CN108467876B - 一种提高可得然胶产量的发酵方法 - Google Patents
一种提高可得然胶产量的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高可得然胶产量的发酵新方法,包括以下步骤:将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养,在可得然胶发酵的48小时和72小时,分别放料发酵液,补加新鲜培养基,并且控制发酵过程的溶氧不低于30%。采用本发明工艺比放料补糖工艺可得然胶产量提高了40%,发酵液的凝胶强度提高了58%。当本发明产胶期溶氧控制在30%以上,相对于溶氧在10%以下的工艺,本发明可得然胶产量提高86.7%,凝胶强度提高了91.4%。本发明的方法提高了在发酵中后期生产可得然胶产胶的速率,工艺控制简单,节约生产成本,为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物多糖发酵领域,特别涉及一种提高可得然胶产量的发酵方法。
背景技术
可得然胶(Curdlan)是一种新型的微生物胞外多糖,由于其具有在加热条件下形成凝胶的独特性质,所以又被称做热凝胶。Curdlan的化学结构分析表明它是由单一的D-葡萄糖在C1和C3位置以β-1,3-糖苷键连接而成的无分支的均一多糖聚合物。
可得然胶发酵是典型的非偶联型发酵,在菌种生长期间,没有可得然胶产生;在菌体生长结束,氮源限制条件下,菌体开始分泌可得然胶。可得然胶是水不溶性,易溶于碱液、二甲基亚砜。在加热到55℃时,可以得到低强度可逆性固体可得然胶;继续加热到80℃以上时,可以形成不可逆的固体可得然胶。由于这一特性,且安全无毒,已经广泛应用于面条、果冻等食品。美国FDA在1996年批准可得然胶作为可食用多糖,是第三个作为食品添加剂的微生物多糖。中国食品药品监督局与2006年批准可得然胶可以用于食品领域。
可得然胶发酵是一个由土壤杆菌(Agrobacterium sp.)或根瘤菌(Rhizobium sp)把葡萄糖、蔗糖等小分子糖合成多聚糖的过程。在发酵过程中,碳源会大量消耗,导致发酵后期碳源含量降低,不能满足菌体合成可得然胶的需要。刘惠等(不同的底物流加方式对Alcaligenes faecalis发酵生产热凝胶的影响,生物技术,2008年18(4):78-81)采用两段法优化可得然胶发酵生产,菌体生长阶段用氨水控制pH为7.0,在可得然胶合成阶段采用葡萄糖连续流加,可得然胶产量提高了157%。韩国Lee等人(Production of curdlan usingsucrose or sugar cane molasses by two-step fed-batch cultivation ofAgrobacterium species,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,1997,18:255-259)采用ATCC31749菌种,研究补加碳源对可得然胶发酵的影响,相对于没有补加碳源的对照,产量提高了20%。可得然胶是在氮源限制条件下产生的胞外多糖,当氮源充足,菌体只进行生物量的积累,而在氮源耗净时,菌体停止生长开始合成可得然胶(ntrB基因对Agrobacterium sp.ATCC 31749合成胞外多糖的调控研究,工业微生物,2011年第41卷第六期,26-33)。
但是本发明意外发现,在发酵中后期补加含有氮源的培养基,可得然胶产量不仅没有降低,而且还提高了40%左右,同时可得然胶产品质量也有所提升,产品关键性能指标凝胶强度增加了58%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用半连续培养、且补加培养基成分的方法生产可得然胶,可显著提高可得然胶产量,有助于降低可得然胶的生产成本。本发明在放料时间选择上,分为两个阶段,第一次放料补料时间为30-54h,第二次放料补料时间为60-84h。在这两个时间段内放料补料,均能增加菌体量和可得然胶产量。采用本发明工艺比放料补糖工艺可得然胶产量提高了40%,发酵液的凝胶强度提高了58%。当本发明产胶期溶氧控制在30%以上,相对于溶氧在10%以下的工艺,本发明可得然胶产量提高86.7%,凝胶强度提高了91.4%。
以下是本发明技术方案的详细描述。
本发明提供了一种发酵生产可得然胶的方法,将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养,发酵过程中进行放料补料,并且控制pH,溶氧浓度DO不低于30%,直至发酵培养结束。
具体步骤如下:
(1)从产可得然胶的菌株的斜面刮取一环菌接种到种子培养基中,振荡培养,得到活化的产可得然胶的菌株种子液;
(2)将步骤(1)中得到的种子液接种到发酵培养基中;
(3)在发酵48h时,放料发酵液,然后一次补料同样体积的步骤(2)所述的培养基,继续发酵,控制溶氧浓度DO;
(4)发酵至72h时,放料发酵液,然后一次流加同样体积的步骤(2)所述的培养基,继续发酵,控制溶氧浓度DO;
(5)将上述发酵结束后的发酵液加碱溶解,离心,上清用盐酸调节pH值,离心取沉淀,蒸馏水洗涤三次,烘干,即得到所述可得然胶。
步骤(1)中,所述产可得然胶的菌株包括土壤杆菌ATCC 31749、根瘤菌ATCC 31750或ATCC21680、或其他公开报道的能够生产可得然胶的菌株等中的一种或几种;优选地,为土壤杆菌ATCC 31749、根瘤菌ATCC 31750或ATCC21680。
步骤(1)中,所述种子培养基组成为:每升培养基中含有(g/L):蔗糖10-30,(NH4)2HPO43-8,KH2PO4 1-3,玉米浆2-4,MgSO4.7H2O 0.5-2,CaCO3 1-4;优选地,为每升培养基中含有(g/L):蔗糖20,(NH4)2HPO4 5,KH2PO4 1.5,玉米浆3,MgSO4.7H2O 1,CaCO3 3。
步骤(1)中,所述振荡培养的温度为28-32℃;优选地,为30℃。
步骤(1)中,所述振荡培养的转速为150-250r/min;优选地,为250r/min。
步骤(1)中,所述振荡培养的时间为16-20h;优选地,为18h。
步骤(2)中,所述发酵培养基成分为:每升培养基中含有(g/L):葡萄糖40-100、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO4 0.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl20.01、CaCO3 1-5;优选地,为每升培养基中含有(g/L):葡萄糖50、(NH4)2HPO41.5、酵母膏1、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O0.05、MnSO4·H2O 0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl20.01和CaCO33。
步骤(2)中,所述发酵条件优选为:转速500r/min,通气量1vvm,发酵96h。
步骤(2)中,所述接种体积为5%-10%(v/v);优选地,为10%(v/v)。
步骤(3)中,所述放料体积占培养基总体积的10%-30%;优选地,为25%。
步骤(3)中,所述补料体积占培养基总体积的10%-30%;优选地,为25%;
其中,所述放料体积与补料体积一样。
其中,所述培养基成分为:每升培养基中含有(g/L):葡萄糖40-100、(NH4)2HPO41-3、酵母膏0.5-1、KH2PO40.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl20.01、CaCO31-5;优选地,为每升培养基中含有(g/L):葡萄糖50、(NH4)2HPO41.5、酵母膏1g、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4·H2O0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01和CaCO33。
步骤(3)中,所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30%;优选地,为35%。
步骤(4)中,所述放料体积占培养基总体积的10-30%;优选地,为12.5%。
步骤(4)中,所述一次流体积占培养基总体积的10-30%;优选地,为12.5%。
其中,所述放料体积与一次流体积一样。
其中,所述培养基成分为:每升培养基中含有(g/L):葡萄糖40-100、(NH4)2HPO41-3、酵母膏0.5-1、KH2PO40.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl20.01、CaCO31-5;优选地,为每升培养基中含有(g/L):葡萄糖50、(NH4)2HPO41.5、酵母膏1、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.05、MnSO4·H2O0.02、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01和CaCO3 3。
步骤(4)中,所述发酵液中溶氧浓度DO不低于30%;优选地,为35%。
步骤(5)中,所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2等中的一种或几种;优选地,为NaOH。
步骤(5)中,所述碱液浓度为0.5-3mol/L;优选地,为1-3mol/L;进一步优选地,为1mol/L。
步骤(5)中,所述盐酸浓度为1-3mol/L;优选地,为3mol/L。
步骤(5)中,所述每次水洗加蒸馏水体积为50-150ml;优选地,为150ml。
步骤(5)中,所述烘干温度为50-100℃;优选地,为60℃。
步骤(5)中,所述上清用盐酸调节pH值为5.0-8.0;优选地,为7.0。
本发明的有益效果在于:本发明根据可得然胶发酵特点,利用半连续发酵的方法,把可得然胶产量从40g/L提高到了56g/L,提高了40%。所得可得然胶符合国标中对可得然胶的要求,可满足可得然胶的工业生产要求。本发明的方法提高了在发酵中后期生产可得然胶产胶的速率,工艺控制简单,节约生产成本,为微生物发酵生产可得然胶提供了新方法。
附图说明
图1为不同流加方式对可得然胶发酵菌体量的影响
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1(一次流加碳源)
(1)从实验室保藏的ATCC31749菌株斜面刮取一环到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中,于30℃、250r/min振荡培养18h,用作种子液;其中,种子培养基组成(g/L)为:蔗糖20g,(NH4)2HPO4 5g,KH2PO4 1.5g,玉米浆3g,MgSO4.7H2O 1g,CaCO3 3g。
(2)把步骤(1)ATCC31749菌的种子液接种到8L发酵培养基,接种体积为10%(v/v)。接种后于30℃、500r/min通气量为1vvm,培养96h;其中,发酵培养基组成(g/L)为:葡萄糖50g、(NH4)2HPO4 1.5g、酵母膏1g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.05g、MnSO4·H2O 0.02g、CoCl2·6H2O 0.01g、ZnCl20.01g和CaCO3 3g。
(3)发酵到48h,放料体积为总体积的25%,然后一次补加同等体积的浓度为50g/L葡萄糖溶液。继续发酵至96h,发酵结束。
(4)将上述发酵液10g加150ml碱溶解,离心,上清用盐酸调pH至7.0,离心取沉淀,蒸馏水洗涤三次,60℃烘干,即可得可得然胶样品,然后称重计算可得然胶产量。
(5)把步骤(4)得到的样品测定凝胶强度。测定凝胶强度的方法为:根据国标方法,取0.3g样品,加水15ml,然后高速匀浆10min,13000r/min,将匀浆好的悬浮液转至18mm×180mm的试管中,95℃水浴加热10min,自来水冷却降至室温,取其距底部10mm-15mm的部位平切,选用直径0.5cm不锈钢活塞式圆柱体探头,探头移动速速250mm/min。
实施例2(连续流加培养基)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例1相同。
(2)发酵至48h,放料体积为总体积的25%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为24h。发酵至72h时,继续放料,放料体积占总体积的12.5%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为12h。继续发酵至96h,。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在30%以上。流加的培养基成分为:每升培养基中含有(g/L):(NH4)2HPO41.5g、酵母膏1g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.05g、MnSO4·H2O 0.02g、CoCl2·6H2O 0.01g、ZnCl20.01g。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例3(一次流加培养基)
(1)发酵0-48h期间工艺与实施例1相同。
(2)发酵至48h,放料体积为总体积的25%,然后然后一次补加同等体积的培养基。发酵至72h时,继续放料,放料体占总体积的12.5%,然后一次补加同等体积的培养基。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在30%以上。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例4(控制产胶期溶氧20%-30%)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h,放料体积为总体积的25%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为24h。发酵至72h时,继续放,放料体积占总体积的12.5%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在20%-30%。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例5(控制产胶期溶氧10%-20%)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h,放料体积为总体积的25%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为24h。发酵72h时,继续放料,放料体积占总体积的12.5%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在10%-20%。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
实施例6(控制产胶期溶氧10%以下)
(1)发酵0-48h阶段工艺与实施例2相同。
(2)发酵到48h,放料体积为总体积的25%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为24h。发酵72h时,继续放料,放料体积占总体积的12.5%,然后缓慢补加同等体积的培养基,持续补加时间为12h。继续发酵至96h。在发酵过程中通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧浓度在10%以下。补料培养基成分同实施例2。
(3)按照实施例1的方法计算可得然胶产量和测定凝胶强度。
表1不同补料方式对发酵的影响
表2可得然胶发酵96产量和凝胶强度表格
从表1和表2及图1可以看出,本发明在放料后,一次补加同等体积的培养基,相对于放料后单纯补加碳源,可以提高可得然胶的产量,实施例2和实施例3分别提高40%和38%,同时凝胶强度分别提高了54.5%和58.2%。可得然胶生产速率在补加培养基后较单纯补加碳源的工艺提高了30%。
可得然胶发酵中后期,随着产量的增加,粘度也会增大,菌体也会逐渐的裂解死亡,碳源逐渐无法满足可得然胶合成需要,一般情况下是补充碳源。在可得然胶发酵中,已报道的补料有补加碳源(蔗糖、葡萄糖)[詹晓北.粪产碱杆菌在不同底物限制性条件下连续培养,2008]。本发明采用了半连续培养的方法,就是在发酵中后期放料,然后再补充碳源,但是这样会造成菌体量下降,营养因子被稀释等问题。在其他产品发酵时,会补加一定量的氮源,但是可得然胶是在氮源限制的条件下合成的,所以,目前还未有见到在发酵中后期补加氮源的报道。
但是本发明意外的发现在可得然胶发酵中后期,补加一定的培养基,不仅可以提供发酵需要的碳源,降低发酵液粘度,还能增加发酵体系中的营养因子,最主要的是可以增加菌体量,提高后期可得然胶的产量,同时提高了可得然胶产品的凝胶强度。
表3不同溶氧控制策略对可得然胶发酵的影响
根据表3可知,在产胶期控制溶氧30%以上的工艺可得然胶产量较溶氧控制10%-20%的工艺,及10%以下的工艺都高,产量提升86.7%,实施例4较实施例6凝胶强度提高了91.4%。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (5)
1.一种发酵生产可得然胶的方法,其特征在于,将产可得然胶的菌株种子培养液接入发酵培养基中培养,发酵过程中进行放料补料,并且控制pH和溶氧浓度DO不低于30%,直至发酵培养结束;所述DO不低于30%指DO为30%-35%;所述发酵培养基成分为:每升发酵培养基包括(g/L):葡萄糖40-50、(NH4)2HPO4 1-3、酵母膏0.5-1、KH2PO40.5-2、MgSO4·7H2O 0.1-1、FeSO4·7H2O 0.01-1、MnSO4·H2O 0.01-0.05、CoCl2·6H2O 0.01、ZnCl2 0.01、CaCO3 1-5;
所述步骤具体为:
(1)从产可得然胶的菌株的斜面刮取一环菌接种到种子培养基中,振荡培养,得到活化的产可得然胶的菌株种子液;
(2)将所述步骤(1)中得到的种子液接种到发酵培养基中;所述接种体积为5%-10%(v/v);
(3)在发酵48h时,放料发酵液,然后一次补料同样体积的步骤(2)所述的发酵培养基,继续发酵,控制溶氧浓度DO;所述放料体积占培养基总体积的10%-30%;所述补料体积占培养基总体积的10%-30%;其中,所述放料体积与补料体积一样;
(4)发酵至72h时,放料发酵液,然后一次流加同样体积的步骤(2)所述的发酵培养基,继续发酵,控制溶氧浓度DO;所述放料体积占培养基总体积的10%-30%;所述补料体积占培养基总体积的10%-30%;其中,所述放料体积与补料体积一样;
(5)将上述发酵结束后的发酵液加碱溶解,离心,上清用盐酸调节pH值,离心取沉淀,蒸馏水洗涤三次,烘干,即得到所述可得然胶;
所述产可得然胶的菌株选自土壤杆菌ATCC 31749。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述菌株种子的 培养基组成为:每升培养基中含有(g/L):蔗糖10-30,(NH4)2HPO43-8,KH2PO41-3,玉米浆2-4,MgSO4.7H2O0.5-2,CaCO31-4。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述振荡培养的温度为28-32℃;和/或,所述振荡培养的转速为150-250r/min;和/或,所述振荡培养的时间为16-20h。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述发酵的 条件为:转速500r/min,通气量1vvm,发酵96h。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2中的一种或几种;和/或,所述碱液浓度为0.5-3mol/L;和/或,所述盐酸浓度为1-3mol/L;和/或,所述每次水洗加蒸馏水体积为50-150ml;和/或,所述烘干的 温度为50-100℃;和/或,所述上清用盐酸调节pH值为5.0-8.0。
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2018
- 2018-03-16 CN CN201810219817.6A patent/CN108467876B/zh active Active
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Hong-Tao Zhang 等.Improved curdlan fermentation process based on optimization of dissolved oxygen combined with pH control and metabolic characterization of Agrobacterium sp. ATCC 31749.《Appl Microbiol Biotechnol》.2011,第93卷(第1期), * |
Improved curdlan fermentation process based on optimization of dissolved oxygen combined with pH control and metabolic characterization of Agrobacterium sp. ATCC 31749;Hong-Tao Zhang 等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20110708;第93卷(第1期);第368页右段Materials and methods部分-第369页左栏第1-3段、图1 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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