4mg/mL，喷量4μL/cm；
喷金仪相关系数，喷头位置：X＝5，Y＝9，Z＝7；标记物垫摆放位置，喷量4μL/cm；
9)烘干：45℃烘16-24h。
实施例2
定量检测食品原料中甲氧苄啶的量子点免疫层析试纸的应用
1、标准品的配制：称取一定量甲氧苄啶标准物质，用成分为pH 7.0Tris-HCl缓冲液、5％冰醋酸、5％酪蛋白、2％聚乙二醇、2％二甲基甲酰胺、0.2％Proclin-300的前处理试剂稀释至1μg/mL，再配制成浓度为5、10、50、100、200、500ng/mL系列的标准工作液，检测奶基质的标准工作液则用空白新鲜牛奶稀释配制成浓度为500、200、100、50、10、5ng/mL相同浓度，分别进行上样，对各自的荧光值进行检测，以标准工作液各浓度为横坐标(ng/mL)，检测线T和质控线C的荧光检测值的比值为纵坐标，以四参数的拟合方式，其他基质和奶基质标准曲线分别如图1和图2所示。
2、定量检测：根据不同样品中甲氧苄啶含量不同，竞争残留在T线抗原量的不同所得到检测荧光强度的不同，使用相关检测机器将荧光信号转换为发光值数字，计算T/C值，绘制标准曲线，检测样本时，根据T/C值进行反算，从而对样本中的甲氧苄啶含量进行定量检测。
3、以牛奶为检测基质时，以大量正常牛奶样本进行混合，作为零值样本，然后将零值样本上样20份本发明层析试纸条，记录测试值，将20个测试值的T/C求平均值X和标准偏差SD，然后以X-2SD代入标准曲线方程计算出的浓度即为最低检测限，经实验得知，本发明检测试纸条的灵敏度为：2ng/mL；以肉类和蛋需前处理的基质时，以前处理溶液为零值样本，按照相同的实验操作进行验证，本发明检测试纸条的灵敏度为：4ng/mL。
4、奶制品基质时，取接近线性范围上限的高值添加样牛奶样本按一定比例稀释为7种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限。其浓度为800、400、200、100、50、10、5ng/mL，其他基质如畜肉取高值样本粉碎前处理试剂稀释或添加制成高值样本再用前处理试剂处理稀释成1000、500、200、100、50、10、5ng/mL 7个浓度点，按上述实验步骤进行操作，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值带入标准曲线得到检测浓度与实际浓度做线性比较，奶制品基质的线性相关系数R2为0.9983，其他基质的线性相关系数R2为0.9972。线性曲线如图3和图4所示。
奶制品基质中检测浓度与实际浓度实验结果
其他基质中检测浓度与实际浓度实验结果
5、精密性：以牛奶基质进行精密度实验检测，使用浓度为10ng/mL和200ng/mL的甲氧苄啶牛奶质控品作为样本按照上述实验步骤进行检测，各重复测定3次，用标准偏差和平均值的比值计算其T/C的CV值，CV值＜10％。
6、准确度(回收实验)
以牛奶为基质进行准确度实验，用新鲜正常牛奶，加入甲氧苄啶标准工作液，配制200、50、10ng/mL高、中、低三种不同浓度的加标液，每个浓度各检测10次，做加标回收试验，结果为甲氧苄啶的回收率86.8％～117.77％。具体实验数据如下：
由以上结果可知，本发明的试纸灵敏度高，稳定性好，可实现精准定量检测，而且简便快速，操作简单，适用于大批量筛查食品原料，可满足现有要求。
Claims (9)
1.一种可定量检测多种基质中甲氧苄啶残留量的量子点试纸，由样品垫、标记物垫、层析膜、缓冲垫相互重叠1-2mm依次粘贴在PVC底板上制得，所述层析膜为承载有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，其特征在于：所述检测线包被有甲氧苄啶抗原、质控线包被有DNP单克隆抗体；所述标记物垫上承载有偶联有甲氧苄啶抗体和DNP-BSA的量子点。
2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于：所述偶联有甲氧苄啶抗体和DNP-BSA的量子点是将活化后的量子点依次与甲氧苄啶抗体、DNP-BSA进行偶联后，加入酪蛋白溶液封闭得到。
3.权利要求1所述的层析试纸的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，制备标记物垫：
1）向玻璃纤维素膜滴加第一处理试剂，烘干，得到预处理的玻璃纤维素膜；
2）取100 μL 10mg/mL的量子点原液，超声分散；
3）量子点微球活化，取50μL分散后的量子点原液，与450μL 0.05M pH6.0的MES缓冲液混匀，加入3μL 50 mg/mL的EDC混匀，加入3μL 75 mg/mL的NHS混匀，垂直混匀0.5h；
4）重悬，将步骤3）得到的混合液12000rp离心5min，弃上清，加入500μL 0.02M pH7.0的MOPS重悬，超声分散；
5）抗体偶联：向步骤4）得到的分散液中加入40μg甲氧苄啶抗体，混匀偶联1 h，再加入50 μg DNP-BSA，偶联1 小时；
6）封闭：向步骤5）得到的混合液加入5μL 10%乙醇胺混匀后，再加入500μL 10% 酪蛋白溶液，室温垂直混匀以封闭多余位点；
7）重悬：将步骤6）得到的混合液12000prm离心5 min，加入500μL量子点稀释液定容到1mg/mL，超声分散， 4℃保存；
8）稀释：将步骤7）得到的量子点-抗体稀释到0.4mg/mL，超声分散，备用；
9）将稀释好的量子点-抗体稀释液加入0.05% 胭脂红喷到预处理的玻璃纤维素膜上，烘干，得到标记物垫；
步骤2，向配制好的T线包被液按0.5 mg/mL加入甲氧苄啶抗原、向配制好的C线包被液按1mg/mL加入DNP单克隆抗体，分别喷至硝酸纤维素膜制备T线和C线，烘干，制得层析膜；
步骤3，向玻璃纤维素膜滴加第二处理试剂，烘干，制得缓冲垫；
步骤4，向棉浆纸滴加第三处理试剂，烘干，制得样品垫；
步骤5，将样品垫、标记物垫、层析膜、缓冲垫组装，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述第一处理试剂是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入5%蔗糖、0.3%PVPK-30、1% Tween-20、0.2% Proclin-300后制得。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述第二处理试剂是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入0.3%PVPK-30、1%Triton X-100、0.2% Proclin-300后制得。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述第三处理试剂是向0.05M pH8.5的Tris-Base缓冲溶液中加入5%海藻糖、0.8% Tween-20、3.2mM EDTANa2、0.2%酪蛋白后制得。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述T线包被液是向0.2M pH8.0的Hepes缓冲溶液中加入2%蔗糖和8%甲醇后制得。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述C线包被液是向0.05M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入8%甲醇、2%蔗糖、0.5%BSA、0.1% Proclin-300后制得。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述量子点稀释液是向0.1M pH8.0的Tris-Base缓冲溶液中加入15%蔗糖、 0.5% Tween-20、3%BSA、1%甘露醇、0.1% Proclin-300后制得。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200410 |