CN111269989A

CN111269989A - 猪mid1基因作为死亡率相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111269989A
Application number: CN202010092404.3A
Authority: CN
Inventors: 朱猛进; 安美景; 赵书红; 李新云; 刘小磊; 张从林; 赵云翔; 赵志超; 管石胜; ***
Original assignee: Guangxi Yangxiang Co ltd; Huazhong Agricultural University
Current assignee: Guangxi Yangxiang Co ltd; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111269989B

Abstract

本发明提出了与仔猪死亡率相关的SNP标记，所述SNP标记选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位核苷酸，为碱基C或T。利用该分子标记可准确预测不同基因型群体猪之间死亡率性状的差别，准确、高效地选育出母猪繁殖能力佳的优良猪品种，具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。在猪育种工作中，该分子标记可作为死亡率性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

Description

猪MID1基因作为死亡率相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及猪MID1基因作为死亡率相关的分子标记及其应用。更具体地，本发明涉及仔猪死亡率相关的SNP标记及其应用。

背景技术

随着我国居民生活水平的提高，人们对肉类食物的需求逐渐增加。在人们对肉类需求增长的推动下，我国养殖业增长迅速。2019年10月14日发布的《中国的粮食安全》***中显示2018年***、牛、羊肉的人均占有量为46.8公斤，比1996年增加了16.6公斤，增长55％。在我国养殖业提供各类肉品中，猪肉是最大宗的肉类消费品，约占消费肉类的63％左右。根据2012年的年鉴数据，生猪产值占了农业总产值的18％，是我国单项产值最大的农产品，产值规模相当于水稻、小麦和玉米等主要作物的产值总和。不过，目前我国居民人均肉类消费水平仍远低于欧美发达国家，我国养猪生产效率远不能完全满足我国居民对肉类消费日益增加的需求。

繁殖性状是影响养殖效益的重要经济性状，直接制约母猪的繁殖力和养殖场的收益。对繁殖性状进行遗传改良，提高猪的繁殖性能是提高养殖效益有效途径。母猪的总产仔数、死胎数、断奶仔猪数、窝产仔猪体重及性别比例等是衡量母猪繁殖性能的重要指标，并受到诸多因素的影响。母猪第一胎的繁殖性能通常表现不佳，提高第一胎的繁殖能力可有效提高母猪的繁殖性能。母猪繁殖能力主要体现为产仔数的构成，包括总产仔数、产活子数、弱仔数、死仔数、木乃伊数等，其中由总产仔数、死仔数、木乃伊数构建的死亡率指标是度量母猪繁殖性能的常用指标之一，死亡率等于母猪第一胎次分娩当日的总死亡仔数除以总出生仔数，其中总死亡数等于死胎数加木乃伊个体数。通过育种从遗传上改良母猪的死亡率性状可从根本上提高母猪的繁殖效率。死亡率性状是低遗传力性状，常规育种手段进展缓慢，挖掘猪死亡率的分子标记，通过分子辅助选择可加快猪死亡率性状的改良进程。

然而，目前针对仔猪死亡率的SNP标记仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了与仔猪死亡率相关的SNP标记、用于检测该SNP标记的引物组和试剂盒及其应用、预测仔猪死亡率的方法和***以及猪选育***。由此，利用该分子标记可准确预测不同基因型群体猪之间死亡率性状的差别，准确、高效地选育出母猪繁殖能力佳的优良猪品种，具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。在猪育种工作中，该分子标记可作为死亡率性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

其中，需要说明的是，SNP(single nucleotide polymorphism,SNP，即单核苷酸多态性)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、***和缺失等。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种与仔猪死亡率相关的SNP标记。根据本发明的实施例，所述SNP标记选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位核苷酸，为碱基T或C。

在猪的基因组中，MID1(E3泛素连接酶中间体1)位于23号染色体及X性染色体。在细胞水平上，MID1与微管结合，作为一种泛素E3连接酶，靶向蛋白磷酸酶2A(PP2A)进行泛素介导的调控。研究发现在多个癌症中，包括大肠癌和乳腺癌，PP2A水平显著下调。PP2A在致癌作用中扮演许多角色，包括调节细胞凋亡、增殖、细胞迁移、细胞骨架重排和调节细胞周期。作为一种PP2Ac的负调节剂，MID1通过MID1-PP2A复合物发挥作用。在人的胚胎发育过程中，MID1是胚胎健康发育所必不可少的基因。研究研究表明，MID1的突变与Opitz G/BBB综合征(XLOS)有关。Opitz综合征是一种影响中线结构器官发育的罕见遗传病。此外，MID1在小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)中被强烈上调，它对溶出颗粒的胞吐和CTLs的杀伤能力有显著影响。

发明人发现，MID1基因在猪的生长发育过程中扮演了重要的角色，该基因突变可能导致猪胚胎的发育缺陷甚至死亡，进而，发明人通过实验证实了MID1基因上的一个SNP变异与猪的死亡率显著相关，该SNP标记位于猪23号染色体MID1基因的核苷酸序列上，即序列SEQ ID NO：1，标记位置为第145位的T＞C单核苷酸突变，也对应猪的全基因组(Sscrofa11.1)第X号染色体上第7313289位核苷酸，RS号为rs322441313(同物异名：WU_10_2_X_7708900)。由此，利用根据本发明实施例的SNP标记可准确预测不同基因型群体猪之间死亡率性状的差别，准确、高效地选育出母猪繁殖能力佳的优良猪品种，具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。在猪育种工作中，该分子标记可作为死亡率性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

GGGGTGGGAATCTAACCCATCCCTGCAAGTGACAATGGATTAGGACTTTGGACATTCAAGTTGGCCCCTAGCAGAATACATGTCATCCAAGATCAGATAAGTGTCCACAAGATACAAACAGAATGTGTGGCAATTAGTCATTCTR(T/C)

TCATAGTTTTTCTCTACCATCTCATAGTAGATTCAGTCATTGGTTACCTGTAATTCCCAAAATGAGTATCTATTACGTGTATGCGTATTGTGTTCCCTATGAAAGAACGGGATTCTCAGAAGGTGTGGAGAATATGATATGCATCATTGATTCTA(SEQ ID NO：1)

根据本发明的实施例，上述与仔猪死亡率相关的SNP标记还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T的仔猪死亡率。由此，进一步准确、高效地选育出母猪繁殖能力优的品种，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于检测前面所述SNP标记的引物组。根据本发明的实施例，所述引物组包括：SEQ ID NO：2和3所示的核苷酸序列。由此，利用根据本发明实施例的引物组可以特异性扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位核苷酸，从而可以有效地对扩增产物的SNP位点进行测序，从而确定其基因型，以便于准确预测仔猪死亡率性状，高效地选育出母猪繁殖能力优的品种。

5’-CCCATCCCTGCAAGTGACAA-3’(正向引物，SEQ ID NO：2)

5’-CAGCTGCAGAACTTCGCATT-3’(反向引物，SEQ ID NO：3)

需要说明的是，前面针对与仔猪死亡率相关的SNP标记所描述的特征和优点，同样适用于该用于检测SNP标记的引物组，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测前面所述SNP标记的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的引物组。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以特异性扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位核苷酸，从而可以有效地对扩增产物的SNP位点进行测序，确定其基因型，以便于准确预测与仔猪死亡率相关性状，高效地选育出母猪繁殖能力优的品种。

需要说明的是，前面针对用于检测SNP标记的引物组所描述的特征和优点，同样适用于该用于检测SNP标记的试剂盒，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述与仔猪死亡率相关的SNP标记或前面所述引物组或前面所述试剂盒在预测仔猪死亡率中的应用。由此，可以预测与仔猪死亡率相关性状，准确、高效地选育出母猪繁殖能力优的品种。此外，利用本发明的SNP标记进行猪分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。

需要说明的是，前面针对与仔猪死亡率相关的SNP标记、用于检测SNP标记的引物组和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种预测仔猪死亡率的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过对待测母猪进行前面所述的SNP标记的检测，预测所述待测母猪的仔猪死亡率。如前所述，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位碱基处的R为C或T的等位基因突变，产生了核苷酸多态性，该分子标记可以作为预测与仔猪死亡率相关的分子标记，第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于第145位的碱基为T的仔猪死亡率。

由此，利用根据本发明实施例的方法可准确预测不同基因型群体猪之间死亡率性状的差别，准确、高效地选育出母猪繁殖能力佳的优良猪品种，具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。在猪育种工作中，该分子标记可作为死亡率性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

根据本发明的实施例，所述方法包括：提取所述待测母猪的基因组DNA；利用前面所述的引物组，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行测序，并基于测序结果预测所述待测母猪的仔猪死亡率；其中，所述SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T的仔猪死亡率。

需要说明的是，前面针对与仔猪死亡率相关的SNP标记、用于检测SNP标记的引物组和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该预测仔猪死亡率的方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种预测仔猪死亡率的***。根据本发明的实施例，所述***包括：扩增单元，所述扩增单元适于利用前面所述引物组或前面所述试剂盒对待测母猪的基因组DNA进行扩增；测序单元，所述测序单元与所述扩增单元相连，适于对所述扩增所得到的扩增产物进行测序，确定前面所述SNP标记；预测单元，所述预测单元与所述测序单元相连，适于基于所述SNP标记预测所述待测母猪的仔猪死亡率，其中，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T的仔猪死亡率。

由此，可以准确预测不同基因型群体猪之间死亡率性状的差别，准确、高效地选育出母猪繁殖能力佳的优良猪品种，具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。在猪育种工作中，该分子标记可作为死亡率性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

需要说明的是，前面针对与仔猪死亡率相关的SNP标记、用于检测SNP标记的引物组和试剂盒所描述的特征和优点，同样适用于该预测仔猪死亡率的***，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种猪选育***。根据本发明的实施例，所述猪选育***包括：候选猪获取设备，所述候选猪获取设备用于提供多头候选母猪；性状预测设备，所述性状预测设备与所述候选猪获取设备相连，所述性状预测设备为前面所述预测仔猪死亡率的***，并且用于预测所述待测母猪的仔猪死亡率；和培育设备，所述培育设备与所述性状预测设备相连，所述培育设备用于基于所述性状预测设备的预测结果，选择并培育仔猪死亡率低的候选母猪。由此，利用根据本发明实施例的猪选育***可以选育出母猪繁殖能力优的猪品种，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

根据本发明的实施例，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T是仔猪死亡率低的指示。由此，可以选育出母猪繁殖能力优的猪品种，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

需要说明的是，前面针对预测仔猪死亡率的***所描述的特征和优点，同样适用于该猪选育***，在此不再赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的筛选与仔猪死亡率相关的技术流程图；

图2显示了根据本发明一个实施例的所用芯片质控后的结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的运用混合线性模型计算所得死亡率育种值得分布图；

图4显示了根据本发明一个实施例的死亡率育种值的全基因组关联分析结果示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，参考图1，通过下列方法筛选与仔猪死亡率相关的分子标记。

1、猪数据收集

(1)表型数据收集

本发明所用的记录表型数据的猪为来自广西扬翔股份有限公司的6073头健康的母猪，品种包括大白、长白和杜洛克。本研究使用的系谱信息为包含了这6073头母猪的系谱信息，涉及个体为35313头。数据的时间跨度从2014到2018年，包括每头母猪分娩时的日期，以及每头母猪第一次分娩当天的总出生个体数、总死亡个体数、死胎数和木乃伊数。其中，总死亡个体数等于死胎数加木乃伊数。本发明研究的死亡率性状为总死亡个体数占总出生个体数的百分比。

(2)基因数据收集

用猪的耳朵组织来提取DNA，在此之前所有样品保存在-20℃冰箱。使用TIANGEN提供的试剂盒，根据厂商所给的操作方案提取DNA。通过此方法共提取了1331头母猪的DNA样品。使用Illumina PorcineSNP50 Bead Chip构建基因型，涉及的50,697个SNP全部匹配到Sus scrofa genome 11.1全基因组上。参见图2，用beagle对数据进行填充。用plink对基因型进行质控，剔除检出率(Call，rate)小于90％，剔除最小等位基因频率(Minor allelefrequency，MAF)小于1％，共有47,241个SNP用于死亡率性状的关联分析。

2、死亡率遗传参数估计

用hiblup利用系谱信息对死亡率的遗传参数进行基于系谱数据的最佳无偏估计(ABLUP)，将猪的品种、出生季节作为固定效应求EBV(Estimates breeding value)。

所用的线性模型为：y＝Xβ+Zu+e

y为观测值，及死亡率，β是固定效应向量，包含群体均值、品种和出生季节。其中，服从于u～N(0，G)的u为育种值，这里的

为加性遗传方差，A为基于系谱的加性遗传方差矩阵。

为残差方差，β和u分别为X和Z的设计矩阵，参见图3。

3、死亡率EBV与SNP的全基因组关联分析及验证

1)关联分析

使用混合线性模型(MLM，Mixed Linear Model)，对EBV和所有的质控后的SNP进行关联分析。

所用的混合线性模型为：y＝Xa+Ku+e

y为死亡率的EBV，a为SNP基因的固定效应，u为随机效应，e为残差，X,K为a和u对应的设计矩阵。

表1MID1基因与死亡率育种值的关联分析结果

SNP	染色体号	位置	P-value
				rs322441313	23	7313289	4.08e-06

其中，扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的引物、扩增体系和PCR条件如下。

(1)猪MID1基因的引物序列如下：

正向引物：5’-CCCATCCCTGCAAGTGACAA-3’

反向引物：5’-CAGCTGCAGAACTTCGCATT-3’

(2)扩增体系

上下游引物(10umol)各0.2ul，Taq酶0.05ul，DNA模板1ul，10×Taq PCR Buffer1ul，dNTP Mix(10mM)0.2ul，RNase free water补充至总体积10ul。

(3)PCR条件

95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3min。

2)显著SNP的检验

将真实表型数据的顺序随机打乱10000次，与真实基因型进行了10000次的关联分析，并且记录每次rs322441313的P-value。将10000个P-value由低到高排序，记P₀为前2.5％P-value的临界值。P₀大于4.08E-06则证明用真实数据检测到的rs322441313为显著性位点。

同时，对不同的基因型与死亡率进行T检验，因为P<0.01为差异极显著，从表2可知，不同基因型和死亡率的差异显著。

表2 rs322441313多态性以及不同基因型对猪第一胎分娩日死亡率的影响

由表2可知，对于猪第一胎分娩日死亡率性状基因型为CC的个体显著低于TT个体，说明基因型为CC的个体可以有效降低死亡率，所以C是有利于母猪繁殖降低死亡率的等位基因。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西扬翔股份有限公司，华中农业大学

<120> 猪MID1基因作为死亡率相关的分子标记及其应用

<130> PIDC3196639

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<220>

<221> misc_feature

<222> (145)..(145)

<223> r为t或c

<400> 1

ggggtgggaa tctaacccat ccctgcaagt gacaatggat taggactttg gacattcaag 60

ttggccccta gcagaataca tgtcatccaa gatcagataa gtgtccacaa gatacaaaca 120

gaatgtgtgg caattagtca ttctrtcata gtttttctct accatctcat agtagattca 180

gtcattggtt acctgtaatt cccaaaatga gtatctatta cgtgtatgcg tattgtgttc 240

cctatgaaag aacgggattc tcagaaggtg tggagaatat gatatgcatc attgattcta 300

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

cccatccctg caagtgacaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

cagctgcaga acttcgcatt 20

Claims

1.一种与仔猪死亡率相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位核苷酸，为碱基T或C。

2.根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T的仔猪死亡率。

3.一种用于检测权利要求1或2所述SNP标记的引物组，其特征在于，包括：SEQ ID NO：2和3所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测权利要求1或2所述SNP标记的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求3所述的引物组。

5.权利要求1或2所述与仔猪死亡率相关的SNP标记或权利要求3所述引物组或权利要求4所述试剂盒在预测仔猪死亡率中的应用。

6.一种预测仔猪死亡率的方法，其特征在于，包括：通过对待测母猪进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，预测所述待测母猪的仔猪死亡率。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，包括：

提取所述待测母猪的基因组DNA；

利用权利要求3所述的引物组，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行测序，并基于测序结果预测所述待测母猪的仔猪死亡率；

其中，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为C的仔猪死亡率高于所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T的仔猪死亡率。

8.一种预测仔猪死亡率的***，其特征在于，包括：

扩增单元，所述扩增单元适于利用权利要求3所述引物组或权利要求4所述试剂盒对待测母猪的基因组DNA进行扩增；

测序单元，所述测序单元与所述扩增单元相连，适于对所述扩增所得到的扩增产物进行测序，确定权利要求1或2所述SNP标记；

预测单元，所述预测单元与所述测序单元相连，适于基于所述SNP标记预测所述待测母猪的仔猪死亡率，

9.一种猪选育***，其特征在于，包括：

候选猪获取设备，所述候选猪获取设备用于提供多头候选母猪；

性状预测设备，所述性状预测设备与所述候选猪获取设备相连，所述性状预测设备为权利要求8所述预测仔猪死亡率的***，并且用于预测所述待测母猪的仔猪死亡率；和

培育设备，所述培育设备与所述性状预测设备相连，所述培育设备用于基于所述性状预测设备的预测结果，选择并培育仔猪死亡率低的候选母猪。

10.根据权利要求9所述的猪选育***，其特征在于，所述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第145位的碱基为T是仔猪死亡率低的指示。