CN111321105A - 利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力所用的培养基，包括YEPD活化培养基、SM一级种子培养基和GlcNAc‑SM二级种子培养基。本发明还同时提供了利用上述培养基制备提高酵母抑制果实病害效力的制剂的方法，包括以下步骤：菌株活化；扩大培养；离心分离，用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得制剂。本发明还同时提供了上述制剂的用途：用于防治梨果实青霉病害。

Description

利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力的方法

技术领域

本发明涉及的是果实采后病害防治技术领域，更具体的是一种通过N-乙酰-D-氨基葡萄糖提高海洋红冬孢酵母对梨果实病害防治效力的生物防腐保鲜技术。

背景技术

随着生活水平的提高，民众的膳食结构、消费观念都产生了明显的变化。对水果的产量和质量要求都在不断提高。同时，“绿色”、“有机”、“无公害”等标签也成为了消费者关注的点。

真菌病害是引起果蔬采后巨大损失的主要原因之一。其中果实的青霉病是最重要的病原真菌之一，而且扩展青霉还能产生真菌毒素，从而导致严重的食品安全问题。在越来越意识到化学制剂滥用会导致严重环境和健康问题的今天，利用拮抗酵母抑制果实采后真菌型病害，作为一种安全而且环境友好的新型生物防病保鲜技术，近年来受到了国内外广泛的关注。但是目前采后生防酵母的抑菌效力与化学杀菌剂相比仍有较大的差距，因此迫切需要进一步深入研究生防酵母抑制果实病害的机理，以进一步提高其抑菌效力。

中国发明授权专利《酶类降解棒曲霉素的方法》，专利号ZL201410065286.1，公开了一种基于海洋红冬孢酵母的酶类降解棒曲霉素的方法。中国发明授权专利《基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液及其用途》，专利号ZL 201410085393.0，公开了一种基于γ-氨基丁酸结合生防酵母的生物保鲜液，所述拮抗酵母包括红冬孢酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell and Tallman。中国申请专利《通过诱导抗性来抑制果实采后病害的方法及所用制剂》，申请号201610522546.2，公开了一种通过诱导抗性来抑制果实采后病害的制剂，该制剂是由海洋红冬孢酵母细胞壁和水组成。中国申请专利《含有生防酵母的用于控制柑橘采后病害的化学杀菌剂》，申请号201310224105.0，公开了一种含有生防酵母的用于控制柑橘采后病害的化学杀菌剂，所述生防酵母为红冬孢酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell and Tallman。中国申请专利《基于红冬孢酵母和果实激发子活性的柑橘生物保鲜剂》，申请号201110112540.5，公开了一种由红冬孢酵母悬浮液、赤霉素/激动素、水杨酸、生长素和水组成的柑橘生物保鲜剂。中国申请专利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制备方法和用途》，申请号200610155062.5，公开了一种可以有效抑制链格孢、灰葡萄孢、扩展青霉、指状青霉、多毛孢等多种果蔬采后主要真菌病害的海洋红冬孢酵母。

上述涉及到的海洋红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman是一株保藏于英国国际真菌研究所(International Mycological Institute)国际农业与生物中心基因资源保藏中心(CABI Genetic Resource Collection)的酵母，保藏号为IMI394084。从上述专利可以看出，红冬孢酵母具有较大的应用潜力，且已经有了研究者通过添加激发子对该拮抗酵母进行生理调控，从而达到扩大针对病原菌生防效力的目的。

N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)是单糖葡萄糖的酰胺衍生物。它是介于葡萄糖胺和乙酸之间的一种二级酰胺。在许多生物***中均有重要意义。是微生物细胞壁中的构成部分。此外，N-乙酰氨基葡萄糖还具有还原性，在体内具有许多重要的生理功能，例如抗炎，抗肿瘤和抗氧化剂。它可以减少软骨基质的破坏，是治疗骨关节炎和类风湿关节炎的有效药物。此外，N-乙酰氨基葡糖在食品，化学和化妆品工业中有广泛的应用，例如食品抗氧化剂，婴儿，幼儿食品添加剂和糖尿病甜味剂等。近年来国际上的研究表明，GlcNAc代谢在生物体，包括酵母等微生物中，除了作为结构分子外，还涉及重要的生理功能，特别是作为信号分子和营养(感受)分子的作用。

中国发明授权专利《一种纯化N-乙酰氨基葡萄糖的方法》，专利号ZL201710038401.X，提供了一种采用电渗析法脱盐除杂纯化N-乙酰氨基葡萄糖的方法。中国发明授权专利《一种提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法》，专利号ZL 201610592555.9，公开了一种通过发酵过程中向发酵液中流加甜菜碱溶液提高N-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。中国发明授权专利《甲壳素制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法》，专利号ZL201610384090.8，公开了一种甲壳素制备N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，包括溶解、过滤、降解、析晶、过滤、清洗、干燥共计7个工艺步骤。中国申请专利《N-乙酰氨基葡萄糖胶囊制剂及其制备方法》，申请号201910846210.5，公开了一种N-乙酰氨基葡萄糖胶囊制剂及其制备方法，属于药物制剂技术领域。中国申请专利《一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用》，申请号201810302095.0，公开了一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。中国申请专利《一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法》，申请号201910790130.2，公开了一种提高发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率的方法。中国申请专利《N-乙酰氨基葡萄糖在蜂蜜制品中的应用及包含N-乙酰氨基葡萄糖的蜂蜜制品》，申请号201510412636.1，公开了人群实验中效果显著的N-乙酰氨基葡萄糖作为添加剂在蜂蜜制品中的应用，及包含N-乙酰氨基葡萄糖的新型蜂蜜制品。中国申请专利《N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备防治***药物及保健品中的应用及药物》，申请号201810193361.0，提供了一种N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备防治***药物及保健品中的应用及药物，属于医药领域。中国申请专利《N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备治疗骨科疾病的药物中的应用及药物、保健品》，申请号201810198767.8，提供了一种N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备治疗骨科疾病的药物中的应用及药物、保健品，涉及医药领域。中国申请专利《N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备防治脑萎缩药物及保健品中的应用及药物》，申请号201810193362.5，供了一种N-乙酰-D-氨基葡萄糖在制备防治脑萎缩药物及保健品中的应用及药物，属于医药领域。

作为一种食品级的添加剂，N-乙酰氨基葡萄糖工业程度从制备到应用都已经想当成熟，也是一种公认安全、对人体有一定保健作用的物质。所以针对它的开发利用有相当的研究和应用价值。

但是，目前尚未N-乙酰-D-氨基葡萄糖用于酵母培养基来提高酵母生物活性的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高生防酵母对果实病害防治效力的方法，采用本发明中所提供的培养基能诱导提高生防酵母(海洋红冬孢酵母IMI 394084)对果实病害防治效力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力所用的培养基：包括YEPD活化培养基、SM一级种子培养基和GlcNAc-SM二级种子培养基；

YEPD活化培养基为：蛋白胨(20±0.5)g、酵母粉(10±0.5)g、葡萄糖(20±0.5)g、琼脂(20±0.5)g，加水定容至1000mL，灭菌后，得YEPD活化培养基；

SM一级种子培养基为：葡萄糖(10±0.5)g、硫酸铵(5±0.1)g、磷酸氢二钾(2±0.1)g、硫酸镁(3±0.1)g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得SM一级种子培养基。

GlcNAc-SM二级种子培养基为：N-乙酰氨基葡萄糖1g加入水溶解后过0.22μm滤膜灭菌所得液，再加入葡萄糖(10±0.5)g、硫酸铵(5±0.1)g、磷酸氢二钾(2±0.1)g、硫酸镁(3±0.1)g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得GlcNAc-SM二级种子培养基。

说明：

N-乙酰氨基葡萄糖1g中加入的水的量至少能使得N-乙酰氨基葡萄糖溶解。

本发明还同时提供了利用上述培养基制备提高酵母抑制果实病害效力的制剂的方法，以下步骤：

(1)菌株活化

于(28±1)℃，海洋红冬孢酵母(作为生防酵母)于YEPD活化培养基上静置培养30～48h，并在相同条件下重复传代培养一次；

(2)扩大培养

将步骤(1)所得的酵母以1％(体积％)的接种量接种到SM一级种子培养基中，并在(200±50)rpm、(28±1)℃的培养条件下培养(24±1)h；之后以2％(体积％)的接种量接种到GlcNAc-SM二级种子培养基中，在上述相同培养条件下培养(24±1)h；

(3)离心分离

将步骤(2)所得的菌液离心后水洗(从而去除培养基)；用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得制剂。

作为上述方法的改进：海洋红冬孢酵母是保藏编号为IMI 394084的海洋红冬孢酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman。

作为上述方法的进一步改进，步骤(3)为：将步骤(2)所得的菌液以3000×g的速度离心5min，并用灭菌蒸馏水水洗三次从而去除培养基；利用血球板计数法计数并用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得到制剂。

本发明还同时提供了上述方法制备而得的制剂的用途：用于防治梨果实青霉病害。

本发明具有如下技术优势：

1、选择的激发子N-乙酰氨基葡萄糖是食品级添加剂，因此具有绿色环保的技术优势。

2、GlcNAc仅用0.1％的使用量进一步提高原本就有生防效果的拮抗酵母的抑制病害能力，操作简单，拥有较高性价比，且避免了化学杀菌剂带来的负面影响。

3、一级种子培养基、二级种子培养基将传统的实验室YEPD培养基进行改良，用常见的、廉价的无机盐硫酸铵5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁3g、硫酸锌0.005g代替原本的有机部分酵母粉10g和蛋白胨20g，并将葡萄糖用量减半，在保证酵母生物量和生长速度的前提下，提供了一种更具有经济效益的培养基。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。

图1为不同浓度GlcNAc诱导的红冬孢酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为第4天贮藏情况。其中图(a)为梨果实发病率，图(b)为病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图2为不同低浓度GlcNAc诱导的红冬孢酵母对梨果实青霉病的抑制效果；结果为第4天贮藏情况。其中图(a)为梨果实发病率，图(b)为病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图3为不同诱导培养时间R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果；结果为第4天贮藏情况。其中图(a)为梨果实发病率，图(b)为病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

图4为单物质GlcNAc处理和R.paludigenum处理对梨果实青霉病的控制效果；结果为第3天贮藏情况。其中图(a)为梨果实发病率，图(b)为病斑直径。不同字母代表差异显著性(P＝0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、诱导提高生防酵母对果实病害防治效力的制剂的制备方法，所用培养基为如下三种：

YEPD活化培养基为：蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水定容至1000mL，灭菌后倒板，得YEPD活化培养基；

SM一级种子培养基为：葡萄糖10g、硫酸铵5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁3g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得SM一级种子培养基；

GlcNAc-SM二级种子培养基为：N-乙酰氨基葡萄糖1g加入10ml水溶解后过0.22μm水系滤膜灭菌后所得液，再加入葡萄糖10g、硫酸铵5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁3g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得GlcNAc-SM二级种子培养基。即，GlcNAc-SM二级种子培养基中，N-乙酰氨基葡萄糖的含量为0.1％。

上述培养基的灭菌为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min。

制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)、菌株活化

Rhodosporidium paludigenum IMI 394084在YEPD活化培养基传代2代，即：

于28℃下，取一接种环的Rhodosporidium paludigenum IMI 394084于培养皿(体积约15ml)内的YEPD活化培养基上静置培养48h，并在相同条件下重复传代培养一次；得活化后酵母；

2)、扩大培养

将步骤1)所得的活化后酵母以1％(体积％)的接种量接种到SM一级种子培养基中，并在200rpm、28℃的培养条件下培养24h；所得的培养物再以2％(体积％)的接种量接种到GlcNAc-SM二级种子培养基中，并在相同培养条件下培养24h，得菌液；

3)、离心分离

将步骤2)所得的菌液以3000×g的速度离心5min，并用灭菌蒸馏水水洗三次去除培养基；利用血球板计数法计数并用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得到制剂。

对比例1、零浓度的N-乙酰氨基葡萄糖：

将实施例1的GlcNAc-SM二级种子培养基中N-乙酰氨基葡萄糖的含量由0.1％改成0(即，同SM培养基)，其余等同于实施例1；得制剂。

对比例2、高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖

将实施例1的GlcNAc-SM二级种子培养基中N-乙酰氨基葡萄糖的含量由0.1％分别改成0.5％、1.0％、2.0％，其余等同于实施例1；分别得不同的制剂。

对比例3、低浓度的N-乙酰氨基葡萄糖

将实施例1的GlcNAc-SM二级种子培养基中N-乙酰氨基葡萄糖的含量由0.1％分别改成0.001％、0.01％，其余等同于实施例1；分别得不同的制剂。

对比例4、不同培养时间

将实施例1于GlcNAc-SM二级种子培养基中的培养时间由24h分别改成：48h、72h和96h，其余等同于实施例1；分别得不同的制剂。

实验1、不同浓度N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)诱导培养R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料

梨品种：水晶梨

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃活化7天备用。

2、处理

(1)梨果实预处理：选取表皮完整无损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(体积％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出后用自来水冲洗干净，洗去残留在梨表面的次氯酸钠，晾干备用。

(2)用高压灭菌后的打孔器在果实表面打孔，直径约3mm，深度约2mm。用移液枪加入30μl的10⁷细胞/ml R.paludigenum(分别为实施例1和对比例1、对比例2的采用0、0.1％、0.5％、1.0％、2.0％GlcNAc-SM培养基制备而得的制剂)，以等量的无菌水作为对照CK。

(3)室温(25℃)静置晾干2小时后，在每个伤口处均接入1×10⁴孢子/ml扩展青霉P.expansum菌悬液30μl，处理完毕后在室温下(25℃)贮藏，并用PE保鲜膜密封作保湿处理，放到恒温(25℃)恒湿的房间，定时观察并记录结果，进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一个处理组，共3个重复，实验重复两次。

不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)诱导培养R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果如图1所示。

图1中横坐标代表以下各处理：

CK：灭过菌的蒸馏水；

SM：浓度为0％GlcNAc时制备而得的制剂；

0.1％GlcNAc：浓度为0.1％GlcNAc时制备而得的制剂；

0.5％GlcNAc：浓度为0.5％GlcNAc时制备而得的制剂；

1.0％GlcNAc：浓度为1.0％GlcNAc时制备而得的制剂；

2.0％GlcNAc：浓度为2.0％GlcNAc时制备而得的制剂。

3、结果

第四天的结果如图1，在红冬孢酵母原本就有一定生防作用的基础上，0.1％浓度的N-乙酰氨基葡萄糖诱导培养后，效果又有了显著提升，分别比对照和无添加的培养基有了显著降低。在病斑直径的结果上，也表现出了这一趋势。对照、SM组和0.1％浓度实验组的平均病斑直径分别为16.11mm、4.70mm和1.76mm。而相对较高的几个诱导浓度，并没有表现出显著的优势。可见在探究的所有浓度中，0.1％这个浓度的激发子反而比较有效果。

实验2、不同低浓度N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)诱导培养R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料

梨品种：水晶梨

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃活化7天备用。

2、处理

(1)梨果实预处理：选取表皮完整无损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(体积％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出后用自来水冲洗干净，洗去残留在梨表面的次氯酸钠，晾干备用。

(2)用高压灭菌后的打孔器在果实表面打孔，直径约3mm，深度约2mm。用移液枪加入30μl的10⁷细胞/ml R.paludigenum(分别为实施例1、对比例1、对比例3的采用0、0.001％、0.01％、0.1％GlcNAc-SM培养基制备而得的制剂)，以等量的无菌水作为对照CK。

(3)室温(25℃)静置晾干2小时后，在每个伤口处均接入5×10⁴孢子/ml扩展青霉P.expansum菌悬液30μl，处理完毕后在室温下(25℃)贮藏，并用PE保鲜膜密封作保湿处理，放到恒温(25℃)恒湿的房间，定时观察并记录结果，进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一个处理组，共3个重复，实验重复两次。

低浓度N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)诱导培养R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果如图2所示。

图2中横坐标代表以下各处理：

CK：灭过菌的蒸馏水；

SM：浓度为0％GlcNAc时制备而得的制剂；

0.001％GlcNAc：浓度为0.001％GlcNAc时制备而得的制剂；

0.01％GlcNAc：浓度为0.01％GlcNAc时制备而得的制剂；

0.1％GlcNAc：浓度为0.1％GlcNAc时制备而得的制剂。

3、结果

结果如图2，第四天记录的发病率和病斑直径还是表现出了相同的趋势，在培养时加入了低剂量GlcNAc诱导后，红冬孢对梨果实上的青霉病控制能力都有了不同程度的提高，CK、SM、0.001％GlcNAc、0.01％GlcNAc、0.1％GlcNAc的发病率分别为100.00％、83.98％、76.15％、77.00％和65.82％，有显著差异。其中当培养基内GlcNAc浓度为0.1％时生防效果最好。

实验3不同诱导培养时间R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果

1、实验材料

梨品种：水晶梨

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃活化7天备用。

2、处理

(1)梨果实预处理：选取表皮完整无损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(体积)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出后用自来水冲洗干净，洗去残留在梨表面的次氯酸钠，晾干备用。

(2)用高压灭菌后的打孔器在果实表面打孔，直径约3mm，深度约2mm。用移液枪加入30μl的10⁷细胞/ml R.paludigenum(分别为实施例1、对比例1、对比例4的采用24h、48h、72h、96h培养时间下制备而得的制剂)，以等量的无菌水作为对照CK。

(3)室温(25℃)静置晾干2小时后，在每个伤口处均接入5×10⁴孢子/ml扩展青霉P.expansum菌悬液30μl，处理完毕后在室温下(25℃)贮藏，并用PE保鲜膜密封作保湿处理，放到恒温(25℃)恒湿的房间，定时观察并记录结果，进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一个处理组，共3个重复，实验重复两次。

不同诱导培养时间R.paludigenum对梨果实青霉病的控制效果如图3所示。

图3中横坐标代表以下各处理：

CK：灭过菌的蒸馏水；

SM24：浓度为0％GlcNAc培养24h制备而得的制剂；

GlcNAc24：浓度为0.1％GlcNAc培养24h制备而得的制剂；

GlcNAc48：浓度为0.1％GlcNAc培养48h制备而得的制剂；

GlcNAc72：浓度为0.1％GlcNAc培养72h制备而得的制剂；

GlcNAc96：浓度为0.1％GlcNAc培养96h制备而得的制剂。

3、结果

结果如图3，显示的是第四天时，在培养基中经过不同诱导时间培养获得的红冬孢酵母，对扩展青霉在梨果实上的抑制作用。可以看到，诱导培养后24-96h的效果都无明显差异。发病率均为40％左右，病斑直径都在2-3mm之间。考虑到经济效益，诱导24h还是本发明的最优方案。

实验4、单物质GlcNAc处理和R.paludigenum处理对梨果实青霉病的控制效果比较

1、实验材料

梨品种：水晶梨

病原菌：扩展青霉(Penicillium expansum)，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上25℃活化7天备用。

2、处理

(1)梨果实预处理：选取表皮完整无损伤的果实，先用自来水清洗，然后再浸入0.1％(体积％)的次氯酸钠溶液中消毒2分钟，取出后用自来水冲洗干净，洗去残留在梨表面的次氯酸钠，晾干备用。

(2)用高压灭菌后的打孔器在果实表面打孔，直径约3mm，深度约2mm。用移液枪加入30μl的10⁷细胞/ml R.paludigenum(分别用实施例1、对比例1的采用0、0.1％GlcNAc-SM培养基制备而得的制剂)，以等量的无菌水作为对照CK，以等量的浓度为0.1％的GlcNAc溶液作为对照；

(3)室温(25℃)静置晾干2小时后，在每个伤口处均接入1×10⁴孢子/ml扩展青霉P.expansum菌悬液30μl，处理完毕后在室温下(25℃)贮藏，并用PE保鲜膜密封作保湿处理，放到恒温(25℃)恒湿的房间，定时观察并记录结果，进行比较，结果以平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)表示。选取9个果实为一个处理组，共3个重复，实验重复两次。

单物质GlcNAc处理和R.paludigenum处理对梨果实青霉病的控制效果如图4所示。

图4中横坐标代表以下各处理：

CK：灭过菌的蒸馏水；

0.1％GlcNAc：浓度为0.1％的GlcNAc溶液；

Rp-SM浓度为0％GlcNAc培养24h制备而得的制剂；

Rp-GlcNAc-SM：浓度为0.1％GlcNAc培养24h制备而得的制剂。

3、结果

结果如图4，第三天的记录结果显示：单纯加入0.1％的N-乙酰氨基葡萄糖溶液并不会使发病率减少，可以排除该物质会对扩展青霉起到抑制作用的可能性。因此证明，该物质是通过对生防酵母红冬孢酵母的生理调控起到抑制病害的作用。

综上所述：基于GlcNAc-SM二级种子培养基，在0.001％到2％的浓度区间内，N-乙酰氨基葡萄糖的浓度为0.1％时，培养24h后，将海洋红冬孢酵母制成菌剂，此时针对扩展青霉的控制效果是最好的，同时它的经济效益也是最大的，有较大的实际应用空间。

说明：上述实验1～实验4采用的是不同批次的水晶梨。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.利用乙酰氨基葡萄糖提高酵母抑制果实病害效力所用的培养基，其特征在于：包括YEPD活化培养基、SM一级种子培养基和GlcNAc-SM二级种子培养基；

YEPD活化培养基为：蛋白胨(20±0.5)g、酵母粉(10±0.5)g、葡萄糖(20±0.5)g、琼脂(20±0.5)g，加水定容至1000mL，灭菌后，得YEPD活化培养基；

SM一级种子培养基为：葡萄糖(10±0.5)g、硫酸铵(5±0.1)g、磷酸氢二钾(2±0.1)g、硫酸镁(3±0.1)g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得SM一级种子培养基；

GlcNAc-SM二级种子培养基为：N-乙酰氨基葡萄糖1g加入水溶解后过0.22μm滤膜灭菌后所得液，再加入葡萄糖(10±0.5)g、硫酸铵(5±0.1)g、磷酸氢二钾(2±0.1)g、硫酸镁(3±0.1)g、硫酸锌0.005g，加水定容至1000mL，灭菌后，得GlcNAc-SM二级种子培养基。

2.利用如权利要求1所述培养基制备提高酵母抑制果实病害效力的制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)菌株活化

于(28±1)℃，海洋红冬孢酵母于YEPD活化培养基上静置培养30～48h，并在相同条件下重复传代培养一次；

(2)扩大培养

将步骤(1)所得的酵母以1％的接种量接种到SM一级种子培养基中，并在(200±50)rpm、(28±1)℃的培养条件下培养(24±1)h；之后以2％的接种量接种到GlcNAc-SM二级种子培养基中，在上述相同培养条件下培养(24±1)h；

(3)离心分离

将步骤(2)所得的菌液离心后水洗；用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

海洋红冬孢酵母是保藏编号为IMI 394084的海洋红冬孢酵母Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为：

将步骤(2)所得的菌液以3000×g的速度离心5min，并用灭菌蒸馏水水洗三次从而去除培养基；利用血球板计数法计数并用灭菌蒸馏水将酵母的浓度调至1×10⁷细胞/mL，得到制剂。

5.如权利要求2～4任一方法制备而得的制剂的用途：用于防治梨果实青霉病害。

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