CN108118004B - 一株喜仙人掌毕赤酵母在水果采后病害防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株用于水果采后病害防治的抑菌谱广、效果稳定的喜仙人掌毕赤酵母Pichia cactophila菌株BY35及其使用方法。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏菌株编号为CGMCC No.14909。该喜仙人掌毕赤酵母的使用方法：将菌株活化，用YPD发酵培养，离心，菌体用无菌水配成1×108细胞/mL的菌悬液；将苹果、梨、葡萄或柑橘等水果放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，常温贮藏。该喜仙人掌毕赤酵母可同时控制苹果青霉病和灰霉病菌，梨果实青霉病和灰霉病菌，葡萄镰孢霉病和炭疽病，以及柑橘青霉病，减少采后病害造成的损失，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及水果采后病害生物防治领域，尤其涉及一株喜仙人掌毕赤酵母在水果采后病害防治中的应用，该菌株对苹果、梨、葡萄、柑橘的主要采后病害均具有显著的防治效果。
背景技术
新鲜水果产品的品质劣变受诸多因素的影响，但病害尤其是真菌性病害引起的腐烂变质是果实采后损失中最严重的因素。虽然水果采后病害可以通过农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等很多途径进行防治，但目前控制水果采后病害的主要措施是化学防治(Eckert&Ogawa，1985，1988)。但长期使用化学农药不但导致病原菌产生耐药性而降低杀菌效果(Prusky et al.，1985；as et al.，1991； Holmes&Eckert，1999)，而且频繁地使用高浓度的化学药剂也增加了果实上的农药残留量，严重威胁人们的健康，并造成环境污染(Gullion&Kuijipers，1994)。因此，开发安全、高效、无毒、低抗性、无公害的控制果实采后病害新技术成为当前世界各国的研究重点(Falik et al.，1995；Tian et al.，2001；Kulakiotuetal.，2004)。其中利用生物拮抗菌防治果实采后病害是目前被证明安全有效的新方法 (Wilson&Wisniewski，1989；Janisiewicz&Koersten，2002)。
迄今为止，各国科学家已经筛选出了许多对水果采后病原真菌具有明显抑菌效果的细菌、酵母菌和小型丝状真菌，其中利用拮抗酵母菌防治果实采后病害是当前已被证明的高效、低毒、低抗性的新技术(王友升，2012)。
然而，虽然目前国内外报道的拮抗酵母菌有近百种，但大多数拮抗酵母菌的生防效果仅在少数果实上得到验证。而由于同一酵母菌的不同菌株之间的生防效果有很大差异(Filonowet al.，1996)，因此，大多数拮抗酵母菌的缺乏抑菌谱广、效果稳定的菌株。
发明内容
针对上述技术难题，本发明的目的在于提供一株喜仙人掌毕赤酵母 (Pichiacactophila)BY35菌株在水果采后病害防治的应用，所述BY35 菌株从自然发酵的磨盘柿醪液中筛选分离获得，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏菌株编号为CGMCC No.14909；按照以下步骤进行：将BY35菌株活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，放入常温贮藏。
优选地，所述水果为苹果、梨、葡萄和柑橘。
优选地，所述菌悬液的制备为：将菌株从-80℃冰箱取出，用YPDA 培养基活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。
优选地，所述YPDA培养基是：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖 20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。
优选地，所述BY35菌株用于同时控制苹果青霉病和灰霉病菌，梨果实青霉病和灰霉病菌，葡萄镰孢霉病和炭疽病，以及柑橘青霉病。
本发明的优点：(1)本发明所使用的喜仙人掌毕赤酵母BY35为本实验室从磨盘柿发酵醪液中筛选得到，其对人体无害，安全性高。(2)本发明所使用的喜仙人掌毕赤酵母BY35抑菌谱广，可以同时控制苹果青霉病和灰霉病菌，梨果实青霉病和灰霉病菌，葡萄镰孢霉病和炭疽病，柑橘青霉病。(3)本发明所使用的喜仙人掌毕赤酵母BY35在YPD培养基中生长良好，易于培养，性状稳定，且单独使用一定浓度该菌悬液就能有效降低多种水果采后真菌病害的发生率，使用成本低，市场前景广阔。 (4)本发明使用喜仙人掌毕赤酵母BY35可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，且不污染环境，社会和生态效益显著。
通过以下实施实例更加详细的说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
附图说明
图1为本发明喜仙人掌毕赤酵母BY35的26S rDNA D1/D2区核酸序列进化关系图。
图2为喜仙人掌毕赤酵母BY35对苹果青霉病和灰霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；Hv：1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图3为喜仙人掌毕赤酵母BY35对喜仙人掌毕赤酵母对梨果实青霉病和灰霉病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；Hv：1×108个 /mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜ 0.05)。
图4为喜仙人掌毕赤酵母BY35对葡萄镰孢霉病和炭疽病的抑制效果。注：Control：无菌水，即对照组；Hv：1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)。
图5为喜仙人掌毕赤酵母BY35对柑橘青霉病的抑制效果。注： Control：无菌水，即对照组；Hv：1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母 BY35菌悬液。不同字母代表差异显著(P＜0.05)
具体实施方式
实施例1：喜仙人掌毕赤酵母BY35的生物学特性
1.形态学特征
(1)YPDA培养基(酵母浸粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂
1.8％，121℃灭菌20min)上26℃培养48h，菌落呈圆形、白色，菌落边缘光滑圆润。细胞形态呈椭球型。
(2)在YPDA液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。
2.分子生物学鉴定
以通用正向引物NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3’)和反向引物NL-4(5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’)进行 PCR扩增酵母26S rDNA D1/D2区核酸序列，将PCR产物的测序结果输入网站www.NCBI.nlm.nih.gov进行BLAST，从GenBank数据库中下载同源序列，通过MEGA6软件构建进化树如图1，确定筛选到的菌株为喜仙人掌毕赤酵母(Pichiacactophila)。
本发明的喜仙人掌毕赤酵母BY35已保藏于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏委员会普通微生物中心，保藏时间为2017年11月15日，保藏编号为CGMCC No.14909，建议的分类命名为喜仙人掌毕赤酵母Pichia cactophila。
实施例2喜仙人掌毕赤酵母BY35对苹果青霉病和灰霉病的抑制效果
1.实验方案
将喜仙人掌毕赤酵母BY35从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于 26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108个 /mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。
将青霉病菌(Penicillium expansum)或灰霉病菌(Botrytis cinerea) 在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104个/mL的青霉病菌或灰霉病菌孢子悬浮液。
将健康无损的苹果果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打5个孔,表面伤口为2mm(直径) ×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL青霉病菌或灰霉病菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价喜仙人掌毕赤酵母BY35的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验,统计苹果的发病率结果如下：
(1)喜仙人掌毕赤酵母BY35对苹果青霉病的抑制效果
如图2所示，对照组苹果青霉病发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的苹果青霉病发病率为13％，因此喜仙人掌毕赤酵母 BY35能够有效控制苹果青霉病病害。
(2)喜仙人掌毕赤酵母BY35对苹果灰霉病的抑制效果
如图2所示，对照组苹果灰霉病的发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的苹果灰霉病发病率为0，因此喜仙人掌毕赤酵母 BY35能够有效控制苹果灰霉病病害。
实施例3喜仙人掌毕赤酵母BY35对梨果实青霉病和灰霉病的抑制效果
1.实验方案
将喜仙人掌毕赤酵母BY35从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108个 /mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。
将青霉病菌(Penicillium expansum)或灰霉病菌(Botrytis cinerea) 在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104个/mL的青霉病菌或灰霉病菌孢子悬浮液。
将健康无损的梨果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打5个孔,表面伤口为2mm(直径)× 2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL青霉病菌或灰霉病菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度 95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价喜仙人掌毕赤酵母BY35的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/ 果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验,统计梨果实的发病率结果如下：
(1)喜仙人掌毕赤酵母BY35对梨果实青霉病的抑制效果
如图3所示，对照组梨果实青霉病发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的梨果实青霉病发病率为0，因此喜仙人掌毕赤酵母 BY35能够有效控制梨果实青霉病病害。
(2)喜仙人掌毕赤酵母BY35对梨果实灰霉病的抑制效果
如图3所示，对照组梨果实灰霉病的发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的梨果实灰霉病发病率为20％，因此喜仙人掌毕赤酵母BY35能够有效控制梨果实灰霉病病害。
实施例4喜仙人掌毕赤酵母BY35对葡萄采后病害的抑制效果
1.实验方案
将喜仙人掌毕赤酵母BY35从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108个 /mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。
将芬芳镰孢菌(Fusarium redolens)或果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104个/mL的芬芳镰孢菌或果生炭疽菌孢子悬浮液。
将健康无损的葡萄果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔,表面伤口为2mm(直径) ×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL芬芳镰孢菌或果生炭疽菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价喜仙人掌毕赤酵母BY35的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验,统计葡萄果实的发病率结果如下：
(1)喜仙人掌毕赤酵母BY35对葡萄果实镰孢霉病的抑制效果
如图4所示，对照组葡萄果实镰孢霉病的发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的葡萄果实镰孢霉病发病率为47％，因此喜仙人掌毕赤酵母BY35能够有效控制葡萄果实镰孢霉病病害。
(2)喜仙人掌毕赤酵母BY35对葡萄果实炭疽病的抑制效果
如图4所示，对照组葡萄果实炭疽病的发病率为100％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的葡萄果实炭疽病发病率为60％，因此喜仙人掌毕赤酵母BY35能够有效控制葡萄果实炭疽病害。
实施例5喜仙人掌毕赤酵母BY35对柑橘青霉病的抑制效果
1.实验方案
将喜仙人掌毕赤酵母BY35从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基(酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min)活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于 26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min，弃上清，收集的菌体用无菌水反复清洗3次，血球计数板计数配成配制成浓度为1×108个 /mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液。
将青霉病菌(Penicillium italicum)在PDA培养基平板上激活，26℃下培养7～14d，刮取适量孢子，用无菌水配制成浓度为5×104个/mL的青霉病菌孢子悬浮液。
将健康无损的柑橘果实用2％次氯酸钠消毒5min，用去离子水冲洗，晾干，用无菌打孔器在果实赤道处打1个孔,表面伤口为2mm(直径) ×2mm(深)。每个伤口处等量加入20μL以下处理液：(1)1×108个/mL的喜仙人掌毕赤酵母BY35菌悬液；(2)无菌蒸馏水。4h后接种20μL青霉病菌孢子悬浮液。晾干后，将果实放入塑料箱，保持相对湿度95％，置于室温(25℃)4天后记录果实发病率，以此评价喜仙人掌毕赤酵母BY35 的抑菌效果。发病率的计算公式为：发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％。
2.试验结果
按照上述步骤试验,统计柑橘果实的发病率结果如图5所示，对照组柑橘果实青霉病发病率为73％，经过喜仙人掌毕赤酵母BY35处理的柑橘果实青霉病发病率为15.3％，因此喜仙人掌毕赤酵母BY35能够有效控制柑橘果实青霉病病害。
Claims (4)
1.一株用于水果采后病害防治的喜仙人掌毕赤酵母(Pichia cactophila)BY35菌株，其特征在于：所述BY35菌株从自然发酵的磨盘柿醪液中筛选分离获得，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，菌株保藏编号为CGMCC No.14909。
2.如权利要求1所述的BY35菌株在水果采后病害防治中的应用，其特征在于：按照以下步骤进行：将BY35菌株活化，用YPD液体培养基发酵培养，离心得到菌体，将菌体用无菌水配制成浓度为1×108个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡30秒后取出，风干；放入保鲜盒中，密封后，放入常温贮藏；所述水果选自苹果、梨、葡萄和柑橘；
所述BY35菌株用于控制苹果的扩展青霉病菌(Penicillium expansum)或灰霉菌(Botrytis cinerea)，梨果实的扩展青霉病菌(Penicillium expansum)或灰霉菌(Botrytis cinerea)，葡萄的芬芳镰孢菌(Fusarium redolens)或果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)，以及柑橘的意大利青霉病菌(Penicillium italicum)。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌悬液的制备为：将菌株从-80℃冰箱取出，用YPDA培养基活化，挑取单菌落至YPD液体培养基里，于26℃、200r/min条件下培养24h，4000rpm离心5min收集菌体，用无菌水洗3遍。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述YPDA培养基是：酵母浸粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂18g，去离子水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。
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Effective date of registration: 20210809 Address after: 276800 1st floor, building 2, new generation information technology industrial park, Rizhao hi tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee after: Rizhao Huada Health Industry Research Institute Address before: 100048, Fu Cheng Road, Beijing, Haidian District, No. 33 Patentee before: BEIJING TECHNOLOGY AND BUSINESS University |
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Effective date of registration: 20210826 Address after: Room 1401, building D, 606 ningliu Road, Changlu street, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province 210000 Patentee after: Nanjing Wantuo Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 276800 1st floor, building 2, new generation information technology industrial park, Rizhao hi tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee before: Rizhao Huada Health Industry Research Institute |
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Effective date of registration: 20210929 Address after: 276800 1st floor, building 2, new generation information technology industrial park, Rizhao hi tech Zone, Rizhao City, Shandong Province Patentee after: Shandong Kaipu fite Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 1401, building D, 606 ningliu Road, Changlu street, Jiangbei new district, Nanjing, Jiangsu Province 210000 Patentee before: Nanjing Wantuo Biotechnology Co.,Ltd. |