CN112662669A - 一种Il21基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Il21基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用，构建方法包括以下步骤：S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定Il21基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点sgRNA1和sgRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL21基因敲除小鼠模型。本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，首次通过敲除Il21基因的ENSMUST00000029273.7转录本中exon3‑exon5区域建立了小鼠动物模型，能够在肿瘤愈后相关研究中的应用。

Description

一种Il21基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用

技术领域

本发明涉及基因敲除小鼠模型构建技术领域，具体涉及一种Il21基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用。

背景技术

IL-21即白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)是一种分泌蛋白，由活化的CD4+T细胞分泌，分子结构与IL-15相似，属于IL-15/IL-21家族，它与一个复合受体结合，该复合受体由一个私有受体(IL21R)和常见的细胞因子受体链(gamma(C))组成。IL-21影响多种细胞类型包括CD8+记忆T细胞、NK细胞和CD4记忆T细胞亚群。其受体广泛分布在淋巴造血细胞上。IL-21通过增强免疫细胞的抗原特异性反应，促进CD8+t细胞和NK细胞的抗肿瘤活性，通过与特定的I型细胞因子受体IL-21R结合而发挥作用。已有研究表明，IL-21缺失会导致CD8+T细胞功能障碍。

现有关于IL-21在肿瘤愈后中的作用研究主要使用肿瘤组织中注射外源IL-21的方法，该方法受限于注射剂的载体类型、外源IL-21的来源、及相关副作用等因素，而使用基因敲除小鼠进行研究可以有效的避免相关不利因素，减少成本。

基因敲除动物模型可以通过基因打靶技术构建和CRISPR/Cas9技术构建。基因打靶技术即建立在ES细胞与DNA同源重组等技术基础上的分子生物学技术。利用同源重组技术对ES细胞特定位点的基因进行改造，通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得修饰的遗传信息经生殖系遗传，获得ES细胞来源的小鼠。因此可以在ES细胞上进行基因编辑，获得基因修饰小鼠。

ES细胞打靶技术从同源重组载体的构建、到ES细胞的打靶及阳性克隆筛选、再到ES细胞的囊胚注射获得嵌合小鼠，这个过程大约需要4-6个月时间。而CRISPR/Cas9技术抛开了这部分工作，直接移植注射后的小鼠受精卵获得F0代，大约只需要1个月左右，极大地节省了研发周期和费用。另一方面，通过ES细胞打靶技术获得的基因修饰小鼠，其遗传背景来自于我们选择的ES细胞，而成熟的、可用于基因打靶的ES细胞系通常只有有限的几种品系来源：C57BL/6N、C57BL/6J、129S3以及C57与129的杂交F1系。如果需要其它背景，则需要通过与目的品系野生型小鼠回交的方式获得，回交代数在10代以上。而CRISPR/Cas9技术打破了小鼠品系的限制，可以实现在不同品系、甚至免疫缺陷品系上的遗传修饰，比如：BALB/c、FVB、Nod、Nod-scid等。

目前，还没有采用CRISPR/Cas9技术构建IL-21基因敲除小鼠模型成功的案例。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，采用本发明所述构建发明不仅能够成功构建Il21基因敲除小鼠模型，且具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。。

此外，本发明还提供采用上述构建方法构建的Il21基因敲除小鼠模型以及该Il21基因敲除小鼠模型的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定Il21基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点sgRNA1和sgRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；

S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；

S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL21基因敲除小鼠模型。

Il21基因敲除小鼠模型的构建难点在于异性靶位点gRNA1和gRNA2的设计以及F0代小鼠的基因确定。

本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，成功构建了Il21基因敲除小鼠模型，能够在肿瘤愈后相关研究中的应用；本发明所述构建方法具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。

进一步地，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。

进一步地，F0代小鼠的基因型确定过程如下：

提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

Il21基因敲除小鼠模型的构建另一个难点或关键点在于F0代小鼠和F1代杂合子的基因确定。

本发明通过合理设计PCR扩增序列和测序序列，能够成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高Il21基因敲除小鼠模型的构建的成功率。

进一步地，获得的F1代杂合子包括5种类型，分别为敲除类型1、敲除类型2、敲除类型3、敲除类型4、敲除类型5，其中，敲除类型1缺失6281个碱基对，敲除类型2缺失6282个碱基对，敲除类型3缺失6272个碱基对，敲除类型4缺失6283个碱基对，敲除类型5缺失6279个碱基对，将敲除类型1的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。

进一步地，F1代杂合子的类型确定过程如下：

提取F1代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，骤S1中确定的敲除区域为Il21-201(ENSMUST00000029273.7)转录本的exon3-exon5。

采用上述构建方法构建的Il21基因敲除小鼠模型。

一种敲除Il21基因的细胞。

一种Il21基因敲除小鼠模型，包括敲除Il21基因的细胞。

Il21基因敲除小鼠模型在肿瘤愈后相关研究中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，首次通过敲除Il21基因的ENSMUST00000029273.7转录本中exon3-exon5区域建立了小鼠动物模型，能够在肿瘤愈后相关研究中的应用。

2、本发明通过合理设计PCR扩增序列和测序序列，能够成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高Il21基因敲除小鼠模型的构建的成功率。

3、本发明所述构建方法具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例1中特异性靶位点的构建策略示意图；

图2为实施例1中F0小鼠鉴定结果图；

图3为实施例1中F1小鼠鉴定结果图；

图4为F1小鼠鉴定中8#的测序峰图；

图5为F2代小鼠鉴定结果图；

图6为鉴定策略示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

S1、RISPR/Cas9技术，根据Il21基因信息将Il21-201(ENSMUST00000029273.7)转录本的exon3-exon5作为敲除区域，该区域包含258bp编码序列；根据此区域确定C57BL/6J小鼠IL10基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示或如表1所示；

表1 gRNA序列信息

sgRNA name	gRNA sequence(5’*3’)	PAM
			sgRNA1	TGCCTATGTATGTGTCGTCC	TGG
sgRNA2	TGGAGTGCCCACCTATCTGA	TGG

S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠，提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示或如表2所示，F0小鼠鉴定结果如图2所示：

表2引物信息

PCR扩增反应体系如表3所示：

表3反应体系

Seg.	reaction component	Volume(μl)
			1	2×Taq Master Mix，Dye Plus，(Vazyme P112-03)	12.5
2	ddH2O	9.5
			3	Primer A(10pmol/μl)	1
4	Primer B(10pmol/μl)	1
			5	Template(≈100ng/μl)	1

PCR扩增反应程序如表4所示：

表4反应程序

S3、将步骤S2获得的性成熟的阳性F0 19#代小鼠与野生型小鼠交配繁殖一代，野生型C57BL/6J小鼠的基因序列如SEQ ID NO.8所示，其中，gRNAs的基因序列如SEQ ID NO.9所示，敲除编码区所在区域的基因序列如SEQ ID NO.10所示，出生的F1代小鼠在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR鉴定，确认基因型；获得的F1代杂合子小鼠有5种类型，分别为：敲除类型1，缺失6281个碱基对；敲除类型2，缺失6282个碱基对；敲除类型3，缺失6272个碱基对；敲除类型4，缺失6283个碱基对；敲除类型5，缺失6279个碱基对；鉴定方法同F0代小鼠鉴定，F1代基因型鉴定结果如图3所示；

根据PCR策略示意图，如图1，经PCR和测序确认，

1#，8#：-6281bp，E3---E5完全删除，KO阳性

2#：-6282bp，E3---E5完全删除，KO阳性

5#：-6272bp，E3---E5完全删除，KO阳性

9#：-6283bp，E3---E5完全删除，KO阳性

10#：-6279bp，E3---E5完全删除，KO阳性；

根据PCR策略示意图，经PCR和测序确认，

8#的测序峰图如图4所示：测序双峰，推荐繁育；

S4、将步骤S3获得的缺失6281个碱基对的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本实施例构建的Il21基因敲除小鼠的模型。

鉴定结果如图5所示：33#及39#为纯合(ko/ko)小鼠。

图6为鉴定策略示意图：

Wild type：①PCR reaction obtains a single WT band；②PCR reactionobtains a single WT band(野生型：①PCR反应得到一条WT的条带②PCR反应得到一条WT的条带)。

Heterozygote：①PCR reaction obtains a WT band and a KO band；②PCRreaction obtains a WT band(杂合子：①PCR反应得到一条WT和一条KO条带；②PCR反应得到一条WT条带)。

Homozygote:①PCR reaction obtains a single KO band；②PCR reactionwithout product(纯合子：①PCR反应得到一条KO条带；②PCR反应无条带)。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 成都药康生物科技有限公司

<120> 一种Il21基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 1(人工序列1)

<400> 1

tgcctatgta tgtgtcgtcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2(人工序列2)

<400> 2

tggagtgccc acctatctga 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 3(人工序列3)

<400> 3

gctgctactg ctcacaattt acagcc 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 4(人工序列4)

<400> 4

agatcctagt ggcctcgtct tagca 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 5(人工序列5)

<400> 5

gccaacttat gtgcaattca gggac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 6(人工序列6)

<400> 6

aaggtctcac ccagataacc cagct 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 7(人工序列7)

<400> 7

gctgctactg ctcacaattt acagcc 26

<210> 8

<211> 6480

<212> DNA

<213> 8(人工序列8)

<400> 8

gttcctaaac taaattctct gtcacagata gaaatgctgg gtctgctagc tcagtggtag 60

actgtttgcc tatgtatgtg tcgtcctgga ttctcttcaa tacctcccac acacttctac 120

agacacctgc aggcacgcac acacacacac acaaatgtac acatatataa acctgcacac 180

acataactca catacacatc aggttcacac acaaacacac atacaaacac acaaacaagc 240

acatacacac attcacattc aactccacaa ggcttgtacc cactgcttca acctcagagt 300

gacttcagca tagcaccagg caaagaaaat tatgaaaggt gagggctctg cttgtacctg 360

tgcggtagga aatggctcct ttttctccca gacagggaag ctgtccaaat ggaaaaaacc 420

ctgtcttttg ctgagtttaa gtggggatat gaccagacct aatggagccc ctaaaaaaat 480

tctcaacaca aatgtacaag cagaaactga gggctggaat gtcattttca acctttggaa 540

caatgttcat taacatatgc taattatctt taaggtcatt aacatatgct aattgtctct 600

cctttcaggg gcactgtgag catgcagctt ttgcctgttt tcagaaggcc aaactcaagc 660

catcaaaccc tggaaacaat aagacattca tcattgacct cgtggcccag ctcaggagga 720

ggctgcctgc caggagggga ggaaagaaac agaagcacat agctgtaaga ttgtcctctg 780

tcatctttct tgttcgcagt tatcactagc atggagcatt tagttattaa gataagtctt 840

acccgttagt tgtaacatac tatgcttcac acatccacac agctggagcg tctcccacct 900

tcttgcagag ttactccata caaggtctac tttgaaaagt ggtgtcacct ccaataagtc 960

tttactgtct gtctagaaac cctactagaa ctggccacca ctccctcggc agtatgttaa 1020

cagaagtttc tgggggtgaa gaagccatta ggaagagaat gtgttagacg ttacaagata 1080

ttttcccttt tgcccatgtg ctggccatag cttgtgtcat ctttatcggg gactagagct 1140

cagctttctg acaagaaaag agagcttaca ataccaagat caatctatta ctgtcccagg 1200

caaaagcaga gtcaatgatg aatttaaaag ggtgtacctt tttatggggc tgaaaaagtc 1260

caagttcctg tttctttggg accctgaatt ttcttgtata ttttctttgg ccaacttatg 1320

tgcaattcag ggactcaaga atcaactcat tcaaacatta atcagaacct gcagagagga 1380

cagaaaagaa gtttctctgt catattcatt ggttgtctgt ccttcaagaa atgccacatg 1440

gacaaaaatg aaatcataat tacattatga aaaggagtct tgtttcttct gattgcttgg 1500

ccaggttatt atgtgaaaat gtccctctga aactttcttc acaatgaaaa gaactgccta 1560

ggaaggtagt gtgtccctgt gaggtcagca ccaggaagct gaggcaggag gattgagact 1620

tccaggacag ctgggttatc tgggtgagac cttgttcagg aagctttgaa gaaggaagta 1680

ggggaggagg cagggaggga gagaaggaaa ggaaggaaag gaaggaaagg aaggaaagga 1740

aggaaaggaa ggaaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaacaaagga aggaaggaga 1800

aatggagggg gtggtggtga caaattgacc acagctatga aactcagaaa aacttacgaa 1860

atggtgctgt gtactgtaga cctggaaccc aactcttcta caccaagctc ctttgtgtag 1920

acatgaagaa agtgagaact gtaaagaggc caactttctc caggtttcac aaacagctgt 1980

gtcaggatga agaagaacat agatgccatg ctgcctccag atgttctcac cgtgatacca 2040

tgtgactgag cattaaaaag cagccagttg ttttggtatt ggaacaggaa tgagcataag 2100

actggaggag aaagggggga gggagactga tgaagaggga ggaaggtcag ccacattcga 2160

acatttggaa catttgctca gtacccctaa taatcaagtg aatggaagtt aaaagaggaa 2220

atcctgtctt gtaattgtgg aaacagtgcc caatagtggt aagactcgtc gaagcacaaa 2280

gaggaaacat gttttatgat atatagtcct tgaggtattt atccctttaa tctacttgat 2340

aagatctaga aatttgatat atatgaaaaa attatctgcc caggtgatct ctatagactt 2400

gtacataaaa gctagatacc acttctgtat ctaaaaatag taagtgctcc atctgtgcag 2460

ggtgggggtg ggtgggaggg ggagcgacag agcagccacc acaaatcctg ccctgaaagc 2520

atatctaaag cccaggaaac ccttgtaatt ggttaaaaac taacagcaaa cagcatataa 2580

caaccagggt aacaagaatg cagaggagga ggagggcgag gaagaggaag aggaagaaag 2640

gggacaaaaa acggatataa taatttaaac accaaaatat tcagagttgt ctctgaggat 2700

aaaatcacac gtggtttcca gaacaatttt acagaatttt cctaatgctt gttactgaat 2760

atgatttatg ttcacaagag aagaaatgaa ttttacataa gtattttatg aagtatgaag 2820

ttagttctta aaaaataatt tttaaagttt taaaattaat taattaatta attgattaat 2880

tttgatttac agaaatgccc ttcctgtgat tcgtatgaga aaaggacacc caaagaattc 2940

ctagaaagac taaaatggct ccttcaaaag gtatgcacct taaatgcatt tctttcactt 3000

ccatgttgtg tccgggtacc tcctgtgccc agtgactcat aggctctcgt tcccacagat 3060

gattcatcag catctctcct agaacacata ggacccgaag attcctgagg atccgagaag 3120

attcccgagg actgaggaga cgccggacac tatagacgct cacgaatgca ggagtacatc 3180

ttgcctcttg ggattgcaag tggagaagta cgatacgtta tgataagaac aactcagaaa 3240

agctataggt taagatcctt tcgcccatta actaagcaga cattgtggtt ccctgcacag 3300

actccatgct gtcaacatgg aaaatctcaa ctcaacaaga gcccagcttc ccgtgtcagg 3360

gatttctggt gcttctcaag ctgtggcttc atcttattgc ccaactgtga cattctttga 3420

ttggaagggg aaaactaaag cttttagcaa aaatacagct agggaatttg tcgatctgcg 3480

agagtaagac ctcttatgat cctaacggaa tgatgtaagc tggaaataat aagcataaga 3540

tgaaattgaa aattgaagtc tttattcttt aagaaaaact ttgtacttga aagcatgtct 3600

gaagagttta ctcattacca caaacatcta gcatattgat aactaacatc tttatactct 3660

acaagagagg ctttccagat aggtacagtt tttcttctct attaggtcta tcaaaattta 3720

acctattatg agggtcaccc ctggctttca ctgtttttct aaagaggcaa gggtgtagta 3780

agaagcaggc ttaagttgcc ttcctcccaa tgtcaagttc ctttataagc taatagttta 3840

atcttgtgaa gatggcaatg aaagcctgtg gaagtgcaaa cctcactatc ttctggagcc 3900

aagtagaatt ttcaagtttg tagctctcac ctcaagtggt tatgggtgtc ctgtgatgaa 3960

tctgctagct ccagcctcag tctcctctcc cacatccttt cctttctttc ctctttgaaa 4020

cttctaagaa aaagcaatcc aaacaagttc agcacttaag acacattgca tgcacacttt 4080

tgataagtta aatccaacca tctatttaaa atcaaaatca ggagatgagc caagagacca 4140

gaggttctgt tccagtttta aacagacttt tactgaacat cccaatcttt taaccacaga 4200

ggctaaattg agcaaatagt tttgccattt gatataattt ccaacagtat gtttcaatgt 4260

caagttaaaa agtctacaaa gctattttcc ctggagtggt atcatcgctt tgagaatttc 4320

ttatggttaa aatggatctg agatccaagc atggcctggg ggatggtttt gatctaagga 4380

aaaaggtgtc tgtacctcac agtgccttta aaacaagcag agatcccgtg taccgcccta 4440

agatagcaca gactagtgtt aactgattcc cagaaaagtg tcacaatcag aaccaacgca 4500

ttctcttaaa ctttaaaaat atgtattgca aagaacttgt gtaactgtaa atgtgtgact 4560

gttgatgaca ttatacacac atagcccacg taagtgtcca atggtgctag cattggttgc 4620

tgagtttgct gctcgaaagc tgaagcagag atgcagtcct tcacaaagca atgatggaca 4680

gagaggggag tctccatgtt ttattctttt gttgtttctg gctgtgtaac tgttgacttc 4740

ttgacattgt gatttttata tttaagacaa tgtatttatt ttggtgtgtt tattgttcta 4800

gccttttaaa tcactgacaa tttctaatca agaagtacaa ataattcaat gcagcacagg 4860

ctaagagctt gtatcgtttg gaaaagccag tgaaggcttc tccactagcc atgggaaagc 4920

tacgctttag agtaaactag acaaaattgc acagcagtct tgaacctctc tgtgctcaag 4980

actcagccag tcctttgaca ttattgttca ctgtgggtgg gaacacattg gacctgacac 5040

actgttgtgt gtccatgaag gttgccactg gtgtaagctt tttttggttt tcattctctt 5100

atctgtagaa caagaatgtg gggctttcct aagtctattc tgtattttat tctgaacttc 5160

gtatgtctga gttttaatgt tttgagtact cttacaggaa cacctgacca cacttttgag 5220

ttaaatttta tcccaagtgt gatatttagt tgttcaaaaa gggaagggat atacatacat 5280

acatacatac atacatacat atatatatat atatatacat atatatatat atatatatgt 5340

atatatatat atatatagag agagagagag agagagagag agaaagagag agaggttgtt 5400

gtaggtcata ggagttcaga ggaaatcagt tatggccgtt aatactgtag ctgaaagtgt 5460

tttctttgtg aataaattca tagcattatt gatctatgtt attgctctgt tttatttaca 5520

gtcacacctg agaatttagt tttaatatga atgatgtact ttataactta atgattattt 5580

attatgtatt tggttttgaa tgtttgtgtt catggcttct tatttaagac ctgatcatat 5640

taaatgctac ccagtcagaa caactgtctg ttgtgattct ctgaatgtcc ttaatgcaac 5700

caacctggta gaaaaggtgg gtgcataggt tttatatggc tacagcacag atgtttactt 5760

cttattgact gccactaaga tagaagtatc ccgtgttctt gctcaaagac cccactctct 5820

ttgcagacca ccctctgaat gcctggcagg cttgaagtgg ttgaaacttg cttgtctcac 5880

aagtgtgtcc catgtagact gcagttctgg gttcatgtcg ctctcatctg gccatctgtc 5940

tcttattctc aatgtttctt gtctgcgtct gtgggttacc aggctgtgct catcaaggac 6000

ttaggtatgt tccttgccaa tctctgctcc cctctcaggt gacctcagtg gggaggattc 6060

tcagtgggaa actcccagaa ccttgaccat ctccatgtga gcacttgtgt actttaccca 6120

ctgccactct catggtcaca gcccagactc tcacgcatgg aaacctgtca cctagctaga 6180

ccatcatatt cctactgcct ctgtaccaga agccgggcct ccacacttcc agacccctcg 6240

gcactcacct gctctggagg cctggccact gagtccctgg agcccggagc cacagtcaag 6300

caacacatag tgcctccacc tgctcgggaa cctgtctgtg gagtgcccac ctatctgatg 6360

gtctacttca tattcgaaca ttggttctgg ctgctcacct tggggagcat tttaaacacc 6420

ctccatagct actggagtca tttccctcct ctgacttcac cccatgggct gctaagacga 6480

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 9(人工序列9)

<400> 9

tgcctatgta tgtgtcgtcc tggagtgccc acctatctga 40

<210> 10

<211> 2758

<212> DNA

<213> 10(人工序列10)

<400> 10

gggcactgtg agcatgcagc ttttgcctgt tttcagaagg ccaaactcaa gccatcaaac 60

cctggaaaca ataagacatt catcattgac ctcgtggccc agctcaggag gaggctgcct 120

gccaggaggg gaggaaagaa acagaagcac atagctatga ttcatcagca tctctcctag 180

aacacatagg acccgaagat tcctgaggat ccgagaagat tcccgaggac tgaggagacg 240

ccggacacta tagacgctca cgaatgcagg agtacatctt gcctcttggg attgcaagtg 300

gagaagtacg atacgttatg ataagaacaa ctcagaaaag ctataggtta agatcctttc 360

gcccattaac taagcagaca ttgtggttcc ctgcacagac tccatgctgt caacatggaa 420

aatctcaact caacaagagc ccagcttccc gtgtcaggga tttctggtgc ttctcaagct 480

gtggcttcat cttattgccc aactgtgaca ttctttgatt ggaaggggaa aactaaagct 540

tttagcaaaa atacagctag ggaatttgtc gatctgcgag agtaagacct cttatgatcc 600

taacggaatg atgtaagctg gaaataataa gcataagatg aaattgaaaa ttgaagtctt 660

tattctttaa gaaaaacttt gtacttgaaa gcatgtctga agagtttact cattaccaca 720

aacatctagc atattgataa ctaacatctt tatactctac aagagaggct ttccagatag 780

gtacagtttt tcttctctat taggtctatc aaaatttaac ctattatgag ggtcacccct 840

ggctttcact gtttttctaa agaggcaagg gtgtagtaag aagcaggctt aagttgcctt 900

cctcccaatg tcaagttcct ttataagcta atagtttaat cttgtgaaga tggcaatgaa 960

agcctgtgga agtgcaaacc tcactatctt ctggagccaa gtagaatttt caagtttgta 1020

gctctcacct caagtggtta tgggtgtcct gtgatgaatc tgctagctcc agcctcagtc 1080

tcctctccca catcctttcc tttctttcct ctttgaaact tctaagaaaa agcaatccaa 1140

acaagttcag cacttaagac acattgcatg cacacttttg ataagttaaa tccaaccatc 1200

tatttaaaat caaaatcagg agatgagcca agagaccaga ggttctgttc cagttttaaa 1260

cagactttta ctgaacatcc caatctttta accacagagg ctaaattgag caaatagttt 1320

tgccatttga tataatttcc aacagtatgt ttcaatgtca agttaaaaag tctacaaagc 1380

tattttccct ggagtggtat catcgctttg agaatttctt atggttaaaa tggatctgag 1440

atccaagcat ggcctggggg atggttttga tctaaggaaa aaggtgtctg tacctcacag 1500

tgcctttaaa acaagcagag atcccgtgta ccgccctaag atagcacaga ctagtgttaa 1560

ctgattccca gaaaagtgtc acaatcagaa ccaacgcatt ctcttaaact ttaaaaatat 1620

gtattgcaaa gaacttgtgt aactgtaaat gtgtgactgt tgatgacatt atacacacat 1680

agcccacgta agtgtccaat ggtgctagca ttggttgctg agtttgctgc tcgaaagctg 1740

aagcagagat gcagtccttc acaaagcaat gatggacaga gaggggagtc tccatgtttt 1800

attcttttgt tgtttctggc tgtgtaactg ttgacttctt gacattgtga tttttatatt 1860

taagacaatg tatttatttt ggtgtgttta ttgttctagc cttttaaatc actgacaatt 1920

tctaatcaag aagtacaaat aattcaatgc agcacaggct aagagcttgt atcgtttgga 1980

aaagccagtg aaggcttctc cactagccat gggaaagcta cgctttagag taaactagac 2040

aaaattgcac agcagtcttg aacctctctg tgctcaagac tcagccagtc ctttgacatt 2100

attgttcact gtgggtggga acacattgga cctgacacac tgttgtgtgt ccatgaaggt 2160

tgccactggt gtaagctttt tttggttttc attctcttat ctgtagaaca agaatgtggg 2220

gctttcctaa gtctattctg tattttattc tgaacttcgt atgtctgagt tttaatgttt 2280

tgagtactct tacaggaaca cctgaccaca cttttgagtt aaattttatc ccaagtgtga 2340

tatttagttg ttcaaaaagg gaagggatat acatacatac atacatacat acatacatat 2400

atatatatat atatacatat atatatatat atatatgtat atatatatat atatagagag 2460

agagagagag agagagagag aaagagagag aggttgttgt aggtcatagg agttcagagg 2520

aaatcagtta tggccgttaa tactgtagct gaaagtgttt tctttgtgaa taaattcata 2580

gcattattga tctatgttat tgctctgttt tatttacagt cacacctgag aatttagttt 2640

taatatgaat gatgtacttt ataacttaat gattatttat tatgtatttg gttttgaatg 2700

tttgtgttca tggcttctta tttaagacct gatcatatta aatgctaccc agtcagaa 2758

Claims (10)

1.一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定Il21基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点sgRNA1和sgRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；

S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；

S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL21基因敲除小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。

3.根据权利要求2所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F0代小鼠的基因型确定过程如下：

提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求2所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，获得的F1代杂合子包括5种类型，分别为敲除类型1、敲除类型2、敲除类型3、敲除类型4、敲除类型5，其中，敲除类型1缺失6281个碱基对，敲除类型2缺失6282个碱基对，敲除类型3缺失6272个碱基对，敲除类型4缺失6283个碱基对，敲除类型5缺失6279个碱基对，将敲除类型1的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。

5.根据权利要求2所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F1代杂合子的类型确定过程如下：

提取F1代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，骤S1中确定的敲除区域为Il21-201(ENSMUST00000029273.7)转录本的exon3-exon5。

7.如权利要求1-6任一项所述的一种Il21基因敲除小鼠模型的构建方法构建的Il21基因敲除小鼠模型。

8.一种敲除Il21基因的细胞。

9.一种Il21基因敲除小鼠模型，其特征在于，包括敲除Il21基因的细胞。

10.如权利要求8或9所述Il21基因敲除小鼠模型在肿瘤愈后相关研究中的应用。

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