CN111269943B - 一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；设计actRIIB基因和alk4基因敲除靶位点；体外转录获得Cas9mRNA；Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代；根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体。本发明发现，共敲除斑马鱼actRIIB和alk4会导致斑马鱼快速生长。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
提高鱼类生长率，即可以缩短上市时间，提高单位时间内的养殖产量，又可以一定程度上降低鱼类发病率，从而降低养殖风险。鱼类生长速度快慢直接关系到其养殖推广和养殖效益，因此如何增加鱼类生长速度，一直是鱼类相关研究的重点和热点。目前快长转基因鱼研制技术多为基因的过表达技术，且所选用的靶基因均为生长激素基因，例如朱作言院士团队研制的转基因黄河鲤以及目前在美国批准上市的转基因三文鱼。但是在有些鱼类中，过表达生长激素基因，对鱼类生长并没有明显的促进作用，如在已驯化的虹鳟鱼中过表达鲑鱼生长激素基因，并未导致其生长速度加快，因此该方法应用范围有一定的局限性，而且过表达基因产生的转基因鱼，可能具有一定的环境危害，推广养殖难度很大。利用基因编辑技术CRISPR/Cas9沉默基因表达获得快长鱼类品系是近几年研究的热点，该技术同样需要靶基因的寻找和筛选，目前研究最多的靶基因为生长抑制素基因，但是在一些鱼类中敲除该基因，并不能得到快长的鱼类品系，应用范围仍具有一定的局限性。发现共敲除actRIIB和alk4基因，可以获得生长速度显著加快的斑马鱼，该技术有望推广到经济鱼类，一定程度上增加鱼类养殖经济效益。
肌肉生长抑制素(myostatin，mstn)又称生长分化因子8(growth anddifferentiation factor-8,gdf-8)，在多种生物肌肉生长中起负向调节作用。例如在牛、小鼠、狗和人中，该基因功能的全部或部分丧失均会导致肌肉量的显著增加。根据序列的分析比较及同源性分析，抑肌素被归为转化生长因子超级家族(Transforming growthfactor superfamily,TGF)的一员,作为一种细胞因子信号蛋白，其特异的传递信号的主要受体是激活素II型B受体(Activin type IIB receiptor,actRIIB)，再与特异性较弱的另一共同受体activin-like kinase 4(alk4)结合，通过它们将信号传导至胞内的信号途径。
抑肌素对肌肉生长的负调控作用是通过激活素受体来实现其正常的信号传导的，在骨胳肌特异性表达显著抑制型的激活素受体actRIIB的转基因小鼠中，表达失去了其信号传导的蛋白质基团的显著抑制型的激活素受体大量地与抑肌素在体内结合，阻止了激活素受体传导抑肌素信号的通路，使这类转基因小鼠也表现出肌肉组织的异常增生。可见，目前针对actRIIB和alk4的研究多集中在小鼠等模式生物中，且均为基础理论研究，目前还未有应用。在鱼类中，actRIIB和alk4的研究甚少，尚处于起步阶段，目前研究发现共敲除actRIIB和alk4基因，可以获得快长的斑马鱼品系，并有望推广至经济鱼类，促进渔业发展。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前在鱼类中对actRIIB和alk4的研究尚处于起步阶段。
解决上述技术问题的难度：
1利用CRIPR/Cas9技术同时敲除两个基因的效率比较低，需要筛选大量F1代个体。
2需要传代3次，才能获得纯合的个体，且F2中纯合个体占比仅为6.25％，筛选工作量较大。
解决上述技术问题的意义：
提高鱼类生长率，即可以缩短上市时间，提高单位时间内的养殖产量，又可以一定程度上降低鱼类发病率，从而降低养殖风险。鱼类生长速度快慢直接关系到其养殖推广和养殖效益。我们研究发现共敲除actRIIB和alk4基因，可以获得快长的斑马鱼品系，这在一定程度上增加了研制快长鱼类品系靶基因的选择范围。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法。
本发明是这样实现的，一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：
第一步，通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；
第二步，获得actRIIB基因和alk4基因gRNA；
第三步，体外转录获得Cas9mRNA；
第四步，Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；
第五步，F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；
第六步，F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代；根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体。
进一步，所述第一步通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列包括；
actRIIB基因mRNA序列:NM_131210.3；
actRIIB基因基因组序列:NC_007135.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：1；
alk4基因mRNA序列：NM_130990.1；
alk4基因基因组序列：NC_007134.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：2。
进一步，所述第二步actRIIB基因和alk4基因gRNA的获得：以gRNA-plasmid为模，分别以actRIIB-gRNA-F/gRNA-R和alk4-gRNA-F/gRNA-R为引物：
利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA；然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用
T7TranscriptionKit将构建好的质粒体外逆转录20ul反应体系。
进一步，所述逆转录20ul反应体系为：
10x ReactionBuffer 2ul；
Plasmid DNA4ul，1ug；
T7Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul。
进一步，所述第三步体外转录获得Cas9mRNA：Cas9质粒来自AddgeneTM，使用
T7/T3TranscriptionKit，合成Cas9mRNA，体系及反应条件：
10x ReactionBuffer 2ul；
Plasmid DNA4ul，1ug；
T7Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul。
进一步，所述第四步Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9mRNA300ng/ul；
actRIIBgRNA 30ng/ul；
alk4gRNA 30ng/ul；
Phenol-red 0.2ul；
DEPC Waterup to 2ul；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测actRIIB和alk4基因的突变效率。
进一步，所述第五步F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定包括：
(1)经过显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，分别以F-actRIIB/R-actRIIBB为引物检测actRIIB基因的突变效率；
(2)以F-alk4/R-alk4为引物检测alk4基因的突变效率；
(3)利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增，PCR产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得actRIIB基因和alk4基因均突变的F1代个体。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：目前通过基因编辑技术获得快长鱼类，操作的基因均为单一基因，而我们发现多基因共敲除能获得更好的快长性状，所以本发明首先提供了一种策略。其次，目前可用于研制快长鱼类的靶基因很少，本发明增加了靶基因的数量。最后，本发明发现，共敲除斑马鱼actRIIB和alk4会导致斑马鱼快速生长，并有望推广至经济鱼类。
附图说明
图1是本发明实施例提供的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的actRIIB基因和alk4基因突变类型筛选示意图。
图3是本发明实施例提供的共敲除actRIIB和alk4基因斑马鱼杂合体和纯合体生长速度显著加快示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：
S101：通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；
S102：获得actRIIB基因和alk4基因gRNA；
S103：体外转录获得Cas9mRNA；
S104：Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；
S105：F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；
S106：F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代，根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术共敲除斑马鱼actRIIB基因和alk4基因，具体步骤如下：
(1)通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；
actRIIB基因mRNA序列：NM_131210.3；
actRIIB基因基因组序列：NC_007135.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：1：
GTTCGCTTCTCTGCTCACTTTGG；(TGG为PAM序列)
alk4基因mRNA序列：NM_130990.1；
alk4基因基因组序列：NC_007134.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：2：
GCTACAGCAGTTCGTCGAGGAGG；(AGG为PAM序列)。
(2)actRIIB基因和alk4基因gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，分别以actRIIB-gRNA-F/gRNA-R和alk4-gRNA-F/gRNA-R为引物：
SEQ ID NO：3actRIIB-gRNA-F：
GTTCGCTTCTCTGCTCACTTTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；
SEQ ID NO：4alk4-gRNA-F：
GCTACAGCAGTTCGTCGAGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；
SEQ ID NO：5gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT；
利用KOD Plus(TAKARA)高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用
T7Transcription Kit(InvitrogenTM)将构建好的质粒体外逆转录20ul反应体系如下：
10x ReactionBuffer 2ul；
Plasmid DNA4ul(约1ug)；
T7Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
(3)体外转录获得Cas9mRNA：Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154)，使用
T7/T3Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9mRNA，体系及反应条件同(2)；
(4)Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9mRNA300ng/ul；
actRIIBgRNA 30ng/ul；
alk4gRNA 30ng/ul；
Phenol-red 0.2ul；
DEPC Waterup to 2ul；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测actRIIB和alk4基因的突变效率；
(5)F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过(4)显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，分别以F-actRIIB/R-actRIIBB为引物检测actRIIB基因的突变效率；
SEQ ID NO：6F-actRIIB：5’-GTGTGAGTGTGTGATCGGTT-3’；
SEQ ID NO：6R-actRIIB：5’-TCTGACGCGTTCAAAACGAG-3’；
以F-alk4/R-alk4为引物检测alk4基因的突变效率；
SEQ ID NO：8F-alk4：5’-GGTTGGTCGGTTTGTGGTTG-3’；
SEQ ID NO：9R-alk4；5’-CGCCGACCGCTAGTAATCCA-3’；
利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增，PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得actRIIB基因和alk4基因均突变的F1代个体；
(6)F2代纯合突变个体的获得：待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代，根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体；
结果：图2actRIIB基因和alk4基因突变类型筛选
通过对F1代个体进行检测，筛选到一个F1代个体，其中actRIIB和alk4基因均发生突变，且均为移码突变(虚线框标注部分)。
下面结合附图对本发明的技术效果作详细的描述。
图3共敲除actRIIB和alk4基因斑马鱼杂合体和纯合体生长速度显著加快，dpf：Days post-fertilization(受精后天数)；actRIIB+/-/alk4+/-：actRIIB和alk4基因共突变杂合体；actRIIB-/-/alk4-/-：actRIIB和alk4基因共突变纯合体；
对受精后20、40、60、80、100天的对照鱼、杂合体和纯合体进行了体重记录，发现杂合体和纯合体相对对照鱼均有显著增加，纯合个体生长速度相对杂合体显著增加以上数据说明，共敲除actRIIB和alk4基因可以获得生长速度增加的鱼类个体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南文理学院
<120> 一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcgcttct ctgctcactt tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctacagcag ttcgtcgagg agg 23
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcgcttct ctgctcactt tggaaacggt cgacagatgc cgttttagag ctagaaataa 60
g 61
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctacagcag ttcgtcgagg tggaaacggt cgacagatgc cgttttagag ctagaaataa 60
g 61
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcaccgact cggtgccact 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgtgagtgt gtgatcggtt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctgacgcgt tcaaaacgag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggttggtcgg tttgtggttg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgccgaccgc tagtaatcca 20
Claims (6)
1.一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：
第一步，通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；
第二步，获得actRIIB基因和alk4基因gRNA；
第三步，体外转录获得Cas9 mRNA；
第四步，Cas9 mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；
第五步，F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；
第六步，F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代；根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体；
所述第一步通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列包括；
actRIIB基因mRNA序列:NM_131210.3；
actRIIB基因基因组序列:NC_007135.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上，靶位点序列为SEQ ID NO：1；
alk4基因mRNA序列:NM_130990.1；
alk4基因基因组序列:NC_007134.7
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上，靶位点序列为SEQ ID NO：2。
2.如权利要求1所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第二步actRIIB基因和alk4基因gRNA的获得：以gRNA-plasmid为模板，分别以actRIIB-gRNA-F/gRNA-R和alk4-gRNA-F/gRNA-R为引物：
利用KOD Plus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA；然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用
T7TranscriptionKit将构建好的质粒体外逆转录20ul反应体系；
actRIIB-gRNA-F的序列为SEQ ID NO：3；
alk4-gRNA-F的序列为SEQ ID NO：4；
gRNA-R的序列为SEQ ID NO：5。
3.如权利要求2所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述逆转录20ul反应体系为：
10x ReactionBuffer 2ul；
Plasmid DNA4ul，1ug；
T7 Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul。
4.如权利要求2所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第三步体外转录获得Cas9 mRNA：Cas9质粒来自AddgeneTM，使用
T7/T3TranscriptionKit，合成Cas9 mRNA，体系及反应条件：
10x ReactionBuffer 2ul；
Plasmid DNA4ul，1ug；
T7 Enzyme 2ul；
10mmol/L NTP 1ul；
DEPC water 11ul。
5.如权利要求2所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第四步Cas9 mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA300 ng/ul；
actRIIBgRNA 30ng/ul；
alk4 gRNA 30ng/ul；
Phenol-red 0.2ul；
DEPC Waterup to 2ul；
将Cas9 mRNA、actRIIBgRNA、alk4 gRNA、Phenol-red、DEPC Waterup配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测actRIIB和alk4基因的突变效率。
6.如权利要求2所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第五步F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定包括：
(1)经过显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，分别以F-actRIIB/R-actRIIBB为引物检测actRIIB基因的突变效率；
(2)以F-alk4/R-alk4为引物检测alk4基因的突变效率；
(3)利用KOD PLUS高保真酶进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得actRIIB基因和alk4基因均突变的F1代个体；
F-actRIIB/R-actRIIBB序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
F-alk4/R-alk4序列分别为SEQ ID NO：8与SEQ ID NO：9。
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