CN103592386B - 一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法。检测方法步骤包括：(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；(2)用液相质谱联用(LC-MS)分析衍生后的样品；所述的衍生试剂包含D3PMP，D5PMP，D8PMP和PMP。本发明的三种氘代衍生试剂可以与普通PMP任意组合联用，也可任意几种联用。将已知量的标准品和未知样品用不同衍生试剂衍生，用LC-MS分析，可以对微量单糖和糖胺聚糖酶解二糖进行定性和定量。该方法可同时对4种样品进行分析，可同时对3种未知量样品进行定量，检测样品用量少，操作耗时短。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法。
背景技术
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(简称PMP)，又以脑保护剂“依达拉奉”闻名，在临床上主要用于用于治疗脑梗塞引起的神经病变，在糖结构研究中则做为一种衍生制剂，由Honda于1989年最先用于糖链的衍生，PMP作为衍生制剂的优点是可以在温和的条件下与还原糖链进行定量反应，不损失唾液酸，产物没有立体异构体，紫外吸收强，糖链经PMP衍生后，其疏水性提高的同时，衍生产物带电荷，易于电离，可以用多种离子模式对其进行分析，用其作为衍生试剂，可以进行单糖的组成分析，检测限可以达到pmol，同时也可以用于寡糖链的分离和纯化，还可以提高糖链的基质辅助激光解析飞行质谱检测的灵敏度。其和糖类反应机理为，1，3位取代的吡唑啉酮试剂的4位碳存在α-氢，在碱性环境下离去成为烯醇式负离子，和糖类物质的还原端进行醛酮缩合反应，在加热条件下失水，形成具有α，β-不饱和酮结构的单分子衍生物，此单分子衍生物会继续与另一分子吡唑啉酮试剂的烯醇式负离子进行Michael1，4加成反应，最后定量生成具有强烈紫外吸收的双PMP衍生产物。该方法已经广泛应用于具有还原端的糖类分析，如专利CN101118230公开了用0.5mol／LPMP甲醇溶液检测虫草多糖的单糖组成。专利CN200810013642公开了用PMP衍生结合液相色谱分析样品中喹诺糖的含量。专利CN200810016622公开了用PMP衍生结合高效液相色谱检测海参制品中海参多糖的含量。
液相色谱质谱联用(LC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离***，质谱作为检测***，液相色谱质谱联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
同位素具有相同的化学性质，离子化能力一致，在液相上的保留时间也是相同，用同位素试剂衍生未知含量和已知量的样品，可以在同一个时间内分析多个样品，使用已知量样品可以对未知样品进行准确定量，从而使质谱法成为一种可以对样品进行精确定量的方法。
糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元(氨基己糖和己糖糖醛酸)组成的线性高分子多糖，分为肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素等。线性高分子糖胺聚糖用酶降解便能得到糖胺聚糖酶解二糖，如将肝素用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III等肝素酶降解，将硫酸软骨素用硫酸软骨素酶ABC降解得到相应的糖醛酸脱水二糖。不同种类的糖胺聚糖所具有的二糖重复单元不同，如肝素和硫酸乙酰肝素的重复二糖单元是艾杜糖醛酸(IdoA)或葡萄糖醛酸(GlcA)和葡萄糖胺(GlcN)；硫酸软骨素的二糖重复单元是葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)。不同种类的糖胺聚糖硫酸化程度不同，硫酸化位置亦不同，如肝素比硫酸乙酰肝素在葡萄糖胺的N硫酸化(GlcNS)程度高，而乙酰化(GlcNAc)程度低；硫酸软骨素A在半乳糖胺的4位硫酸化(GalNAc4S)，而硫酸软骨素C在半乳糖胺的6位硫酸化(GalNAc6S)。糖胺聚糖有多种生物活性，如肝素是临床首选的抗凝药物；硫酸乙酰肝素是细胞表面的信号传导的重要分子；软骨素类，透明质酸类都有相关的药物或保健品已上市。2008年，污染肝素事件造成了至少149人死亡，究其原因，是对糖胺聚糖这类结构复杂的多糖研究技术和方法上存在缺陷，所以确定糖胺聚糖的单糖和二糖是非常必要的。
目前常用的检测方法在各种各样的缺点，如用质谱法分析样品必须先进行质子化，而这一过程受外界环境，样品中盐浓度，仪器状态诸多因素影响，无法用于定量分析。PMP衍生结合高效液相色谱法虽然可以对样品进行定量分析，但需要首先绘制各单糖的标准曲线，然后再计算出待测样品的浓度，检测限高，样品消耗量大，一次只能检测一个样品，耗时长。用普通PMP衍生试剂获得的分离糖PMP衍生物受紫外检测器灵敏度和单糖本身差异较小的限制，需要标准品和较多的糖样品才能准确分析，不仅步骤繁琐，而且对于珍贵的生物样品来说也是一种浪费。普通衍生方法及试剂(如苯胺和氘代苯胺)最多能同时进行2种样品的分析，最多能对1种未知样品定量。当样品种类较多时，用传统的方法检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，传统的方法已经不能够满足需要，因此亟需找到一种操作步骤简单，省时，样品消耗量小，灵敏度高的检测方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测单糖和二糖的方法，该方法可对单糖和糖胺聚糖酶解二糖进行定性和定量分析。
本发明的另一目的是提供三种衍生试剂1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)的制备方法。
实现上述发明的技术方案是：
1.一种检测单糖和二糖的方法，包括如下步骤：
(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；
(2)用LC-MS分析衍生后的样品；
所述的衍生试剂包含1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；
所述的衍生试剂PMP与D3PMP、D8PMP中任意一种联用；
所述的衍生试剂PMP与D3PMP、D5PMP、DSPMP任意两种或三种联用；
所述的衍生试剂D3PMP、D5PMP、D8PMP任意几种联用。
2.一种检测单糖和二糖的方法，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元，所述的二糖为酶解糖胺聚糖所得的二糖。
3.制备衍生试剂D3PMP的方法，包括如下步骤：
(1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；
(2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；
(3)取苯肼加入乙醇中，再加入步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤得D3PMP；
所述的氘代乙酸和乙醇体积比为1：2-5；
所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯物质的量比为1：0.2-0.8。
化学反应方程式如下：
4.制备衍生试剂D8PMP的方法，包括如下步骤：
(1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯。
(2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯。
(3)取30％盐酸与水，滴加氘代苯胺，在0-5℃条件下滴加71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0-5℃反应3-5h，得重氮化氘代苯。向重氮化氘代苯中加入亚硫酸氢钠，25％氨水和水，升温至70～85℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐。向氘代苯肼盐酸盐中加入水，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至10-11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到氘代苯肼。
(4)将步骤(3)所得的氘代苯肼溶于乙醇中，加入步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤，得D8PMP。
所述的氘代乙酸和乙醇体积比为1∶2；
所述的氘代苯胺与亚硝酸钠物质的量之比为1：1；
所述的氘代苯肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1：0.7。
化学反应方程式如下：
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的三种氘代衍生试剂可以与普通PMP任意组合联用，也可任意几种联用，将已知量的标准品和未知样品分别用不同衍生试剂衍生，用LC-MS分析，可以对微量单糖和糖胺聚糖酶解二糖进行定性和定量。该方法可同时对4种样品进行分析，可同时对3种未知量样品进行定量，大大减少了了样品的用量，节约了样品定性和定量的检测时间。4种衍生试剂在质谱上质量数相差较大，并且样品被质量数较大的4种衍生试剂衍生后很容易被质谱检测到，提高了灵敏度。这种同时进行多样品分析的方法使结果的准确性和可靠性大大增加。
附图说明
图1为八种单糖标准品的色谱图(A)和总离子流图(B)。
图2为PMP、D3PMP衍生的葡萄糖醛酸的质谱图。
图3为PMP、D5PMP、D8PMP衍生的葡萄糖胺的质谱图。
图4为D3PMP、D8PMP衍生的葡萄糖的质谱图。
图5为D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的葡萄糖胺的质谱图。
图6为PMP、D3PMP、D5PMP和D8PMP衍生的葡萄糖的质谱图。
图7为PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生的糖胺聚糖酶解二糖的总离子流图和质谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实例，进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1D3PMP的制备
(1)在50mL三口瓶中加入10mL氘代乙酸、20mL乙醇、3.7g氯化亚锡，摇匀后，80℃加热回流2h，使用蒸馏装置将有愉快香味的液体蒸出，得到氘代乙酸乙酯混合物18mL，将所得的氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯7mL。
(2)向7mL干燥的氘代乙酸乙酯中加入3g金属钠，冷凝回流，再加入15mL50％的醋酸，并调节pH至6.5，用等体积的饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用1g无水硫酸钠进行干燥，得到3mL氘代乙酰乙酸乙酯。
(3)将3mL苯肼加入10mL乙醇中，再加3mL步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于80℃条件下反应10h，冷却过滤，得到1.9g黄色沉淀，即D3PMP。
实施例2D3PMP的制备
(1)在50mL三口瓶中加入10mL氘代乙酸、50mL乙醇、3.7g氯化亚锡，摇匀后，80℃加热回流2h，使用蒸馏装置将有愉快香味的液体蒸出，得到氘代乙酸乙酯混合物20mL，将所得的氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯10mL。
(2)向10mL干燥的氘代乙酸乙酯中加入8g金属钠，冷凝回流，再加入12mL50％的醋酸，并调节pH至6.5，用等体积的饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用2g无水硫酸钠进行干燥，得到2mL氘代乙酰乙酸乙酯。
(3)将8.3mL苯肼加入10mL乙醇中，再加入2mL步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于80℃条件下反应10h，冷却过滤，得到0.6g黄色沉淀，即D3PMP。
实施例3D5PMP的制备
(1)取30mL30％的盐酸与20mL水，滴加氘代苯胺10mL，在0-5℃条件下滴加10mL71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0-5℃反应4h，得重氮化氘代苯。向重氮化氘代苯中加入30g亚硫酸氢钠，10g25％氨水和15mL水，升温至80℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐。向氘代苯肼盐酸盐中加水20mL，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到6mL氘代苯肼。
(2)取6mL步骤(1)所得氘代苯肼加入10mL乙醇中，加入7mL乙酰乙酸乙酯，于80℃条件下反应10h，冷却过滤，得到3.7g黄色沉淀，即为D5PMP。
实施例4D8PMP的制备
(1)在50mL三口瓶中加入10mL氘代乙酸、20mL乙醇、3.7g氯化亚锡，摇匀后于80℃加热回流2h，使用蒸馏装置将有愉快香味的液体蒸出，得到氘代乙酸乙酯混合物18mL，将所得的氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯7mL。
(2)向7mL干燥的氘代乙酸乙酯中加入3g金属钠，冷凝回流，再加入15mL50％的醋酸，并调节pH至6.5，用等体积的饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用1g无水硫酸钠进行干燥，得到3mL氘代乙酰乙酸乙酯。
(3)取30mL30％的盐酸与20mL水，滴加氘代苯胺10mL，在0～5℃条件下滴加10mL71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0-5℃反应4h，得重氮化氘代苯。向重氮化氘代苯中加入30g亚硫酸氢钠，10g25％氨水和15mL水，升温至80℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐。向氘代苯肼盐酸盐中加水20mL，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到6mL氘代苯肼。
(4)将3mL步骤(3)所得的氘代苯肼溶于10mL乙醇，加入3mL步骤(2)所得的氘代乙酰乙酰乙酯，于60℃条件下反应10h，得到黄色沉淀，冷却过滤，得1.75gD8PMP。
实施例1-4的产物收率见表1。
表1收率
| 收率(％) | |
| 实施例1 | 7 |
| 实施例2 | 2 |
| 实施例3 | 20 |
| 实施例4 | 7 |
由表1可知，优选实施例1的收率比实施例2高2.5倍。实施例3的收率为20％，实施例4的收率为7％。
实施例5用实施例1、3、4所得衍生试剂衍生单糖和LC-MS分析
将PMP／D3PMP／D5PMP／D8PMP配成0.5mol／L甲醇溶液，在氨水碱性介质下和葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖于70℃条件下反应90min。反应完毕后，用氯仿萃取三次，离心，取上清液，进行LC-MS分析。液相条件：液相柱0.3×250mmSB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相条件：流动相17％B15min，17％B30min线性增加到21％B，21％B15min线性增加到23％B，17％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。质谱为电喷雾质谱负离子模式。结果见图1和表2。
由图1A色谱图可知，八种单糖标准品用本发明方法得到了很好的分离；由图1B总离子流图可知，这八种单糖组分的衍生物都在质谱上有明显高于背景的离子峰。
表2单糖PMP衍生后的分子量
结果显示，D3PMP衍生物的质量数比PMP衍生物大6，D5PMP衍生物的质量数比PMP衍生物大10，D8PMP衍生物的质量数比PMP衍生物大16，说明PMP／D3PMP／D5PMP／D8PMP与中性糖、酸性糖、氨基糖的还原端成功进行了反应，同1种单糖用不同氘代试剂衍生在质谱上可以得到一组峰。
实施例6单糖定性定量分析
将葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖标准品(2nmol／uL)用D3PMP衍生，待测样品用PMP进行衍生，进行LC-MS分析。衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5，上样体积均为0.02uL。结果如图2。
实验结果显示，未知样品含有葡糖糖醛酸。由图2的相对离子丰度可知，待测样品中葡萄糖醛酸的含量为1.34nmol／uL。
实施例7两种未知样品的定性定量分析
将葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖标准品(2nmol／uL)用D5PMP衍生，两种待测样品分别用PMP、D3PMP进行衍生，进行LC-MS分析。衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5，上样体积均为0.02uL。结果如图3。
实验结果显示，两种未知样品含有葡糖糖胺。由图3的相对离子丰度可知，两种待测样品中，D3PMP衍生的葡糖糖胺含量为2.79nmol／uL，PMP衍生的葡萄糖胺含量为4nmol／uL。
实施例8一种未知样品的定性定量分析
将葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖标准品(2nmol／uL)用D5PMP衍生，待测样品用D8PMP进行衍生，进行LC-MS分析。衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5，上样体积均为0.02uL。结果如图4。
实验结果显示，未知样品含有葡糖糖。由图4的相对离子丰度可知，待测样品中，D8PMP衍生的葡糖糖含量为4.17nmol／uL。
实施例9两种未知样品的定性定量分析
将葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖标准品(2nmol／uL)用D5PMP衍生，两种待测样品分别用D3PMP、D8PMP进行衍生，进行LC-MS分析。衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5，上样体积均为0.02uL。结果如图5。
实验结果显示，两种未知样品含有葡糖糖胺。由图5的相对离子丰度可知，两种待测样品中，D3PMP衍生的葡糖糖胺含量为1.44nmol／uL，D8PMP衍生的葡萄糖胺含量为1.04nmol／uL。
实施例10三种未知样品的定性定量分析
将葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖胺、甘露糖、木糖、半乳糖、半乳糖胺、***糖8种单糖标准品(2nmol／uL)用D5PMP衍生，3种待测样品分别用PMP、D3PMP、D8PMP进行衍生，LC-MS分析。衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5，上样体积均为0.02uL。结果如图6。
实验结果显示，三种未知样品含有葡糖糖。由图6的相对离子丰度可知，两种待测样品中，D3PMP衍生的葡糖糖含量为1.41nmol／uL，PMP衍生的葡糖糖含量为2.35nmol／uL，D8PMP衍生的葡糖糖含量为1.06nmol/uL。
实施例11两种未知糖胺聚糖酶解二糖的定性定量分析。
将硫酸软骨素二糖标准品UA-GalNAc6S，UA-GalNAc4S，UA2S-GalNAc各10ug，用D5PMP衍生。未知含量的硫酸软骨素CS1，CS2，CS3各加入200uL酶解液(50mmol／LTris-HCl缓冲液，pH7.3，含0.01％牛血清白蛋白、100mmol／LNaCl、0.1u软骨素酶ABC)，37℃水浴中酶解48h，沸水中灭活5min，超滤离心15min(MWCO3000)，冻干。将CSl酶解二糖产物用PMP衍生，CS2用D3PMP衍生，CS3用D8PMP衍生。取相同体积衍生后的CS1、CS2、CS3及标准品衍生物混合后LC-MS分析，衍生方法及LC-MS分析方法同实施例5。液相条件：液相柱0.3×250mmSB-C18柱(5um，Agilent)，流速10uL／min，流动相A为0.01mol／L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相条件：流动相15％B15min，17％B30min线性增加到20％B，20％B15min线性增加到23％B，17％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。质谱为电喷雾负离子模式。结果如图7。
如图所示，A为四种样品的总离子流图；B为峰1的质谱图，对应的标准品是D5PMP衍生的UA-GalNAc6S；C为峰2的质谱图，对应的标准品是D5PMP衍生的UA-GalNAc4S；D为峰3的质谱图，对应的标准品是D5PMP衍生的UA2S-GalNAc。图中m／z=788.24是衍生后的CS1的质量数，m／z=792.26是衍生后的CS2的质量数，m／z=798.27是标准品的质量数，m／z=804.29是衍生后的CS3的质量数。由图可知，CS1中含有5ugUA-GalNAc6S和9.1ugUA-GalNAc4S，CS2中含有3.2ugUA-GalNAc6S和7.7ugUA-GalNAc4S，CS3中含有9.3ugUA-GalNAc6S和3.2ugUA-GalNAc4S，所有样品中均不含有UA2S-GalNAc。
实施例5-11单糖或糖胺聚糖酶解二糖与PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP的反应方程式如下：
X=H或D；Y=H或D。
反应式中的葡萄糖可以为其他单糖或糖胺聚糖酶解二糖，当X=H，Y=H时反应物为PMP，当X=D，Y=H时反应物为D3PMP，当X=H，Y=D时反应物为D5PMP，当X=D，Y=D时反应物为D8PMP。
Claims (3)
1.一种检测单糖和二糖的方法，包括如下步骤：
(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；
(2)用液相色谱质谱联用(LC-MS)分析衍生后的样品；
其特征在于，所述的衍生试剂为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮与1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮中任意一种联用；或者，所述的衍生试剂包含1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮与1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮或1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮任意两种或三种联用；或者，所述的衍生试剂包含1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮或1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮或1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮任意几种联用；
所述的液相色谱质谱联用分析条件包括，液相柱0.3mm×250mmSB-C18柱5μm，Agilent，流速15μL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02μL；流动相17％B15min，17％B30min线性增加到21％B，21％B15min线性增加到23％B，17％B15min，紫外检测器DAD245nm检测；质谱为电喷雾质谱负离子模式；
所述衍生试剂1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮的制备方法包括如下步骤：
①取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；
②向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；
③取苯肼加入乙醇中，再加入步骤②所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤得1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮；
步骤①所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1∶2-5；
步骤③所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1∶0.2-0.8；
所述衍生试剂1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮的制备方法包括如下步骤：
④取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl2及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；
⑤向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；
⑥取30％盐酸与水，滴加氘代苯胺，在0-5℃条件下滴加71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0-5℃反应3-5h，得重氮化氘代苯，向重氮化氘代苯中加入亚硫酸氢钠，25％氨水和水，升温至70～85℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐，向氘代苯肼盐酸盐中加入水，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至10-11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到氘代苯肼；
⑦将步骤⑥所得的氘代苯肼溶于乙醇中，加入步骤⑤所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤，得1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮；
步骤④所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1∶2；
步骤⑥所述的氘代苯胺与亚硝酸钠的物质的量之比为1∶1；
步骤⑦所述的氘代苯肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1∶0.7。
2.如权利要求1所述的一种检测单糖和二糖的方法，其特征在于，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元，所述的二糖为酶解糖胺聚糖所得的二糖。
3.如权利要求1所述的一种检测单糖和二糖的方法，其特征在于，步骤①所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1∶2；步骤③所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1∶0.8。
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Non-Patent Citations (3)
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| Relative quantitation of glycans using stable isotopic labels 1-(d0/d5) phenyl-3-methyl-5-pyrazolone by mass spectrometry;Ping Zhang等;《Analytical Biochemistry》;20111101;第418卷(第1期);第3-5页"Derivatization of free glycans with d0/d5-PMP"和"ESI-MS analysis of PMP-labeled glycans"节 * |
| The Base-catalyzed Deuteration of Hydrogen in Methyl Group Substituted at 3-position of Pyrazolone Ring;Tsuyoshi GoRoMARu等;《Chem. Pharm. Bull.》;19781231;第26卷(第7期);第2258-2261页 * |
| 糖类物质的衍生化试剂———氘代 PMP 和类似物的合成及其衍生化性能;张萍等;《合成化学》;20130630;第21卷(第3期);第262-266页 * |
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