KR101595011B1

KR101595011B1 - 돼지의 유두 수 판단용 ｓｎｐ 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101595011B1
Application number: KR1020130033784A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 한상현; 고문석; 박용상
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2016-02-18
Also published as: KR20140118236A

Abstract

본 발명은 번식돈의 산자수와 육성율을 결정하는 경제형질 중의 하나인 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 키트 및 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 유두 수 판단방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 RFLP 분석 방법은 번식형질인 돼지의 유두 수를 조기에 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 우수한 종돈을 확대 생산할 수 있는 시스템을 구축하여, 양돈 산업의 경쟁력을 높이는데 이바지할 수 있을 것이다.

Description

돼지의 유두 수 판단용 ＳＮＰ 마커 및 이의 용도{Novel SNP marker for discriminating number of nipple of Pig and use thereof}

본 발명은 돼지의 유두 수 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 번식돈의 산자수와 육성율을 결정하는 경제형질 중의 하나인 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 키트 및 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 유두 수 판단방법에 관한 것이다.

돼지고기는 전 세계적으로 가장 많이 소비되는 동물성 단백질 공급원으로서, 국내의 경우 식육별 선호도는 돼지고기 59%, 닭고기 21.6%, 쇠고기 18.5%, 기타 0.9%로 돼지고기가 전체 육류 소비량의 절반 이상을 차지하고 있는 것으로 보고되었다(농림수산식품부, 2006). 국내 소비자의 1인당 연간 돼지고기 소비량은 18.1kg인데 반해 국내 자급률은 73%에 불과하며, 미국 및 유럽연합과의 FTA 체결로 인해 돼지고기의 수입물량은 점차 확대될 것으로 판단된다. 이는 국내 양돈산업의 경쟁력 약화로 이어질 것으로 보인다. 따라서 국내 소비자의 기호에 맞는 고품질의 돼지고기를 생산하여 차별화함으로써, 수입산과의 경쟁력을 제고할 필요성이 대두되고 있다.

국내에서 사육되고 있는 거의 모든 돼지는 외래 종자를 이용하고 있다. 실제로 매년 1,000 두 이상의 종돈들이 수입됨으로 인해, 외화 유출은 물론 악성 전염병의 국내 유입이 우려되고 있는 상황이다. 따라서 국내 종돈에 대한 조속한 연구가 필요한 시점이다. 돼지 육종 연구에 있어, 우수 형질에 대한 분자표지를 이용하는 경우 표현형에 의존한 선발 방법보다 정확한 우수 종돈의 발굴이 가능하며, 기존의 방법에서 활용되던 후대 검정에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있다. 이미 축산 선진국에서는 분자표지를 적극적으로 활용하여 종돈에 대한 유전적 개량사업을 진행하고 있으며, 육질, 번식형질, 성장형질 등에서 뛰어난 능력을 갖는 새로운 종돈들이 개발되고 있다.

최근 유전체 분석 기술의 발전으로 인하여, 유전체 정보를 활용한 유전체 선발 방법이 가능하게 되었다. 유전체 선발이란 가축의 경제형질과 연관되어 있는 유전형질을 확인하고 우수한 종축의 선발에 있어서 유전체 정보를 활용하는 것을 말한다. 대표적으로 유전체 선발에 이용되는 유전체 정보는 단일염기다형성(SNP)을 이용한 분자마커를 예로 들 수 있는데, 최근 약 70만 개 이상의 SNP 정보를 집적시킨 칩이 개발되어 유전체 분석에 이용되고 있다. 한편 수많은 유전체 정보를 분석하는 방법에도 발전적인 방법들이 제시되고 있는데, 그 중에서도 특정 형질과 연관된 유전체 정보를 포괄적으로 분석하는 GWAS(Genome-Wide Association Study)는 유전체 선발에 쓰일 분자마커를 탐색하는데 유용한 도구로 활용되고 있다. 더욱이 GWAS 분석과 SNP 분자마커를 결합한 종축 선발 방법은 특정 경제형질이 지닌 복잡한 유전형질을 이해하고 이를 활용하는데 많은 장점들을 제공한다.

이러한 연구의 일환으로서, SNP 분자마커를 이용하여 우수한 형질을 지닌 돼지를 선별하는 방법들이 개발되고 있다. 그 예로서, 근내 지방 함량 및 등지방 두께 연관 SNP 마커를 제시하고 있는 대한민국 공개특허 2012-0131724, 소비자가 선호하는 부위의 함량이 높은 종돈을 조기 선별하기 위한 SNP 마커를 제시하고 있는 대한민국 공개특허 2012-0127178, PPARGC1A 유전자 내 SNP 마커를 이용하여 돼지의 육질 증가 여부를 확인할 수 있는 방법을 개시하고 있는 대한민국 공개특허 2012-0065103, 삼겹살 함량을 결정하는 염색체 6번 위치의 SNP 마커를 개시하고 있는 대한민국 공개특허 2011-0139009, 돼지의 일당증체량을 확인할 수 있는 SNP 마커 및 이의 활용 방법을 개시하고 있는 대한민국 공개특허 2012-0072882, PGK2 유전자의 SNP 마커를 이용하여 생시 및 이유시에 우량 자돈을 조기 판단할 수 있는 방법을 개시하고 있는 대한민국 공개특허 2010-0120447, 국내 재래돼지와 수입종을 식별하는 방법으로서 SNP 마커의 활용방법을 개시하고 있는 대한민국 공개특허 2011-0050261가 있다. 특히 종돈의 번식형질인 유두 수와 관련해서는 IGF2 유전자 상의 유전자형을 마커로 하는 종돈의 선별방법을 개시하고 있는 미국 공개특허 2006/0037090와 7번 염색체 상의 QTL 유전좌위와 유두 수와의 관계를 개시하고 있는 Nengshui Ding 외 다수 저술의 논문(BMC Genet. 2009; 10: 6)이 있으나, 국내 종돈 개발에 있어 유두 수와 분자 마커 또는 SNP 마커와의 관계를 밝힌 연구성과는 부족한 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지의 유두 수를 기준으로 하여 우수한 번식력을 갖는 돼지를 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 돼지의 유두 수에 관여하는 NPC2 유전자에 포함된 신규한 SNP 마커를 발굴하였으며, 상기 SNP 마커를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 유두 수를 판별하여, 우수한 번식력을 나타내는 돼지를 선별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 결정하는 단계를 포함하는 돼지의 유두 수 판단방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 단일염기다형성인 SNP(Single Nucleotide Polymorphism; 단일 염기 다형성) 마커를 제공한다.

상기 마커는 바람직하게는 NPC2 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 NPC2 유전자 exon 2의 SNP 위치인 175번째 염기에 해당하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 83번째 염기가 G 또는 T이고, 상기 SNP 위치를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커일 수 있다.

본 발명의 용어 "NPC2(Niemann-Pick disease, type C2) 유전자"란, 리소좀 내에 축적되는 단백질 생산과 관계되어 있는 유전자로서, NPC2 유전자의 돌연변이로 인해 야기되는 니에만-픽 병(Niemann-Pick disease)과도 관련이 있다. 상기 NPC2 유전자는 돼지의 7번 염색체 상에 위치한다. 상기 NPC2 유전자의 염기서열은 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 돼지의 유두 수와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "번식돈"이란, 양돈에 있어 번식에 필요한 종모돈(수퇘지)과 종빈돈(암퇘지)을 통칭하는 종돈을 의미한다. 특히 본 발명에서는 산육능력과 관련된 경제형질인 번식돈의 유두 수를 표현형으로 갖는 종빈돈 또는 모돈을 의미한다. 한편 번식돈의 우수성을 판단하는 표현 형질에는 초분만일령, 종부횟수, 총산자, 생존산자, 생시복체중, 이유복체중, 유두 수 등이 있다.

본 발명의 "경제형질"이란, 돼지의 육종에 있어 자돈의 번식에 유리한 모돈의 표현형질을 의미하는데, 상기 표현형질은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 초분만일령, 종부횟수, 총산자, 생존산자, 생시복체중, 이유복체중, 유두 수 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 경제형질은 본 발명의 SNP 마커의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP 마커의 유전자형이 T/T인 경우 G/G를 갖는 개체에 비해 더 많은 유두 수(전체 유두 수, 좌측 유두 수 및 우측 유두 수)를 갖는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 제주재래흑돼지와 랜드레이스 돼지의 교배 참조축군을 대상으로 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지의 유두 수에 대한 QTL 분석을 수행한 결과, 돼지의 유두 수에 관여하는 유전자가 7번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 1). 또한, 통계적 분석방법을 활용하여 유두 수 형질 조절 유전자 좌위에 대한 유전자 분석을 시행한 결과 NPC2를 포함하는 유전자군이 7번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 2). 아울러, NPC2 유전자에 대한 서열 분석을 시행하여 신규 돌연변이 c.175G>T(p.Val59Phe)가 NPC2 유전자의 엑손 2 상에 존재함을 확인할 수 있었다(도 3). 상기 신규 돌연 변이는 T/T 유전자형, T/G 유전자형, G/G 유전자형이 존재하며, T copy의 수가 증가할 수록 돼지의 유두 수가 유의적으로 증가함을 알 수 있었다(표 1).

따라서, 본 발명의 SNP 마커의 유전자형을 증폭하고 PCR-RFLP 방법으로 상기 SNP 마커의 유전자형을 판독하면, 돼지의 유두 수를 판단할 수 있을 것으로 기대된다. 상기 SNP 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 SNP 마커를 증폭 및 판독할 수 있는 제제를 포함하는 번식돈의 유두 수 판단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커를 증폭 또는 판독할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 변이 부위, 즉 SNP 마커를 증폭 및 PCR-RFLP 방법을 통해 판독하여 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 PCR-RFLP 방법에 이용되는 제한효소를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 내에 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적합한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30bp의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해 상대적으로 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 서열과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 SNP 마커를 포함하는 NPC2 유전자의 서열을 증폭시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 프라이머의 서열 및 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 번식돈의 유두 수 판단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 PCR-RFLP 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 돼지의 유두 수 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독함으로써 돼지의 유두 수를 판단할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 제공하는 돼지의 유두 수 판단용 키트는 PCR-RFLP을 수행하기 위해 필요한 필수 요소 및 RFLP 판독을 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 PCR-RFLP 키트일 수 있다. PCR-RFLP 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DNA 제한효소, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 폴리뉴클레오티드를 제한효소로 처리하고 판독하는 단계를 포함하는 돼지의 유두 수 판단방법을 제공한다. 이때, 이때, 상기 SNP 마커로는 NPC2 유전자 exon 2의 SNP 위치인 175번째 염기에 해당하는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 83번째 염기가 될 수 있고, 상기 83 번째 염기의 대립유전자가 T인 경우 돼지의 유두 수가 상대적으로 많은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 유두 수를 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 시료를 이용하여, 상기 SNP 마커를 분석함으로써 상기 돼지의 유두 수를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커를 판독하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 RFLP 분석 방법은 번식형질인 돼지의 유두 수를 조기에 판단할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 우수한 종돈을 확대 생산할 수 있는 시스템을 구축하여, 양돈 산업의 경쟁력을 높이는데 이바지할 수 있을 것이다.

도 1은 대용량 SNP chip을 이용한 돼지 유두 수 관련 QTL 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 7번 염색체의 유두 수 관련 QTL 영역에서 발견된 유전자군 나타내는 그래프이다.
도 3은 NPC2 엑손 2의 c.175G>T 신규 돌연변이를 나타내는 서열분석 결과이다.
도 4는 돼지 NPC2 exon 2 c.175G>T에 대한 HincII-RFLP 유전자형을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돼지 유두 수 관련 GWAS ( genome - wide association study )분석 결과

제주재래흑돼지와 랜드레이스 돼지의 교배 참조축군을 대상으로 대용량 SNP chip을 (Porcine 60K Beadchip, Illumina) 이용하여 돼지의 번식형질인 유두 수에 대한 대한 QTL 분석을 수행하였다(도 1). 도 1은 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지 유두 수에 대한 QTL 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 도 1에서 보듯이, 돼지의 유두 수에 관여하는 유전자는 7번 염색체 상에 존재함을 확인할 수 있었다.

한편, 통계적 분석방법을(IBD mapping) 활용하여 QTL의 물리적 거리를 100Kbp 단위로 압축하고, 유두 수 형질 조절 유전자 좌위에 대한 유전자 분석을 시행했다. 도 2는 돼지 유두 수 형질 조절에 관여하는 유전자 분석결과이다. 상기 도 2에서 보듯이, NPC2를 포함하는 유전자군이 7번 염색체 상의 돼지 유두 수 관련 QTL에 존재함을 확인할 수 있었다. 염색체 7번 상에 위치한 QTL 인근 영역의 후보유전자군들에 대한 cDNA와 genomic DNA의 물리적 염기서열을 결정하고, 여기서 발견된 SNP들을 평가한 결과 NPC2 유전자의 엑손 2 c.175G>T(p.Val59Phe) 변이가 돼지 집단의 유두수와 가장 높은 연관을 나타내었다.

도 3은 7번 염색체 상의 돼지 유두 수 관련 QTL의 NPC2 유전자에 대한 서열 분석 결과를 나타낸다. 상기 도 3에서 보듯이, 신규 돌연변이 c.175G>T(p.Val59Phe)가 NPC2 유전자의 엑손 2 상에 존재함을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 NPC2 유전자의 신규 돌연변이 c.175G>T를 확인함으로써 돼지의 돼지의 유두 수 형질을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 유전자형 분석

실시예 2-1: NPC2 유전자의 엑손 2 영역에 대한 PCR 증폭

PCR-RFLP를 이용한 유전자형 분석을 수행하여 상기 NPC2 유전자의 돌연변이 형질을 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다:

pNPC2e2_F primer: 5'-AGTGGCTTGTTTTCCTTCCCATT-3'(서열번호 2)

pNPC2e2_R primer: 5'-ATTCCCTGCCCTCATGTTCCCA-3'(서열번호 3)

상기 프라이머를 사용하고 돼지로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR을 수행하여 증폭된 NPC2 유전자의 엑손 2 영역의 유전자 시료를 수득하였다(PCR 증폭조건: 96℃→30s, 60℃→30s, 72℃→30s 30cycles).

실시예 2-2: PCR - RFLP 를 이용한 NPC2 유전자형 판독 방법

상기 증폭된 NPC2 유전자 시료를 대상으로 PCR-RFLP를 이용한 유전자형 분석을 수행하였다(도 4). 도 4는 돼지 NPC2 exon 2 c.175G>T에 대한 HincII-RFLP 유전자형을 나타낸 결과이다. NPC2 유전자의 엑손 2 영역의 유전자 시료가 c.175G 대립인자를 갖는 경우에는 HincII 제한효소에 대한 절단 부위가 없는 반면, c.175T 대립인자를 갖는 경우에는 HincII 제한효소에 대한 하나의 절단 부위를 갖게 되어 두 개의 밴드를 나타내게 된다. 상기 NPC2 유전자의 엑손 2 영역의 PCR 증폭 산물은 250bp의 전체길이를 갖으며, HincII 제한효소에 의해 절단된 PCR 산물은 각각 83bp 및 167bp의 길이를 갖는다.

따라서, NPC2 유전자의 엑손 2 영역에 c.175G 대립인자 및 c.175G 대립인자가 존재하며, 각 유전자형을 PCR-RFLP 방법을 통해 판독할 수 있었다.

실시예 2-3: NPC2 유전자형과 돼지 유두 수 의 연관성 분석

제주재래흑돼지와 렌드레이스 돼지를 교배하여 얻어진 2세대 자손을 대상으로 PCR-RFLP를 이용한 유전자형 분석을 수행하고, 각 유전자형을 갖는 돼지의 유두 수를 비교하였다(표 1).

참조축군 2세대에서의 NPC2 c.175G>T 유전자형에 따른 유두 수

형질	TT(SE)	TG(SE)	GG(SE)	P-values
teat_total¹	13.898(0.086)	13.502(0.060)	12.983(0.089)	2.603E^-12
teat_L²	6.980(0.052)	6.751(0.036)	6.456(0.054)	5.357E^-11
teat-L³	6.918(0.0251)	6.752(0.036)	6.526(0.053)	7.917E^-07

1은 각각 전체 유두 수를 나타냄.

2는 좌측 유두 수를 나타냄.

3은 우측 유두 수를 나타냄.

표 1은 NPC2 유전자의 c.175G>T 돌연변이의 유전자형에 따른 유두 수의 차이를 GLM을 통해 분석한 결과이다. 표 1에서 보듯이, 서로 다른 NPC2 유전자의 c.175G>T 돌연변이의 유전자형을 갖고 있는 개체들에서 유전자형과 돼지의 유두 수 사이에는 고도의 유의적 연관성이 있는 것을 알 수 있다. NPC2 c.175TT 유전자형을 갖는 돼지의 유두 수는 GG 유전자형을 갖는 개체에 비해 평균적으로 전체 유두 수(teat_total)는 0.915 개, 왼쪽 유두 수(teat_L)는 0.524 개, 오른쪽 유두 수(teat_R)는 0.392 개가 더 많은 것으로 확인되었다.

따라서, NPC2 c.175G>T 에서 T 형질을 갖는 SNP를 포함하는 개체가 G 형질을 갖는 SNP를 갖는 개체보다 보다 많은 유두수를 갖음을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel SNP marker for discriminating number of nipple of Pig and use thereof <130> PA130065/KR <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 250 <212> DNA <213> NPC2 c.175G <400> 1 agtggcttgt tttccttccc attcctttac atttttcttc ttttgcaggc tcgggggttg 60 gagtgataaa ggaagtgaat gtkaacccat gtcccaccca gccctgccag ctgcacaaag 120 gacagtctta cagtgtgaat gtcaccttca ccagtagtga gtatacgtgg ttcttacctt 180 caaattcacc tgaaagcata gcatcagtct caagtattgc aatgagcatg ggaacatgag 240 ggcagggaat 250 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pNPC2e2_F <400> 2 agtggcttgt tttccttccc att 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pNPC2e2_R <400> 3 attccctgcc ctcatgttcc ca 22

Claims

서열번호 1로 표시되는 NPC2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 83번째 염기가 G 또는 T이며, 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커.
제1항의 돼지의 유두 수를 판단할 수 있는 SNP 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 번식돈의 유두 수 판단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 2 및 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드로 표시되는 프라이머인 것인 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는 돼지의 유두 수 판단용 키트.
제4항에 있어서,
상기 키트는 PCR-RFLP 키트인 것인 돼지의 유두 수 판단용 키트.
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 SNP 마커가 포함된 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 폴리뉴클레오티드를 제한효소로 처리하고 판독하는 단계를 포함하는 돼지의 유두 수 판단방법.
제6항에 있어서,
서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 83 번째 염기의 대립유전자가 T인 돼지의 유두 수가 상기 대립유전자가 G인 돼지의 유두 수보다도, 상대적으로 많은 것으로 판단하는 것인 방법.