CN109402169A - 一种spo11基因的敲除方法 - Google Patents
一种spo11基因的敲除方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109402169A CN109402169A CN201811297183.2A CN201811297183A CN109402169A CN 109402169 A CN109402169 A CN 109402169A CN 201811297183 A CN201811297183 A CN 201811297183A CN 109402169 A CN109402169 A CN 109402169A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- spo11
- grna
- plasmid dna
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101100366466 Caenorhabditis elegans spo-11 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 9
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种spo11基因的敲除方法，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除。通过本发明的方法，通过敲除spo11基因，继而可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系。
Description
技术领域
本发明涉及一种spo11基因的敲除方法，属于分子生物学领域。
背景技术
spo11是Ⅱ型拓扑异构酶的同源蛋白，参与DNA双链断裂复合物（DSBs）的形成，在减数***同源重组的发生中发挥重要功能。在大多数有性生殖的生物的减数***中，重组扮演着至关重要的角色，它是遗传多样性的重要来源，能够产生单倍体的配子，同时姐妹染色单体交叉互换也增加了配子的多样性。发明人在多年的实验中，发现敲除一个减数***相关基因spo11，导致斑马鱼雄性特异性不育，雌性几乎不受影响，而目前还没有人报道基因spo11具有这种功能。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种spo11基因的敲除方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：spo11基因的敲除方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，具体操作如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQ ID NO：1：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；
（3）gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的序列为SEQ ID NO：2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的序列为SEQID NO：3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型；
（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：
待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体；
（8）雄性不育雄性个体的选取：
spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。
与现有技术相比，本发明的有益效果：通过本发明的方法，可以特异性获得雄性不育个体，可以通过建立敲除家系，源源不断提供雄性不育个体，操作简单，节省时间。
附图说明
图1为本发明涉及到的相关靶位点、突变类型及靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化，其中A为CRISPR/Cas9技术作用靶位点；B为靶位点序列突变检测（红色虚线所框为建立家系所选突变类型）；C为靶位点突变基因序列所对应的氨基酸变化（红色虚线所框为建立家系所选氨基酸突变型）；
图2为雌鱼性腺组织显微镜放大图，其中A为对照性成熟雌鱼性腺组织中***，B为spo11性成熟雌鱼性腺组织中***；
图3为雄鱼性腺组织显微镜放大图，其中A为对照性成熟雄鱼性腺组织（存在***），B为spo11性成熟雄鱼性腺组织（无***）。
具体实施方式
现结合具体实施例来说明本发明的技术方案和技术效果，但并不是限制本发明保护范围的依据。
实施例一
鱼类雄性不育模型的建立方法，是利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，spo11的序列号为no:ENSDART00000005373.9；具体步骤如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为：TGGAAACGGTCGACAGATGCC[AGG]，中括号内为PAM序列。
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性（SNP）：
随机选取6条斑马鱼分别提取尾鳍组织的基因组DNA，以此为PCR模板，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后发现所选靶位点中无SNP位点。
（3）gRNA的获得：以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用。
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3。
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率。方法如下：随机选取8个胚胎提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取20个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后获得突变效率。
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型。
（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：
待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体。选择附图1B中标出的突变类型，该突变类型在突变位点附近产生了终止密码，即突变个体中只能产生spo11突变位点之前序列对应的氨基酸。
（8）雄性不育雄性个体的选取：
spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，如附图2，spo11 F2代纯合突变雄性个体***中无***，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。
序列1
＜110＞湖南文理学院
＜120＞一种spo11基因的敲除方法
＜160＞3
＜210＞ 1
＜211＞24
＜212＞DNA
＜213＞人工合成
＜400＞1
TGGAAACGGT CGACAGATGC CAGG 24
序列2
＜110＞湖南文理学院
＜120＞一种spo11基因的敲除方法
＜160＞3
＜210＞ 2
＜211＞61
＜212＞RNA
＜213＞人工合成
＜400＞2
TAATACGACT CACTATAGGG TGGAAACGGT CGACAGATGC CGTTTTAGAG CTAGAAATAA 60
G 61
序列3
＜110＞湖南文理学院
＜120＞一种spo11基因的敲除方法
＜160＞3
＜210＞ 3
＜211＞20
＜212＞RNA
＜213＞人工合成
＜400＞3
AGCACCGACT CGGTGCCACT 20
Claims (1)
1.一种spo11基因的敲除方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数***相关基因spo11进行敲除，具体操作如下：
（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；
（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；
（3）gRNA的获得：
以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KODPlus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit (InvitrogenTM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：
10x Reaction Buffer 2ｕl；
Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；
T7 Enzyme 2ｕl；
10mmol/L NTP 1ｕl；
DEPC water 11ｕl；
以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；
（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：
Cas9质粒来自AddgeneTM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(InvitrogenTM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；
（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：
Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；
gRNA 30ng/ｕl；
Phenol-red 0.2ｕl；
DEPC Water up to 2ｕl；
将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；
（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：
经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811297183.2A CN109402169A (zh) | 2018-11-01 | 2018-11-01 | 一种spo11基因的敲除方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811297183.2A CN109402169A (zh) | 2018-11-01 | 2018-11-01 | 一种spo11基因的敲除方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109402169A true CN109402169A (zh) | 2019-03-01 |
Family
ID=65471234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811297183.2A Pending CN109402169A (zh) | 2018-11-01 | 2018-11-01 | 一种spo11基因的敲除方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109402169A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111793654A (zh) * | 2019-04-08 | 2020-10-20 | 中国农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用 |
| CN112226456A (zh) * | 2019-06-28 | 2021-01-15 | 中国水稻研究所 | 一种实现染色体定点遗传重组的方法 |
| CN118127040A (zh) * | 2024-05-06 | 2024-06-04 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 从蒺藜苜蓿中分离的spo11-1基因及其编码蛋白和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007037538A1 (ja) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Link Genomics, Inc. | Ｓｐｏ１１遺伝子の治療的又は診断的用途 |
| EP2554045A1 (en) * | 2011-08-04 | 2013-02-06 | Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. | Method for systemically influencing processes in the male meiocyte |
| CN105647969A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 |
-
2018
- 2018-11-01 CN CN201811297183.2A patent/CN109402169A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007037538A1 (ja) * | 2005-09-30 | 2007-04-05 | Link Genomics, Inc. | Ｓｐｏ１１遺伝子の治療的又は診断的用途 |
| EP2554045A1 (en) * | 2011-08-04 | 2013-02-06 | Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. | Method for systemically influencing processes in the male meiocyte |
| CN105647969A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NATALYA A SMIRNOVA: "Gene expression profiles of Spo11−/− mouse testes with spermatocytes arrested in meiotic prophase I" * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111793654A (zh) * | 2019-04-08 | 2020-10-20 | 中国农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用 |
| CN111793654B (zh) * | 2019-04-08 | 2022-05-24 | 中国农业大学 | 一种提高CRISPR/Cas9介导的双等位基因突变效率的方法及其应用 |
| CN112226456A (zh) * | 2019-06-28 | 2021-01-15 | 中国水稻研究所 | 一种实现染色体定点遗传重组的方法 |
| CN112226456B (zh) * | 2019-06-28 | 2022-08-05 | 中国水稻研究所 | 一种实现染色体定点遗传重组的方法 |
| CN118127040A (zh) * | 2024-05-06 | 2024-06-04 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 从蒺藜苜蓿中分离的spo11-1基因及其编码蛋白和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107435051B (zh) | 一种通过CRISPR/Cas9***快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法 | |
| CN107475300B (zh) | Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 | |
| CN107760715B (zh) | 一种转基因载体及其构建方法和应用 | |
| CN105647969B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| Hisanaga et al. | Deep evolutionary origin of gamete-directed zygote activation by KNOX/BELL transcription factors in green plants | |
| CN109402169A (zh) | 一种spo11基因的敲除方法 | |
| CN108192912B (zh) | 一种诱导产生玉米母本单倍体的方法 | |
| CN106701803B (zh) | 玉米母本单倍体主效诱导基因及应用 | |
| CN109402170A (zh) | 一种鱼类雄性不育模型的建立方法 | |
| CN109266687A (zh) | 一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN107880099B (zh) | 水稻种子休眠性调控基因OsMPK7及其应用 | |
| CN109280666A (zh) | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| US11178832B2 (en) | Mutation of the ZMCIPK15 gene to increase root angle and to enhance abiotic stress tolerance in maize | |
| CN108866102B (zh) | 一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法 | |
| CN116769796B (zh) | ZmENR1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用 | |
| Plewiński et al. | Innovative transcriptome‐based genotyping highlights environmentally responsive genes for phenology, growth and yield in a non‐model grain legume | |
| CN111269943B (zh) | 一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法 | |
| CN115807037A (zh) | 一种遗传可控的四倍体鱼的选育方法及三倍体鱼的制备方法 | |
| AU2020104114A4 (en) | Application of Gene Zm00001d040827 in Increasing Maize Yield | |
| CN112457385B (zh) | 一种控制水稻生育期基因ljp1的应用 | |
| CN108794610A (zh) | 玉米杂交不亲和相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用 | |
| CN104805100B (zh) | 水稻基因OsSμBP‑2在延缓植物叶片衰老中的应用 | |
| CN107058545B (zh) | 玉米胚性愈伤组织诱导相关基因grmzm2g020814的snp分子标记及其应用 | |
| CN116042640B (zh) | 水稻nac转录因子基因在种子活力改良中的应用 | |
| CN104450739B (zh) | 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190301 |