CN112522118A - 杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于单宁降解技术领域，具体涉及一种杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的应用。针对目前单宁酶产量低、降解单宁产鞣花酸无法工业化生产的问题，本发明提供了一种杂色曲霉或其菌剂在制备单宁酶和降解单宁中的应用。本发明还同时给出了上述杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，步骤为：将上述杂色曲霉和/或上述菌剂与含有单宁的样品进行发酵。本发明提供的杂色曲霉能够高效生产单宁酶，且酶解反应的条件具有广泛的pH适应性，从而能够在短时间内高效催化单宁的降解，能够有效提高经济效益。

Description

杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的应用

技术领域

本发明属于单宁降解技术领域，具体地，涉及一种杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的应用。

背景技术

单宁酶广泛存在于微生物、植物、动物体内，用以水解大分子单宁等。单宁酶的应用广泛，在食品工业中最为突出，其可用于除去天然食品中因单宁而引起的苦涩味，啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚类引起的变质、咖啡风味的软饮料生产、麦芽多酚的稳定处理、葡萄酒风味的改进以及作为测定天然没食子酸酯类结构的一种灵敏的分析探针。

鞣花单宁在单宁酶作用下酶解生成的产物鞣花酸，属多酚二内酯，具备抗氧化、抗病毒、抗癌等作用，目前已广泛应用于食品、医疗及制药行业。鞣花酸广泛存在于植物各组织中，但游离形式存在的鞣花酸含量极低，需要将植物进行生物酶解后才能够获得利用价值高的鞣花酸。讲解单宁产鞣花酸成为目前获取鞣花酸的主要途径。但是，单宁酶的来源较为匮乏，受到野生菌株本身单宁酶产量低、酶活低、酶解机制复杂的限制，目前生物降解单宁生产鞣花酸还无法有效的实现工业化生产。因此，开发能够产生单宁酶进而降解单宁产鞣花酸的微生物菌种是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：单宁酶产量低、降解单宁产鞣花酸无法工业化生产，需要开发产单宁酶的微生物的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种杂色曲霉或其菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。

进一步的，上述应用中，所述菌剂为含有杂色曲霉的菌剂。

进一步的，上述应用中，所述菌剂含有杂色曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。

其中，所述发酵清液的制备方法为：将杂色曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液；所述固液分离采用离心分离的方式，离心转速为3000～4000rpm，时间为30～45min，温度为15～20℃；所述发酵培养接种量为1×10⁵～1×10⁶CFU/mL，转速为100～120rpm，温度为25～35℃，时间为50～80h。

本发明第二方面还提供了一种上述杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，包括以下步骤：将杂色曲霉或其菌剂与含有单宁的样品进行发酵。

其中，所述发酵时的条件为：pH为3～6、温度为25～40℃、转速为100～120rpm、时间为24～72h；所述发酵清液与样品的体积比为2～3︰1～4。

进一步的，所述含有单宁的样品中单宁含量为15～20g/L。

本发明的有益效果为：

本发明通过大量试验，创造性的发现了杂色曲霉能够产生单宁酶并能够发酵单宁，因此提供了一种杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的新应用。本发明的杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中具有很好的效果，经发酵培养得到的发酵清液中单宁酶的酶活性较高，对鞣花单宁的特异性转化能力强，本发明的菌株鞣花酸产率最高为67.4%，具有很好的应用价值。本发明的杂色曲霉中的单宁酶对鞣花单宁进行酶解的步骤简便，具有广泛的pH和温度的耐受性，酶解效率高。

附图说明

图1是本发明中的筛选过程中杂色曲霉在初筛培养基上形成的透明圈。

具体实施方式

本发明提供了一种杂色曲霉或其菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。

进一步的，上述应用中，所述菌剂为含有杂色曲霉（Aspergillus versicolor）的菌剂。

进一步的，上述应用中，所述菌剂含有杂色曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。

其中，所述发酵清液的制备方法为：将杂色曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液；所述固液分离采用离心分离的方式，离心转速为3000～4000rpm，时间为30～45min，温度为15～20℃；所述发酵培养接种量为1×10⁵～1×10⁶CFU/mL，转速为100～120rpm，温度为25～35℃，时间为50～80h。

本发明第二方面还提供了一种上述杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，包括以下步骤：将杂色曲霉或其菌剂与含有单宁的样品进行发酵。

其中，所述发酵时的条件为：pH为3～6、温度为25～40℃、转速为100～120rpm、时间为24～72h；所述发酵清液与样品的体积比为2～3︰1～4。

进一步的，所述含有单宁的样品中单宁含量为15～20g/L。

本发明所用的杂色曲霉为保藏编号CMGCC NO.33885的杂色曲霉标准菌株。菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的标准菌株。

杂色曲霉标准菌株活化并培养的方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述杂色曲霉大量增殖即可。

本发明的杂色曲霉标准菌株活化培养的方法为：将杂色曲霉在平板培养基中培养至产孢，利用生理盐水洗脱孢子并充分振荡、稀释后获得孢子悬浮液，孢子液可以于4℃冰箱下保存备用。

进一步的，所述的平板培养基组成包括：10～15g/L的乳糖、30～45g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO₃、0.5～1.5g/L的K₂HPO₄、0.2～0.8g/L的MgSO₄、0.2～0.8g/L的KCl、0.01～0.03g/L的FeSO₄和1～3%琼脂。

此外，本发明的杂色曲霉标准菌株还可以直接接种至发酵培养基中发酵培养即可。所述的发酵培养基组成包括：40～60g/L的糖（具体可以为葡萄糖、乳糖、果糖和木糖中的至少一种）、30～45g/L单宁酸、2～4g/L的NaNO₃、0.5～1.5g/L的K₂HPO₄、0.2～0.8g/L的MgSO₄、0.2～0.8g/L的KCl、0.2～0.8g/L的NaCl、0.01～0.03g/L的FeSO₄。

根据本发明，所述发酵后可以采用加入甲醇的方式终止降解，所述发酵后还可以进一步对单宁经降解获得的产物（例如鞣花酸、没食子酸、儿茶素）进行纯化处理，例如，采用萃取、结晶、过滤等方式；所述含有单宁的样品可以为含有单宁的溶液，单宁具体可以为鞣花单宁、没食子单宁；所述含有单宁的样品也可以通过将含有单宁的植物原料经提取处理得到。

在本发明中，所述发酵可以是将杂色曲霉的发酵菌体（活菌体或者死菌体）与所述含有单宁的样品混合，使得杂色曲霉中的单宁酶对单宁进行降解，也可以是将杂色曲霉的发酵产物（含有单宁酶的发酵清液，或者从杂色曲霉的发酵液中提取、纯化得到的单宁酶）与所述含有单宁的样品混合，以对单宁进行降解。

根据本发明，所述酵清液与含有单宁的样品的体积比，可以根据杂色曲霉进行发酵培养的接种量、含有单宁的样品中单宁的浓度进行设定。优选情况下，在发酵培养的接种量为1×10⁵～1×10⁶CFU/mL时，所述含有单宁的样品中单宁的浓度为15～20g/L，所述发酵清液与所述含有单宁的样品的体积比为2～3︰1～4。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高杂色曲霉的发酵清液中的单宁酶对单宁的降解效率。

根据本发明，所述发酵的条件为： pH为3～6，具体可以为3、4、5、6，或者上述两个数值之间的任意值；温度为25～40℃，具体可以为25℃、30℃、35℃、40℃，或者上述两个数值之间的任意值；转速为100～120rpm，具体可以为100rpm、110rpm、120rpm，或者上述两个数值之间的任意值；时间为24～72h，具体可以为24h、36h、48h、60h、72h，或者上述两个数值之间的任意值。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

以下实施例中，杂色曲霉的发酵培养中的发酵培养基组分为：50g/L的葡萄糖、40g/L单宁酸、3g/L的NaNO₃、1g/L的K₂HPO₄、0.5g/L的MgSO₄、0.5g/L的KCl、0.01g/L的FeSO₄，发酵初始pH用40%浓度的NaOH溶液调整为5。

以下实施例中，鞣花酸的含量通过高效液相色谱法测得，鞣花酸的转化率和鞣花酸的产率通过下列公式得出：

鞣花酸的产率=（酶解后鞣花酸的含量/酶解前鞣花单宁的含量）×100%；

杂色曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger Van Tieghem）来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心的标准菌株，其他原料和试剂均为市售品。

实施例1

取杂色曲霉标准菌株，在平板培养基中培养至产孢，利用生理盐水洗脱孢子并充分振荡、稀释后获得孢子悬浮液，孢子液可以于4℃冰箱下保存备用。

所述的平板培养基组成包括： 15g/L的乳糖、45g/L单宁酸、4g/L的NaNO₃、1.0g/L的K₂HPO₄、0.6g/L的MgSO₄、0.6g/L的KCl、0.03g/L的FeSO₄和2%琼脂。

实施例2

（1）将实施例1得到的杂色曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为10⁵CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；

（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为10⁵CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为35℃、转速为120rpm的摇床中进行发酵培养80h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；

（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为4℃、转速为3000rpm的条件下离心30min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为15g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为1：1进行混合，在温度为30℃、pH为4.0、转速为120rpm的条件下转化制备鞣花酸48h，得到降解产物。

将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸产率为55.4%。

实施例3

（1）将实施例1得到的杂色曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为10⁶CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；

（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为10⁶CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为40℃、转速为100rpm的摇床中进行发酵培养50h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；

（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为10℃、转速为4000rpm的条件下离心45min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为20g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为3：1进行混合，在温度为25℃、pH为3.0、转速为120rpm的条件下转化制备鞣花酸60h，得到降解产物。

将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸产率为67.4%。

实施例4

（1）将实施例1得到的杂色曲霉接种至平板培养基中进行涂布，在温度为30℃的条件下培养至产孢，加入10mL左右的生理盐水，洗脱并充分振荡、稀释后获得浓度为10⁵CFU/mL的孢子悬浮液，4℃冰箱保存备用；

（2）将步骤（1）得到的孢子悬浮液以接种量为10⁵CFU/mL接入发酵培养基中，摇匀后用四层纱布封口在温度为30℃、转速为120rpm的摇床中进行发酵培养70h，完成发酵产酶过程，得到发酵液；

（3）将步骤（2）得到的发酵液在温度为20℃、转速为3000rpm的条件下离心30min得到的上清液为发酵清液，将发酵清液与底物浓度为20g/L的鞣花单宁水溶液以体积比为1：2进行混合，在温度为40℃、pH为6.0、转速为120rpm的条件下转化制备鞣花酸60h，得到降解产物。

将降解产物加入甲醇终止降解，混匀后测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸产率为54.6%。

对比例1

（1）发酵培养基的组分和含量为：NaNO₃ 2g/L、K₂HPO₄ 1g/L、KCI 0.5g/L、MgSO₄0.5g/L、FeSO₄ 0.01g/L、蔗糖30g/L，其余为水；灭菌后立即加入黑曲霉（Aspergillusniger Van Tieghem），在温度为30℃、转速为165rpm的条件下摇床培养72h得到发酵液；

（2）酶解培养基的组分和含量为：鞣花单宁5g/L、K₂HPO₄ l.0g/L、KCI 0.5g/L、MgSO₄ 0.25g/L、FeSO₄ 0.01g/L、NaNO₃ 2g/L，用5mol/L的NaOH溶液调节pH值为4.5；将步骤（1）得到的发酵液以2体积%的接种量移至酶解培养基中，在温度为28℃、转速为120rpm的条件下摇床培养4天得到酶解液；

（3）将步骤（2）得到的酶解液离心后利用高效液相色谱测定鞣花酸的含量，计算得到鞣花酸的产率为23%。

由实施例和对比例可知，杂色曲霉在降解单宁产鞣花酸上具有很好的应用效果，鞣花酸产率在50%以上，在制备单宁酶和降解单宁上具有很好的应用前景。

Claims (7)

1.杂色曲霉或其菌剂在制备单宁酶和/或降解单宁中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述菌剂为含有杂色曲霉的菌剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述菌剂含有杂色曲霉的活菌体、死菌体或发酵清液中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵清液的制备方法为：将杂色曲霉进行发酵培养得到发酵液，发酵液固液分离得到发酵清液；所述固液分离采用离心分离的方式，离心转速为3000～4000rpm，时间为30～45min，温度为15～20℃；所述发酵培养接种量为1×10⁵～1×10⁶CFU/mL，转速为100～120rpm，温度为25～35℃，时间为50～80h。

5.杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，其特征在于，包括以下步骤：将杂色曲霉或其菌剂与含有单宁的样品进行发酵。

6.根据权利要求5所述的杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，其特征在于：所述发酵时的条件为：pH为3～6、温度为25～40℃、转速为100～120rpm、时间为24～72h；所述发酵清液与样品的体积比为2～3︰1～4。

7.根据权利要求5所述的杂色曲霉或其菌剂降解单宁的方法，其特征在于：所述含有单宁的样品中单宁含量为15～20g/L。

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