CN115369048B - 一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其是将2个拷贝的优化的crtZ基因依次导入解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌MY1；再将HMG基因导入工程菌MY1，得到解脂耶氏酵母基因工程菌MY3；接着，将优化的HMG基因和优化的AtoB基因，整合到解脂耶氏酵母基因工程菌MY3中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌HA，所述优化的crtZ基因、优化的HMG基因和优化的AtoB基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。采用该方法构建获得的解脂耶氏酵母基因工程菌HA可以提高玉米黄质的产量具有良好的应用前景。

Description

一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
背景技术
玉米黄质(Zeaxanthin，3,3’-二羟基-β-胡萝卜素)是一种含氧类胡萝卜素衍生物，首次在玉米中发现。高纯度的玉米黄质是一种橙色结晶粉末，很少或没有气味，可溶于醚、酯类和其他有机溶剂，不溶于水，主要由植物、藻类和微生物天然生产。玉米黄质具有很强的抗氧化和抗癌特性，在预防老年性黄斑变性和白内障中起着重要作用，因此被广泛用于食品、制药和营养行业。
玉米黄质的生产方法主要包括化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。首先，玉米黄质可以用化学方法合成，但技术路线复杂，成本昂贵，生物活性差，因此化学合成的玉米黄质只能作为颜料使用。其次，玉米黄质也可从黄色的蔬菜和水果中提取，如玉米、辣椒、橘子、瓜类、芒果等，并且提取获得的玉米黄质具有多种功能活性。然而，提取率低，污染环境等问题限制了玉米黄质提取技术的发展。第三，微生物生产玉米黄质可以用野生或工程微生物，该方法具有原料成本低、环境污染小等优点。此外，微生物的代谢工程提供了另一种方法，通过异源生物合成途径的引入，基因工程的应用，在细菌、酵母和微藻中非天然生产具有安全性和高生物活性的玉米黄质。因此微生物发酵法生产玉米黄质具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产玉米黄质成为目前研究的热点之一。
解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为类胡萝素提供储存空间，具有广泛利用底物的能力，是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用酵母生产玉米黄质的报道并不多，并且普遍产量较低，更未有在解脂耶氏酵母中，将玉米黄质作为目标代谢产物的研究报道。因此亟需开发玉米黄质合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。
发明内容
本发明通过构建解脂耶氏酵母生产玉米黄质的合成途径，所构建的基因工程菌株含有2个拷贝的优化的Pantoea agglomerans来源的β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ和1个拷贝的Yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG。优选的，所述的重组菌株含有Bordetella petrii来源的NADH依赖型HMG辅酶A还原酶基因HMG，Escherichia coli来源的乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因AtoB。优选的，所述的重组菌株中过表达了将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的Yarrowia lipolytica内源的基因HMG，并同时过表达将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的Yarrowia lipolytica内源的基因ERG12，成功获得了高产玉米黄质的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。本发明的第二个目的是提供一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第三个目的是一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其是将2个拷贝的优化的crtZ基因依次导入解脂耶氏酵母基因工程菌XK17中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌MY1；再将HMG基因导入工程菌MY1，得到解脂耶氏酵母基因工程菌MY3；接着，将优化的HMG基因和优化的AtoB基因，整合到解脂耶氏酵母基因工程菌MY3中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌HA，所述优化的crtZ基因、优化的HMG基因和优化的AtoB基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
具体的，所述产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤一、以产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17作为底盘菌株，利用CRISPR/Cas9***，将优化的crtZ基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌XK17的染色体的E1-3位点，得到重组菌DN1；再向重组菌DN1的A-3位点导入优化的crtZ基因，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌MY1，优化的crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；解脂耶氏酵母基因工程菌XK17参见专利申请号为CN202010107322.1的发明专利申请文献；
步骤二、利用CRISPR/Cas9***，将HMG基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌MY1染色体的A1-2位点，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌MY3，所述的HMG基因在NCBI中登录号为GB:NC_006071；
步骤三、将优化的HMG基因和优化的AtoB基因通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB，对质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB线性化后，导入解脂耶氏酵母基因工程菌MY3中，获得HA菌株，其中，所述优化的HMG基因、优化的AtoB基因以及质粒pMD18T-KU70-HisG的序列分别如SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示。
根据本发明，本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，还包括：
步骤四、将线性化后的质粒pINA1269-HMG1-ERG12，转化入解脂耶氏酵母基因工程菌HA中，得到玉米黄质高产菌株HA-EH，其中，所述质粒pINA1269-HMG1-ERG12的核苷酸序列参见专利申请号为201610817882.X的发明专利申请文献。
作为本发明的第二个方面，一种生产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌，其通过上述所述的方法构建获得。
作为本发明的第三个方面，一种如上述所述的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产玉米黄质中的应用，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用葡萄糖高产玉米黄质。
本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法的有益效果：本发明过表达了基因HMG、AtoB和ERG12，使碳通量尽可能多的流入玉米黄质合成途径，减少对底物的浪费，能极大幅度地提高玉米黄质的产量。
本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果：
(1)玉米黄质的产量高：本发明的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌能使玉米黄质在摇瓶水平达到720mg/L的产量。
(2)获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的玉米黄质能够被安全的利用，前景良好。
附图说明
图1为解脂耶氏酵母异源生物合成玉米黄质的代谢途径。
图2为整合基因BpHMG、AtoB和ERG13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
图3为整合基因BpHMG和AtoB，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
图4为整合基因BpHMG和ERG13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
图5为整合基因AtoB和ERG13，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
图6为利用质粒pINA1269-HMG1-ERG12，整合HMG和ERG12基因，获得的不同转化株生产玉米黄质的结果图。
图7为菌株XK17、DN1、MY1、MY3、HA2和HA-EH2摇瓶发酵生产玉米黄质的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
1、本发明实施例中的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)采用XK17作为出发菌株，参见专利申请号为CN202010107322.1的发明专利申请文献。
2、质粒pHR_E1-3_hrGFP、pCRISPRyl_E1-3、pHR_A-3_hrGFP、pCRISPRyl_A-3、pHR_A1-2_hrGFP和pCRISPRyl_A1-2参见Schwartz,C.,Shabbir-Hussain,M.,Frogue,K.,Blenner,M.,Wheeldon,I.2017.Standardized markerless gene integration forpathway engineering in Yarrowia lipolytica.ACS Synth Biol,6(3),402-409所记载的方法制备而成。
3、质粒pINA1269-HMG1-ERG12：其核苷酸序列参见专利申请号为201610817882.X的发明专利申请文献。
实施例1：构建菌株MY1
(1)将Pantoea agglomerans来源的β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ的优化序列(核苷酸序列如SEQ ID No.1)分别通过酶切位点NheⅠ和BssHⅡ构建到质粒pHR_E1-3_hrGFP和质粒pHR_A-3_hrGFP中，得到质粒pHR_E1-3_crtZ和pHR_A-3_crtZ。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_E1-3_crtZ和质粒pCRISPRyl_E1-3转化入解脂耶氏酵母XK17中，获得重组菌株DN1。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ YeastTransformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。将步骤(1)中所得的质粒pHR_A-3_crtZ和质粒pCRISPRyl_A-3同时转入解脂耶氏酵母DN1中，获得菌株MY1。
实施例2：构建菌株MY3
(1)将Yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG的序列(NCBI中登录号为GB:NC_006071)通过酶切位点NheⅠ和BssHⅡ构建到质粒pHR_A1-2_hrGFP中，得到质粒pHR_A1-2_HMG。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_A1-2_HMG和质粒pCRISPRyl_A1-2转化入解脂耶氏酵母MY1中，获得MY3。经验证，解脂耶氏酵母MY3的A1-2位点导入了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG。
实施例3：获得玉米黄质高产菌株HA
本实施例的基因和质粒来源：
HMG基因为来自Bordetella petrii的NADH依赖型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG，其优化序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
AtoB基因为Escherichia coli来源的乙酰辅酶A乙酰基转移酶AtoB，其优化序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
ERG13基因为Yarrowia lipolytica内源的HMG辅酶A合成酶ERG13的序列(NCBI中登录号为GB:NC_006072.1)；
质粒pMD18T-KU70-HisG，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
(1)将优化的HMG基因的序列，优化的乙酰辅酶A乙酰基转移酶AtoB的优化序列和ERG13的序列通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB-ERG13；
将HMG的优化序列和AtoB的优化序列通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB；
将HMG的优化序列和ERG13的序列通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-ERG13；
将AtoB的优化序列和ERG13的序列通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-AtoB-ERG13。
(2)通过酶切位点NdeⅠ和EcoRⅠ将(1)中的4种质粒分别线性化后，转化入实施例2所得的菌株MY3中，获得6个HAE菌株、2个HA菌株、4个HE菌株和6个AE菌株。
6个HAE菌株的产量分别为122mg/L、133mg/L、126mg/L、137mg/L、145mg/L和142mg/L，结果如图2所示。
2个HA菌株的产量分别为292mg/L和394mg/L，结果如图3所示。
4个HE菌株的产量分别为134mg/L、133mg/L、134mg/L和90mg/L，结果如图4所示。
6个AE菌株的产量分别为259mg/L、281mg/L、268mg/L、274mg/L、271mg/L、和247mg/L，结果如图5所示。
HAE菌株、HA菌株、HE菌株和AE菌株的玉米黄质的产量分别为122-145mg/L、292-394mg/L、90-134mg/L和247-281mg/L。
经过比较，HA的产量比较高，将两株HA进行后续试验。
实施例4：获得玉米黄质高产菌株HA-EH
将线性化后的质粒pINA1269-HMG1-ERG12，转化入实施例3获得的两株解脂耶氏酵母基因工程菌HA中，整合Yarrowia lipolytica内源的基因HMG和基因ERG12基因，获得两个HA-EH菌株。两株HA-EH1和HA-EH2菌株的产量分别为480mg/L和720mg/L，结果如图6所示。
实施例5：测定菌株产玉米黄质的产量
将菌株解脂耶氏酵母XK17，实施例1制备的菌株DN1和MY1，实施例2制备的菌株MY3，实施例3制备的菌株HA2，实施例4制备的HA-EH2，分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。发酵培养4天后，使用DMSO和丙酮进行玉米黄质的提取。之后利用高效液相色谱仪C18反相色谱柱对类胡萝卜素进行定性和定量分析，检测的结果参见图7。
图7的结果说明，菌株HA-EH2产玉米黄质的能力大幅度提升，在发酵的第4天，玉米黄质的产量为720mg/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
浙江赫凯生物科技有限公司
<120> 一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用
<130> 211045
<141> 2021-05-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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ctcaccgact gggaggtcac cgctgaggga cacctggccg gaaccctgga gatgcctatg 960
gccgtcggac tggtgggcgg cgctaccaag ctccacccta ccgcccgagc ttgtctcaag 1020
atcctgggag tctctaccgc tgagcgactg gctcgactca ttgctgccgt gggcctggcc 1080
cagaacttct ctgctctcaa ggctctggct accaccggca tccagaaggg acacatgtcc 1140
ctgcacgccc agaacattgc catgatggcc ggagccgtcg gagacgagat tgagcctgtc 1200
gctaaggctc tcgtcgccca gggcgccgtg cgagtggacg tcgctgaggc tgaacttgcc 1260
cgactgcgag gacagggc 1278
<210> 3
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaagaact gtgtcatcgt gtctgccgtg cgaaccgcca ttggatcttt caacggatct 60
ctggcttcta cctccgccat tgacctggga gccaccgtca ttaaggctgc catcgagcga 120
gccaagattg actcgcagca cgtggacgag gtgattatgg gaaacgtcct ccaggccggc 180
ctcggacaga accccgcccg acaggctctc ctgaagtcgg gactggctga gaccgtgtgt 240
ggattcaccg tcaacaaggt ctgtggatcg ggactgaagt cggtcgccct ggccgctcag 300
gctattcagg ccggacaggc tcagtctatc gtggccggcg gcatggagaa catgtctctg 360
gccccttacc tcctcgacgc caaggcccga tccggatacc gactgggcga cggacaggtc 420
tacgacgtca ttctgcgaga cggactgatg tgtgctaccc acggatacca catgggaatt 480
accgctgaga acgtggctaa ggagtacggc atcacccgag agatgcagga cgaattagcc 540
ctgcactcgc agcgaaaggc tgccgctgcc atcgagtcgg gcgctttcac cgctgagatt 600
gtccccgtca acgtggtgac ccgaaaaaaa accttcgtgt tctcccagga cgagttccct 660
aaggctaact ccaccgctga ggctctcggc gctctgcgac ctgctttcga caaggctgga 720
accgtcaccg ccggcaacgc ttccggaatt aacgacggag ctgctgccct ggtgattatg 780
gaggagtccg ctgctctcgc cgccggactc acccccctgg cccgaattaa gtcttacgct 840
tcgggaggag tgcctcctgc tctcatgggc atgggacctg tccccgccac ccagaaggct 900
ctccagctcg ccggcctcca gctcgctgac attgacctca tcgaggctaa cgaggccttc 960
gctgcccagt tcctcgccgt gggcaagaac ctgggattcg actctgagaa ggtgaacgtc 1020
aacggcggcg ctattgctct gggccaccct attggagctt cgggagcccg aatactggtg 1080
accctcctgc acgctatgca ggcccgagac aagaccctcg gactggctac cctgtgtatt 1140
ggcggcggac agggcattgc tatggtgatt gagcgactca ac 1182
<210> 4
<211> 9897
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atttaaataa gacgaggaga ctttcttctt acgacatata catcaataga ccattcatgg 60
caagaaagaa gtactcgaac ataggcccat aaagtacgag tacagtacac tacactacac 120
tacttgtacc attctacccg gggtctgccg gcttgtacac accgacagca ctcgtactct 180
cccacgaatg ctccggctgc cgacatcaac acgatctcaa aagcgcatac tgagcttcct 240
ttcctagctc ttccttcctt caactcgata aatacattgg atatatacat gtgtggcgac 300
tgtcgacttg atgtttagag tgtccagatc cgcaagatcg gctcgcactt gtgttgtgtt 360
gtttcaaatc agcctgtcgt tttgtgtcgt ttgagatcat tctgtctcac tcttaggctc 420
gcttagaacc gacaacggag aatccgggct cggtttttcg gtcggccttg atctgggcct 480
tggacttgta ctggtcggcc atctccacgt tgaccagctc cttgaccttg tagagctgac 540
cggcgatacc aggagacacc ttgtagtact tctgggagcc gaccttgccc agaccgaggg 600
tcttgagcac gtcacgtgtt ctccacggca ttcgcaggat agatcggacc tgtgtgactt 660
tgtagaacat ggcgtttcag gtggttgcgt gagtgtgtaa aatcgtgtct ttcagaagtt 720
acaaatttca ccgcatttag agtttatgca gatgggcggt gtgtggttgg gagttcgatt 780
tccgtgcgtg catttgatct tgatgaattg gatttgtaca tgaggaagag cacgtcaagc 840
accgcctact gcaaactcgt gaatattgag attattgagg aaattcaagg aaaattcaga 900
tcagatttga gagcaaagtc caacaatact acacaatccc tttcctgtat tcttccacca 960
tcgtcatcgt cgtctgtctt ctcttcagct ttttaatttc actccccaca aacccaaatt 1020
tagctgcatc attcatcaac ctccaattat aactatacat cgcgacacga acacgaaaca 1080
cgaaccacga accgccgctt tttgaaaatg gaatggattt cacatctgga gaacgatgac 1140
gatgtgctgg aaatcgagga ctacaaggtg cgcaaggacg cgctgctgat cgccattcaa 1200
gtaacccaga acgccattaa caacggaact cttcataagg ccttggaggc agccttcgat 1260
gctgtgactg acagaatcgt catatcgccg caagattaca ccggcgttat gctgttcggt 1320
gcctccatgc agtctgagga cgacggtgac gagttcgatg atgagtcaga tacacatttc 1380
attctcaagc tgggccttcc taccgctgct cagatcaaac gactcaaacg actggcagag 1440
gaccctgatc tgggtgagag gttcaaggtg caggaagagc ctcacctgat ggacgtgttt 1500
ttcgacatga accgccattt tatcaacatg gcacccaact tcggaattcc agatcttcca 1560
gtggtgcatg aacgcatgag aaagcccccg gaagatcatc ttccgggggc tttttttttg 1620
gcgcgcgata cagaccggtt cagacaggat aaagaggaac gcagaatgtt agacaacacc 1680
cgcttacgca tagctattca gaaatcaggc cgtttaagcg atgattcacg agaattgctg 1740
gcccgctgcg gcataaaaat taatttacac actcagcgcc tgattgcgat ggcggaaaac 1800
atgccgattg atatcctgcg cgtgcgtgat gatgacattc cgggtctggt aatggatggc 1860
gtggtcgatc tcggtattat cggcgaaaac gtgctggaag aagagctact caaccgccgc 1920
gcacagggcg aagatccacg ctatttaacc ctgcgccgtc ttgacttcgg cggctgccgt 1980
ttatcgctgg caacaccggt tgacgaagcc tgggacggcc cggccgcgct ggacggtaaa 2040
cgtatcgcta cctcatatcc gcacctcctc aaacgctacc tcgaccagaa aggcgtctct 2100
tttaaatcgt gtctgttaaa tggttctgtc gaagtcgcgc cgcgcgcggg gctggccgac 2160
gctatctgcg atttggtctc taccggcgcg acgcttgaag ctaacggcct gcgtgaagtc 2220
gaagttatct accgctctaa agcctgtctg attcagcgcg acggtgagat ggcacagagc 2280
aagcaagagc tgatcgataa attgctgacc cgtattcagg gcgtgattca ggcgcgcgaa 2340
tcgaaataca tcatgatgca cgcgccaagt gaacgcctgg aagaggttat cgccctgctg 2400
ccaggcgccg aaaggccgac aattctgccg ctggcaggcg agcaacagcg cgtggcgatg 2460
cacatggtca gcagcgaaac gttgttctgg gaaaccatgg agaaactgaa agcgcttggc 2520
gccagctcga ttctggtact gccgatcgag aagatgatgg agtgatctga cgcctgatgg 2580
cgctgcgctt atcaggccta cgtaatgcgt tgatattttg ggttctgtag gccggataag 2640
gcggaaccct gtgatggagt aaagaccatg agcttcaata ccctgattga ctggaacagc 2700
ggtaccggtg tgttctgtgg agcattctca cttttggtaa acgacattgc ttcaagtgca 2760
gcggaatcaa aaagtataaa gtgggcagcg agtatacctg tacagactgt aggcgataac 2820
tcaatccaat taccccccac aacatgactg gccaaactga tctcaagact ttattgaaat 2880
cagcaacacc gattctcaat gaaggcacat acttcttctg caacattcac ttgacgccta 2940
aagttggtga gaaatggacc gacaagacat attctgctat ccacggactg ttgcctgtgt 3000
cggtggctac aatacgtgag tcagaagggc tgacggtggt ggttcccaag gaaaaggtcg 3060
acgagtatct gtctgactcg tcattgccgc ctttggagta cgactccaac tatgagtgtg 3120
cttggatcac tttgacgata cattcttcgt tggaggctgt gggtctgaca gctgcgtttt 3180
cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct gcaacgtcat tgctggcttt catcatgatc 3240
acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga gagccattga cgttctttct aatttggacc 3300
gatagccgta tagtccagtc tatctataag ttcaactaac tcgtaactat taccataaca 3360
tatacttcac tgccccagat aaggttccga taaaaagttc tgcagactaa atttatttca 3420
gtctcctctt caccaccaaa atgccctcct acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg 3480
cctttgccgc tcgagtgctc aagctcgtgg cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc 3540
tggatgttac caccaccaag gagctcattg agcttgccga taaggtcgga ccttatgtgt 3600
gcatgatcaa aacccatatc gacatcattg acgacttcac ctacgccggc actgtgctcc 3660
ccctcaagga acttgctctt aagcacggtt tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag 3720
atattggcaa cactgtcaag caccagtacc ggtgtcaccg aatcgccgag tggtccgata 3780
tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg 3840
aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca 3900
aggagttcct agtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg 3960
agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 4020
cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 4080
ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg 4140
gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg 4200
gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg 4260
ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 4320
aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag 4380
acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc 4440
caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacagtg ctaatacgtt 4500
gaactactta tacttatatg aggctcgaag aaagctgact tgtgtatgac ttattctcaa 4560
ctacatcccc agtcacaata ccaccactgc actaccacta caccggatcc cagatcttcc 4620
agtggtgcat gaacgcatga gaaagccccc ggaagatcat cttccggggg cttttttttt 4680
ggcgcgcgat acagaccggt tcagacagga taaagaggaa cgcagaatgt tagacaacac 4740
ccgcttacgc atagctattc agaaatcagg ccgtttaagc gatgattcac gagaattgct 4800
ggcccgctgc ggcataaaaa ttaatttaca cactcagcgc ctgattgcga tggcggaaaa 4860
catgccgatt gatatcctgc gcgtgcgtga tgatgacatt ccgggtctgg taatggatgg 4920
cgtggtcgat ctcggtatta tcggcgaaaa cgtgctggaa gaagagctac tcaaccgccg 4980
cgcacagggc gaagatccac gctatttaac cctgcgccgt cttgacttcg gcggctgccg 5040
tttatcgctg gcaacaccgg ttgacgaagc ctgggacggc ccggccgcgc tggacggtaa 5100
acgtatcgct acctcatatc cgcacctcct caaacgctac ctcgaccaga aaggcgtctc 5160
ttttaaatcg tgtctgttaa atggttctgt cgaagtcgcg ccgcgcgcgg ggctggccga 5220
cgctatctgc gatttggtct ctaccggcgc gacgcttgaa gctaacggcc tgcgtgaagt 5280
cgaagttatc taccgctcta aagcctgtct gattcagcgc gacggtgaga tggcacagag 5340
caagcaagag ctgatcgata aattgctgac ccgtattcag ggcgtgattc aggcgcgcga 5400
atcgaaatac atcatgatgc acgcgccaag tgaacgcctg gaagaggtta tcgccctgct 5460
gccaggcgcc gaaaggccga caattctgcc gctggcaggc gagcaacagc gcgtggcgat 5520
gcacatggtc agcagcgaaa cgttgttctg ggaaaccatg gagaaactga aagcgcttgg 5580
cgccagctcg attctggtac tgccgatcga gaagatgatg gagtgatctg acgcctgatg 5640
gcgctgcgct tatcaggcct acgtaatgcg ttgatatttt gggttctgta ggccggataa 5700
ggcggaaccc tgtgatggag taaagaccat gagcttcaat accctgattg actggaacag 5760
caagcttcat atgggtgatg ccatcgagga atggaacaag gtgttgcaga gcagctccaa 5820
gcgacctgcg gaggatatct gtaaggctga gaagaaagtc aagagttctg acgcgggccc 5880
tccgtccaac gagcaaatgc aaaatatggt tgagaatgac attgtcggca agctgaccgt 5940
cgcagaactc agggcttggg gtgctgctaa caatgttgag cccaatggta gcaagttgaa 6000
gaaggactgg gttgaggtgg tcaaaaagta ctatgggaag tgactaggga ggcacatcta 6060
aacgaataac gaatattaat gataccatca tatctcagaa catgtatgac tgctgcttcc 6120
aaacgatatg aggatgagtc ctctttcaga ttaagataga gtacaaatat attatctata 6180
tactggtgtc tgtgcgatgt cgtatgagcg gtgaatcatg tgactgtcac gtggtttggc 6240
ccaagttaca ccgtagctac gcctttcttg accgtctcca tggtcttctg ggcgggttga 6300
cagtttccac tggatgagcg tccgcctcct gttcctgtcg ttgtccctgc agctcagcct 6360
caatcttctg accgagctcg gagtccaggg aaatgccaac aggttgtcca agcaacatca 6420
tggtttggtg ggcagccgtg atctcatcgt cgttggatac cattcggtac ttggcctcaa 6480
tctgcacaaa gtagcggtac cactggtttc gagcaaaccg ctccaattga gcctctccgt 6540
cgagagagag agtaggtgat tgctccaact tgcggccaaa atgaagttct cgactcacct 6600
ttttgaagcg gttcttcttg cccatcttgg tggcgaaagt agtggctagt ggtggatgac 6660
tttgtataat gtaccgatga agagggttgt atttgctcag taagaagtag cgagtgaaat 6720
cagatgactt aacgagagca aagggcaatg gaatacctgc tgcctgatta acaacagctt 6780
ctgtgtcgtt tctctcttgt gaatgagtgt gttgctagag gtaggttggc actccaatgt 6840
tacgacacac aatagtctat agagcactac aaagggctat atcgtcaact gctctattgt 6900
agctacagta cagtacatac catcaagtga acaatggacc accaaactcg gcactaagcc 6960
aatagaacct ttgcggcctc ctttatcacg tttctatata ccttgtccat ttatgtgcca 7020
ccctttagtc ttggtcgttc acttcagctc aacttcagcc atgatagcaa gatgatctga 7080
aggatacatg tcaatgcgag gctgaccact gggctcgggc cccatatcct cctcaagggg 7140
catcttcaac agactcttga cctggacctc atcgctgttg ttggacgaaa cgaaaatgta 7200
gtccaaaaga cccctccagg cgtgggccca gttactgaag cgaggctcct tcttgtgctt 7260
atttaaatgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 7320
caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 7380
cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg 7440
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca 7500
atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 7560
ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 7620
agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc 7680
gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 7740
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 7800
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 7860
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 7920
cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 7980
ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 8040
cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 8100
ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 8160
gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 8220
gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 8280
acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 8340
cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 8400
acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 8460
ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 8520
ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 8580
gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 8640
atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 8700
ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 8760
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 8820
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 8880
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 8940
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 9000
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 9060
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 9120
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 9180
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 9240
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 9300
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 9360
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 9420
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 9480
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 9540
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 9600
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 9660
gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 9720
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 9780
agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 9840
tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattac 9897

Claims (5)

1.一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、以产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌XK17作为底盘菌株，利用CRISPR/Cas9***，将优化的crtZ基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌XK17的染色体的E1-3位点，得到重组菌DN1；再向重组菌DN1的A-3位点导入优化的crtZ基因，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌MY1，优化的crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
步骤二、利用CRISPR/Cas9***，将HMG基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌MY1染色体的A1-2位点，得到产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌MY3，所述的HMG基因在NCBI中登录号为GB:NC_006071；
步骤三、将优化的HMG基因和优化的AtoB基因通过酶切位点HindⅢ和NdeⅠ构建到质粒pMD18T-KU70-HisG中，得到质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB，对质粒pMD18T-KU70-HisG-HMG-AtoB线性化后，导入解脂耶氏酵母基因工程菌MY3中，获得HA菌株，其中，所述优化的HMG基因、优化的AtoB基因以及质粒pMD18T-KU70-HisG的序列分别如SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求1所述的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，还包括：将线性化后的质粒pINA1269-HMG1-ERG12，转化入解脂耶氏酵母基因工程菌HA中，得到玉米黄质高产菌株HA-EH。
3.一种产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其采用如权利要求1或2所述的方法构建获得。
4.一种如权利要求3所述的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产玉米黄质中的应用。
5.一种如权利要求3所述的产玉米黄质的解脂耶氏酵母基因工程菌在利用葡萄糖生产玉米黄质中的应用。
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