CN113678789A - Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pUC57kan‑T7重组质粒的构建法，包括以下步骤：根据小鼠miR‑379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA；引物退火形成的双链克隆入pUC57kan‑T7载体，得到pUC57kan‑T7重组质粒。本发明还同时公开了利用CRISPR技术构建miR‑379/410基因簇条件性敲除模型的方法：将pUC57kan‑T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；基于PMD‑18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；基于PMD‑18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；构建miR‑379/410CKO。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及应用CRISPR/Cas9技术建立Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法。
背景技术
小鼠12号染色体上存在着Dlk1/Dio3印记区域，该印记区域跨度为830kb，包括3个编码蛋白的父系表达基因(Dlk1，Rtl1和Dio3)以及若干母系表达的非编码RNA(包括Dio3、Rian、Mirg、anti-Rtl1、Irm、Meg8)。Mirg主要分为两个主要区域，分别是源自Rtl1转录本的miR-127/miR-136簇和miR-379/410簇。其中，miR-379/410簇是胎盘哺乳动物中已知最大的miRNA簇，并且在脊椎动物中保守，然而miR-379/410簇的功能尚不明确，值得进一步研究。构建基因敲除动物模型是研究Dlk1-Dio3印记区域生物学功能过程中急需解决的问题。
目前有关miR-379/410簇的功能报道的比较少，仅有2篇文献，都是基于MiR-379/miR-410簇全身敲除的小鼠。其中一篇研究显示：MiR-379/miR-410簇敲除的小鼠大脑兴奋性突触传递增加以及海马中离子型谷氨酸受体复合物过度表达，小鼠的社交行为被过度激活。另有1篇文章研究，miR-379/410簇基因敲除的部分新生儿小鼠由于肝脏内大量代谢基因的表达失调引起了脂质代谢和葡萄糖代谢的异常，从而在出生后不久就死亡了，提示miR-379/410簇的全身敲除有一定的致死性风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用CRISPR/Cas9技术建立Mir-379/410基因簇条件性敲除小鼠模型及其构建方法。
为实现上述目的，本发明提供一种pUC57kan-T7重组质粒的构建法，包括以下步骤：
①、根据小鼠miR-379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA，5’端设计的gRNA为gRNA1和gRNA2；3’端设计的gRNA为gRNA3和gRNA4：
gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG
gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG
gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG
gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG
②、引物退火(gRNA1和gRNA2退火，gRNA3和gRNA4退火)形成的双链克隆入pUC57kan-T7载体，得到pUC57kan-T7重组质粒。
本发明还同时提供了一种利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，包括以下步骤：
1)、将pUC57kan-T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；
2)、基于PMD-18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；
3)、基于PMD-18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；
4)、构建miR-379/410 CKO。
在本发明中，pUC57kan-T7重组质粒是将外源的gRNA的DNA序列克隆至T7启动子之后，利用重组pUC57kan-T7质粒中的T7启动子把gRNA转录出。
作为本发明方法的改进，所述步骤4)为：利用Cas9蛋白、体外转录获得的sgRNA、5’同源臂Donor、3’同源臂Donor，构建miR-379/410 CKO。
作为本发明方法的进一步改进，所述步骤2)为：
针对miR-379上游(即Chr12：109706144)，设计5’arm同源臂引物和3’arm同源臂引物，以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR的方法，从小鼠基因组中扩增出带有lox P的5’arm片段和带有lox P的3’arm片段；然后通过SILAC的方法将5’Donor的5’arm片段、3’arm片段和线性化的pMD-18T片段连接，获得5’donor重组质粒。
说明：步骤3)构建包含3’端同源臂的donor重组质粒，该步骤针对的是miR-410的下游，即chr12109746203，其余参照上述步骤2)。
作为本发明方法的进一步改进：
受体鼠出生的F0代小仔，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型；
当采用引物①进行PCR：当PCR产物为322bp时，为WT小鼠；当PCR产物有414bp和322bp两条带时，此为miR-379/410 CKO杂合子小鼠；当PCR产物是单一的414bp时，此为miR-379/410 CKO纯合子小鼠；
当采用引物②进行PCR：当PCR扩增不出任何条带时，为WT小鼠；当PCR产物是323bp时，此为miR-379/410 CKO杂合子小鼠或者miR-379/410 CKO纯合子小鼠。
本发明的miR-379/410基因簇条件性敲除的小鼠，在所述小鼠的全基因组中，第12号染色体上miR-379/410基因簇的miR-379上游(chr12:109706144)***loxp序列，miR-410下游(chr12:109746203)***loxp序列。
loxp序列如SEQ ID NO:1所示。
小鼠基因组的miR-379/410基因簇的两端加入loxp后的序列如SEQ ID NO:2；即，Mir379-Mir410Cas9-CKO Targeted Genomic Sequence。
本发明通过去组织特异性表达Cre的工具鼠杂交，获得了miR-379/410基因簇条件性敲除模型。在小鼠基因组的miR-379/410基因簇的两端加入loxp，有利于研究miR-379/410基因簇的功能，有利于研究miR-379/410基因簇的生物学功能和调控网络，可作为miR-379/410基因簇靶标药物负筛选的小鼠模型。
因此，为了阐明miR-379/410簇的生物学作用以及miR-379/410簇中大量协同表达的基因如何影响基因调控网络，本发明构建了miR-379/410条件性敲除小鼠，该miR-379/410条件性敲除小鼠与其他工具小鼠配种繁殖，可获得在某些组织中特异性敲除miR-379/410基因簇的小鼠后代，为进一步研究某些组织中miR-379/410基因簇的功能提供更可靠的小鼠模型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次建立了Mir-379/410簇条件性敲除的小鼠模型，该模型的建立对于研究该基因簇在各组织中的功能，无疑有重要的意义。MiR-379/410簇的异常表达与疾病和胚胎发育的关系早已备受关注，然而MiR-379/410簇的全身敲除会导致胚胎致死，为了避免基因敲除后胚胎致死的难题，本发明针对MiR-379/410簇建立条件性敲除小鼠的动物模型。本发明中的Mir-379/410簇条件性敲除的小鼠模型可与多种组织特异性表达的Cre小鼠杂交，构建组织特异性敲除Mir-379/410簇的小鼠模型。期望该模型的建立能够对研究MiR-379/410簇生物学功能有重要意义。
本发明利用CRISPR技术对小鼠的基因组进行改造，得到的miR-379/410条件性敲除小鼠与其他工具小鼠配种繁殖，可获得在某些组织中特异性敲除miR-379/410基因簇的小鼠后代，为进一步研究某些组织中miR-379/410基因簇的功能提供更可靠的小鼠模型。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为miR-379/410簇的示意图。
图2为miR-379/410簇条件性基因敲除小鼠设计策略示意图。
图3为pUC57kan-T7质粒。
图4为5’Donor质粒构建的示意图。
图5为3’Donor质粒构建的示意图。
图6为5’端LoxP***位点；
即，5’Loxp***峰值图；框中是loxp序列：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。
图7为3’端LoxP***位点；
即，3’Loxp***峰值图：框中是loxp序列：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。
图8为鉴定策略示意图；
野生型：①PCR反应可以获得单一的WT条带；
杂合子：①PCR反应可以获得Target和WT条带；②PCR反应可以单一的Target条带；
纯合子：①PCR反应可以获得单一的Target条带；②PCR反应未获得单一的Target条带。
图9为F0代小鼠基因型鉴定结果。
图10为SEQ ID NO:2的局部示意图；
背景色代表的基因型鉴定时5’arm的PCR产物和3’arm的PCR产物。
带有下划线标注的，代表是Loxp位点。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用的方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例1、一种利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，包括以下步骤：
1)、根据小鼠miR-379/410基因簇两端的序列，分别针对基因簇的两端设计gRNA，针对其5’端设计的sgRNA为gRNA1和gRNA2；针对其3’端设计的sgRNA为gRNA3和gRNA4。引物序列如下：
gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG
gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG
gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG
gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG
2)、合成上述步骤1)所述的sgRNA的上下游引物，引物退火(gRNA1和gRNA2退火，gRNA3和gRNA4退火)形成的双链克隆入pUC57kan-T7载体(如图3所示)，得到pUC57kan-T7重组质粒。
具体如下：
SgRNA上下游引物的退火反应体系：
| Forward primer(100uM) | 1ul |
| Reverse primer(100uM) | 1ul |
| PNK buffer | 1ul |
| T4 PNK | 1ul |
| H<sub>2</sub>O | Up to 10ul |
| Total | 10ul |
退火程序：37℃30min，95℃，5min，以-2℃/s的速度降温至85℃，然后以-0.1℃/s的速度降温至25℃，4℃保存。
构建方法如下：把sgRNA序列***在pUC57kan-T7载体(事先用Bsa I酶切)进行连接(T4 DNA ligase，NEB)，得到pUC57kan-T7重组质粒。
3)、质粒扩增，并以其重组质粒为模板，进行体外转录：
将步骤2)所得的pUC57kan-T7重组质粒按照体外转录试剂盒(HiScribe T7 QuickHigh Yield RNA Synthesis Kit)说明书进行体外转录；最终获得sgRNA。获得的sgRNA为步骤6)显微注射用。
4)、基于PMD-18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒：
针对miR-379上游，即Chr12：109706144，设计5’arm同源臂引物(步骤4.1)和3’arm同源臂引物(步骤4.2)，以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR的方法，从小鼠基因组中扩增出带有lox P的5’arm片段(图4)和带有lox P的3’arm片段(图5)；然后通过SILAC的方法将5’Donor的5’arm片段，3’arm片段和线性化的pMD-18T片段连接，最终获得5’donor重组质粒。
具体如下：
4.1)、根据小鼠miR-379/410基因簇miR-379上游位点Chr12：109706144，设计引物以扩增该位点5’端同源臂(5’Donor的5’端同源臂)，以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其上下游引物分别是：
双下划线：与PMD-18T载体同源区域；虚线下划线：5’arm基因组同源序列；斜体字：部分loxp序列+外源特异鉴定引物；斜体字下划线：loxp同源区域。
4.2)、根据小鼠miR-379/410基因簇miR-379上游位点Chr12：109706144，设计引物以扩增该位点的3’端同源臂，以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其上下游引物分别是：
双下划线：与PMD-18T载体同源区域；斜体字：部分loxp序列+外源特异鉴定引物；虚线下划线：3’arm基因组同源序列；斜体字下划线：loxp同源区域。
4.3)、PCR条件:
4.4)5’donor质粒构建：
将PMD-18T工具载体使用SalI和BamH1进行线性化，将5’Donor的5’同源臂PCR产物、5’Donor的3’同源臂PCR产物与Not I+Spe I酶切过后的PMD-18T载体进行SLIC连接(SLIC连接酶为：NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，
连接体系如下：
| 5’同源片段 | 1pmol |
| 3’同源片段 | 1pmol |
| PMD-18T载体 | 0.5pmol |
| SLIC连接酶 | 10uL |
| 去离子水 | 补充到20uL |
将上述连接体系置于50℃孵育15min。孵育后，将样品保存在冰上进行后续转化。
5’Donor质粒构建的示意图如图4所示；最终获得5’donor重组质粒。
4.5)用2ul冷藏组装后的产品(即上述步骤4所得的5’donor重组质粒)转化感受态大肠杆菌，涂氨苄抗性板，载体进行测序验证。测序结果中包含5’arm序列，loxP序列和3’arm序列的载体作为5’同源臂Donor，确认为5’donor重组质粒，进行下述步骤6)；
5)、基于PMD-18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒。
与上述步骤4)的区别在于：该步骤针对的是miR-410的下游，即chr12109746203，其余参照步骤4)。
具体如下：
5.1)、根据小鼠miR-379/410基因簇3’端位点，设计引物以扩增3’Donor的5’端同源臂，以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其上下游引物分别是：
双下划线：与PMD-18T载体同源区域；虚线下划线：5’arm基因组同源序列；斜体字：部分loxp序列+外源特异鉴定引物；斜体字下划线：loxp同源区域；
5.2)、根据小鼠miR-379/410基因簇3’端位点，设计引物以扩增3’Donor的3’端同源臂，以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其上下游引物分别是
双下划线：与PMD-18T载体同源区域；虚线下划线：3’arm基因组同源序列；斜体字：部分loxp序列+外源特异鉴定引物；斜体字下划线：loxp同源区域。
5.3)PCR条件：同上述步骤4.3)。
5.4)3’donor质粒构建：
将PMD-18T工具载体使用SalI和BamH1进行线性化，将步骤5.1)所得的5’同源臂PCR产物、步骤5.2)所得的3’同源臂PCR产物与酶切过后的PMD-18T载体进行SLIC连接(SLIC连接酶为：NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)，连接体系参照上述4.4)；最终获得3’donor重组质粒。
3’Donor质粒构建的示意图如图5。
5.5)、将5.4)所得的3’donor重组质粒转化感受态大肠杆菌，涂氨苄抗性板；载体进行测序验证。测序结果中包含5’arm序列，loxP序列和3’arm序列的载体作为3’同源臂Donor进行下述步骤6)；
6)、注射样品制备
将Cas9蛋白、体外转录获得的gRNA(gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4)和5’同源臂Donor、3’同源臂Donor样品显微注射到C57BL/6JGpt背景的小鼠受精卵(取自江苏南京集萃药康生物股份有限公司)中，Cas9蛋白/sgRNA/Donor浓度(6uM/200ng/uL/200ng/uL),总体积为40uL；从而对应的获得以下实验组别：miR-379/410 CKO。
取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔。
7)、受体鼠出生的F0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型。
鉴定策略示意图，如图8所示。
具体如下：
针对5’arm loxP的两端设计的引物①进行PCR，由于miR-379/410 CKO小鼠在该区域加入了loxp序列，因此其PCR产物(414bp)比WT小鼠的PCR产物(322bp)长92bp。当PCR产物为322bp时，此为WT小鼠；当PCR产物有414bp和322bp两条带时，此为miR-379/410 CKO杂合子小鼠；当PCR产物是单一的414bp时，这是miR-379/410 CKO纯合子小鼠。
在3’arm loxp两侧***外源特异性引物，便于后期基因型鉴定，针对3’arm区loxp两端设计引物②，其中上游引物是外源性特异性引物，因此WT小鼠DNA用引物②是扩增不出条带的，而miR-379/410 CKO小鼠是有单一条带的。当PCR扩增不出任何条带时，此为WT小鼠；当PCR产物是323bp一条带的时候，此为miR-379/410 CKO杂合子小鼠或者miR-379/410CKO纯合子小鼠。
PCR鉴定用的PCR引物信息
PCR条件为
F0小鼠鉴定结果
根据PCR策略示意图，经PCR和测序确认，鉴定结果如图9。
图9中，数字为鼠尾号，WT为C57BL/6JGpt野生型，N为negative空白对照，M为DNAMarker。根据该结果，可获得以下总结性结论：Mir379-Mir410基因条件性敲除小鼠F0代构建成功。
8)、阳性F0代小鼠性成熟后，与野生型背景小鼠进行交配；出生的F1代小鼠在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型。所得结果为：阳性F1代小鼠。根据该结果，可获得以下总结性结论：Mir379-Mir410基因条件性敲除小鼠F1代构建成功。
因此，本发明构建的模型与组织特异性的Cre小鼠杂交，可以获得在特定的组织中敲除miR-379/410簇的小鼠，从而以miR-379/410簇为研究对象，研究其生物学功能和分子机制的性能优势。
序列表
<110> 嘉兴学院
嘉兴市中医医院
<120> Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 41940
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgggggctg ggggctggtc actcttctca gtgtaaaggg agtcaattgc tcaagccttt 60
gggaaaacct ctgtgtttca gtattttatc aactgcacaa gcgaactgag cccattgctg 120
tgtatggcaa gccaaggtgt cctcagaaga gagtggcatc tggctgtcaa ctgctgtcta 180
aattgcctag tgtttgagat gcatgctgtg tgggctgcct cagaattgaa tgcaggaaaa 240
ttgaggcctt tccttttttt tctgggccat ctcttagctt tgcagttttt aaagtttatt 300
tataatctgt cttaaattga caacatatag tttagatttg agacttttga cccaaattga 360
aaaatccttt ctctttgagg gtgtatagcc catttacatt ttttctttga gtgtcatgtt 420
tgaggttgtg tttttttgtt tttgtttttt tgtttttttg tttttttaaa ttctgcttcc 480
ttccctttgt ctgctatctt ttgttatacc gccgaaacca catttttagt ttcttttgct 540
ctgctgattt ggaaagcatt cagccaactt ccagagtcta tgtgggctta tagttcgaca 600
tcttcaaaac catacttccc cctagtttta aaaatgtagt cagtctgact ggttcccatg 660
tggaatgatg atccagtgct atcctcccgc ccatcgtgtc tctccatgat ggggtcctat 720
ggggctttgc ttttccactt gcctttcttc acccctgtga ctgcttttgg ggagatgtga 780
atgaatggtt ctctgccttc tgaggcttgg ccctattcat cgcattgtct gagtaggtgg 840
ttaacgtgca cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatatgtt cttgcccaag 900
gtcagttggg cagggactgg gcctcctcct ttctgtttct agtctagatc ctgtgctgcc 960
cttgcaaacg tcctgatttc ttgtccatct ctcacatttc ttagtcatct acattgtatg 1020
ctgaaagatg ggagaacgga gccagccact ttggcattag ttagacatgt gtaatcgcgt 1080
gttgagaatc tacagagact gagaatctgc acatgagggc aaagctcaag cctgtgacca 1140
tgtgtcaaag tggattctta ggggagggga gtacctgggg gaacagaaga agagagatgg 1200
atgagagcct gagccaggga gatgagaaaa gccagactgg atggagatgt ttcagaccaa 1260
gctggctcaa gggtgtaggg ctataggcag aaagctcagc tctccaggca ctcttgagaa 1320
tctggcttcg tcatttggcg ttcgctcttc ctttcatctt acactgtggc atgcatgtgt 1380
actctgtgct tagcacagga ttgcagatct gaggaccata gatgcacttt ctgtccctaa 1440
aacaagagga agatgccggt gacttttcct ctaatgcttt ctgaacaggg acttcctacc 1500
tcagcctcat cccattgttc ctttgtttct tggagtactt tgtgcctccc ccaccccaat 1560
ggcatggggc tctgagcttc caccccaccc tctatctctt ctagaatctt acacacttct 1620
ccattctgtt gtcaactacc cttcacttct tacagtactc tagtgagttc cttcatcctt 1680
agatctttca acaacctgtt tcagctccct tccctcttgg cagctttgca gaactcacat 1740
atttggctcc ctgccaccat tcccattaaa tggacccctg tgcatgggag cagcctctct 1800
tctgaacgct cacctgtgcc taaggctcca cccactgtga agttaatctc aacctgactc 1860
tactgcctgt agcaagccgg ccgcccaaat gcccccctcc accagcccta tgtgtctctg 1920
tctctctgtg tctctgtctc tctgtgtctc tctgtctccc cccccccccc gtgtgcgtgt 1980
gcgtgcgtgc gtgcgtgcgt gcgtgcgtgc gtgcgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 2040
gcgcgcgcgc gtgggtgcat gtatgcattt ctctgaacac ttacttaatt accacctgcc 2100
accccacacc tacactggga taccctggtt tttcctcctg ggatctcaac cctgtcctct 2160
ctgctccatg tctgtgactt ctttgctacc tggttttcat tttccctctt gagctcttgc 2220
tctttgcacc tgcgcttgct accaaaatgc aactcactat gacctttacc aactgggagt 2280
atcttccctt tggtcccaag gtaaagttca aggactttca ccattgttag aaagccttgt 2340
atgacctgtg ctccaccagg cttacttctg gttccacctg cttcatcccc atcacagaaa 2400
tgctctggac agcatgatgg gctcctcaat ccccactctg tctcagtctg actcccctcc 2460
cctcccctct ctctccttcc ctctcttcct cccctcccct ccctcccctt ccctctcttc 2520
tccccctccc cttccctccc ctccctcccc ttccctctct tcccccctcc cctccccctc 2580
cttcctctca cccatcctct ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct 2640
ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct ctcctctcct 2700
ctcttctcct ctctttactc aggccactgc ttactctcat ctgcccttac tctctgtatc 2760
ctttctttca tcctcctctc ctcaaaactt ggcagaagtc tcccagatct tgcaaataca 2820
cttttattcc tttggacctc tttagccttt gcctcttgaa gtccatcttc tctagaattc 2880
attttcatgg gagttttccc tgctaagttg gagtctactg gaaggcatag catggtgtct 2940
ctttgctctg actgcatgcc ctgcagatgt ttcatggtca agatggaacc catggaaagt 3000
cattgggcta gaggagaggc ataggtctat ggcataaggc tggttggggc aggctaggca 3060
gctacttgat gggataatac ggaactttgg aagaggcagc cagttgtttg atttgagaat 3120
gatataagca atgatgctct tgccattatg aaagtatgga ctgagcaaaa caccacatgg 3180
ggtttagaat tgactcaccc atttggaaac aggaaataaa ctgaagatga cctgaggacc 3240
attcagaggt agcatgcagg gatgtggccc agtagacact ggtctctaag tccttgatag 3300
atgctcatac ccaggaacct cccttgggct tccctggaga ctataaagtc tcatagtttt 3360
atacccatta aggtaccatc agaggggagg gttctcacta tgaactttgg aagtacttgt 3420
cctctgagcc ttgagtttat gtctacatat ctggtacatg gcaggtcttt cacaactaga 3480
ggtctttcac atggtgatct atgccattgt ggtgtcccct ttgttgagac aagctgacca 3540
ttggccttca gtttgaccaa gactaagatc aaaatggtta gaatatagtc agcacagtgg 3600
ttcatttttc tgagttagtg tggccttcat ctggtaatgt actacctgag gggggaggtg 3660
ccgcctctct ttcagcaccg tgcaaccatt caaggagggt gtgttgttca ccacatctgc 3720
ttcccactgc caaatcaggc ctcagaaaag ctttctggaa gtgacgccag cttcagggac 3780
aaggcccaag tttctagggg tcaacaccgt tccatggttc ctgaagagat ggtagactat 3840
ggaacgtagg cgttatgttt ttgacctatg taacatggtc cactaactct cagtatccaa 3900
tccatcctcg gagggcaccc cggaggtgtt accaacagcg aggaagagaa tcggttcatc 3960
ctcacccact ccgtgtactt tcagttgcta tggctgatat ctgatctaca gcaagaccac 4020
catcttctgg gcccccagtg agccctctag gagacttttg ggagcttgag tcctaggacc 4080
cgaagacatg gtctttccat gtgaaatgca tgagatgtct atgggacatc tccaaaccag 4140
ccagctctgg aggctttgtg gagcccattt tccctcaagg gagacctacc tgtttagcat 4200
ctaccctgct ctgagcattg aggaaatgct aacatctacc tcttctcaag ttcaagtcca 4260
gcctcagttc agttgggttt ttagtggcag tgccaagtgg ggatgaaata gtagttttga 4320
gtttagggag atggttgacc caaataatac cttttttttt tttttttttt ttaaagttca 4380
ctatgcctta gaaggcttcc tggaactgcc tttgattgaa acagatgtgc cattgtcttt 4440
ttttttctgg tggcaccctt ttcctatggt tatgatttgg tctcacaagg agatagggca 4500
gggcttccaa tgccctgatc catgtgcttg gcctgcttta actagccagg tcatctttgt 4560
ttttttattg cgtacaggat atttggcttt cctaatttgg caccactcct gcacattagc 4620
cccctgccgt gcatgccctt atgcctactg tccctgagtg cccattcctt cagcacccgg 4680
taggcacttc agcagcattt gtggagtagt aacccccaca gcatcgtttg tctgcaacct 4740
ttatgagctt ttggaagagc tgccgatttt ggggatgagt tgctggtgtc aaacctgaca 4800
tgaagatgag actcttggct tttgtgtgcc tgccgcatga tgcatgcttt gtgcccagcc 4860
agactcaaga ttccaccagc tcaatggccc agagggcttc ctggacgtgc cctcagcctt 4920
tgtcctcggc gtctctgtgt ggtacttgga gagatagtag accgtatagc gtacgcttta 4980
tctgtgacgt atgtaacacg gtccactaac cctcagtatc aaatccatcc ccgaggcccc 5040
tggagaagat gctgtcttcg gggagacgcc agtagactca tcatcagggc ttctccatga 5100
tgctggaaga gatggttttc aatatggcgt gtgttctttc ctgcatgatg ggaaatgaca 5160
taatctcccc cttcctctgc tgagctctgc cttgggaact cttgccatct ctggggagga 5220
gaccacaaag ctttctggga tcagtgctct tcgtgacctc agtgacaggg gtgtctaggc 5280
gactcttggt tagtagactc catgacctgc ttcttctcaa caccatccct gaagaggtgt 5340
cctgaggcaa cctggcagac atgaaccttc ttacagctgt ccttgctgtc acgcggtact 5400
tgaagaaatg gtttaccgtc ccacatacat tttgagtatg tatgtgggac ggtaaaccgc 5460
ttcttggtat ccagcccagc catccagtcc ataccatcct cgagcaagcc tgaagtgaga 5520
gaagaaacgt tgttttggct tgctctctac atcgggctgc ttggccaaac atccctctgc 5580
tttttgtgtg ctttctctgt taattcatgt ggcaaggtgt tcctgtcagc ttcagtgcag 5640
cccttaaggg cttcttcaag gatgatgaca acctccagga aggtgtccta catcccaact 5700
gggcatgctc cctccctcct taggacttga aaaagtggca attagctcca cagatgctca 5760
tcatcaaggg atgctgcgtg ttttcatcat ctgcaaagct atcatcagat gccttcaaga 5820
cattatgccc atagaaggac agctagggct acatgataca gtgcaaagac agatgcatga 5880
agacacagtc cctgtttcca ctgatgcttc gtatatagta tctttttttc catatcaagt 5940
ctagccttct agaggaagat gacccagcct ggctcctcca tgtatgctta cagatcaaag 6000
ttgcttcttg gctcacttct tcttacctcc agcccagcct tggagaactt gctgaagatg 6060
ctgctagcct cagagacagg gctctggttc ttgcatcagc aatgacctca cggtacctga 6120
agagggatca agcaaactgc atgtgtatta ttaacaccat ttgtaacctg gcctactctt 6180
ttcaatatca acttcagctt tgaaggtttc caaagaggcc ccattaacct tgggggtggg 6240
ggggcaaggc agaaggacaa atgccttggg gtagaggttg tccatgcttc ttgctttact 6300
tacagcgcat gttaatttgg tccaccttcc cataatagtg aatgcgcctt gggggcttcc 6360
tgtgaacaat atttccttaa aggcacagtg ctagttacgg ggtcttctct tcgcgtcctt 6420
gcaaacttct ctttgctata ttctctgcat ctgcagcagg caatgcatgg tggtctcttt 6480
tcaacattgc atctagggtt tcctggaagt gataatcatg aggaaagaag ccagctcctg 6540
caccaccctc tctccatggt acctgaaaag atggttgacc atagaacatg cgctacttct 6600
gtgtcgtatg tagtatggtc cacatcttct cgttatcaaa gtcattcgtg agggttttcc 6660
agagaccgag ccaacttcat gggagatatc ctgtcctggc ttcagcacag tacttgggga 6720
gatggtagac tgtcgagtgt gtgcgttaat tccagcatgt acagcatggt ccaccacatc 6780
tctgcatcag ccggtcacca ggggctttct gaaagccata ccaattgaga gtagggctca 6840
ggcggcagac cctatccaac acagattacc cagtgcttgg ctacaggcca tgttcattac 6900
ctacgactct ggccatttga tccaaagcca atatttggca cccagcccag ccttacaggg 6960
catcctggaa gtcatagtgg cattaaacat gagtttgtgg ccattgccac acatgccgat 7020
tgctggtagt ttgtgacact cattgagaag gcattttgga ggtaacacca aattaagtaa 7080
agtgagctgg aatcagccag cgttacctca aggtatttga agatgcggtt gaccatggtg 7140
tgtacgcttt atttatgacg taggacacat ggtctacttc ttctcaatat cacatctcgc 7200
cttggaagac ttccaggagg tgacatctgc tttgaggaag agccagtgtc ccggtcttcc 7260
tactgctgct gcttggtact tggagagagg tggtccgtgg cgcgttcgct tcatttatgg 7320
cgcacattac acggtcgacc tctttgcggt atctaatccc gccttgcgag ctttcctgga 7380
gctaacacca gctgtggggt ggggacacta aatgtgtgtg ctagcgcaac ccagccagcg 7440
ggtttgtctt ttcttgtgtc tgacaataac tcttgtgtgg cagccttctt ctcagcaaat 7500
ttctctggct tggcagcttc gtgggcaggg tgacttgcag accaggaaag tggcatcgac 7560
atgtgataca cgtgtgggtg cgtgaggtgg ttgaccagag agcacacgct atatttgtgc 7620
cgtttgtgac ctggtccact aaccctcagt atctaacctt cccttggaga acttcctgga 7680
agagatctca acttttgggg acagaggcaa taagccagct gtacgctgtt agacttggag 7740
acagcatcct cagtacttgc aacatatgtg cctgttatgg tagtattgga tgggcttcca 7800
atgctgtcct atacttggat cccttccttg atatggggcc atccaagttc aagaaacgta 7860
ccatgttgtc agacatgacc agggtgtgtg tatgccattt atatatggca caggtcgcag 7920
gtcaccttag cacacttgca tgctaaatct gtgggaggaa tcatctttgg tttgggggca 7980
tctgtgcctt tctgtggtta cccaaaatgg tggtaagtcc tatagccagt ctctactgcg 8040
ccactgctct ctggttgtga cataacttca ggatcatgcc atggaggtct gctgtactgg 8100
ggcatgtgat gggatggctg tcagatatat atcaactaat ggcttgcttg agcactttga 8160
ctaacatcca gtgtgcaacc ctgcattcaa caggcctgcc aggtctgaag gtcacgttgg 8220
ggaattaccg aggtagtctt gtcagtgttc gcttctggta ccggaagaga ggttttctgg 8280
gtctctgttt ctttgatgag aatgaaacac acccagctaa cctttttttc agtatcaaat 8340
cccatcttgg aggcttcgtg gtccagatcc cagtctcagg gaaggatggt cctgtcagca 8400
tccagccagg ggacaggaat aactggttct ccacaaagcc agcgagtgga ttatcgttct 8460
gaatggtgtc ctttgtcctc taaaccctcc caggcctgcc aggtctgaag gtccagtttg 8520
ggaaggtgtc attgttattg ttaactgagg atgtggaaga ggggtttctg tgtttgaaac 8580
acatttggtc aacctctctt cccatcagaa caaactatgg aggccttctg gtccatacct 8640
cagcctcagc tgaggacaca ctaatagtta tgaacaagtg agtgacggac aaaacccatc 8700
ccatacatca gatttctgtt gcctgtgctt ctaaccttca gtatcttgtc cattctcagg 8760
aggacttctc aaccaatatg gtgttccaaa gttggggaag atggcagcca ccgaggcaac 8820
tctaccccag gtcatcacag gtaggttgca cccactttgc ttctaacagg ttagacacag 8880
ccacccccac acatgtccag catgctttgg aggcacggtg atgggctttt aatcagccaa 8940
cccctgctat aggactgtct attgtagaga acacccactg tgtcagatgg tacctagatc 9000
catgctattc acacacaccc acatccttgt aataagagac ttggaatcag cagtgttcta 9060
gcagtaggaa agcaaacctg aaattggcac acacatttgc ccagtgagct ttaagatatg 9120
aaatctggag cggggcagtg gtggcgcacg cctttaatcc cagcacttgg gaggcagagg 9180
caggtggatt tctgagttcg aggccagctt ggtctacaga atgagttcca ggacagccag 9240
ggctatacag agaaaccctg tctcgaaaaa aaccaaacca accaaccaac caaacaaaca 9300
aacaaataaa caaaagatgt gaaatctgtt cttagtcctt aactccaccc agggttgtgg 9360
tcagcagtag agctttctgt ggggttccag gtagaacaca attctcatct gcaaatcatg 9420
agcccttttc ataggcattt catatcagat atctacatta tgatttataa cagtagcaaa 9480
atcacagtta tgaagtaaca ttgaaaataa ttttacagtt ggggattacc caacatgagg 9540
aagtatatta aagggtcaca gcactaggaa ggttgagaac cactcgacca gggggtggaa 9600
ctgcctgccc ctgcctgctg cttctttata ctaccacatg tgctggcaca catttacctt 9660
cctactaact ttataatgtg tctgctttta gaatcttacc ttccctggaa actacccaga 9720
ctcacaacca gagggctggg tcgcttctca tcacccacct acctcttgga accagaatcc 9780
gaggctcatt cctgaacacc cccaatgtac tgtacttgtt gaagttgaga gctactattc 9840
ccctgttatc tcctgaggca caatttctgg ggtccctggt tcccttcagt gaccccccct 9900
aaacctggag agataaggaa tgcaggtggt ctgtgttgtt ggtaaatagt ctcaggcaat 9960
tctgtggact gtcaaattgc acaggggttt tggttgctct ccagggccca cagaagcaga 10020
cacttctgac aaggcacctg gcactttcca gctgcctttg tttgctttct gaccagtgct 10080
aattgatact tgaaggagag gttgtccgtg ttgtcttctc tttatttatg atgaaacata 10140
cacgggaaac ctctttttta gtatcaaatc ccaccctggg ggcactccct gtccctgatg 10200
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tctccttagg gaaggacacc agagtcctca tcaatggaaa aggtatgtca tggtgttctg 11100
tctgaaagaa tatattatat tttcatgtgt gtccttcttt actaatgctg agtatgcctt 11160
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ccctcctcca ggctcctggc aagtggttct tgcagccatg gcagagacat agaaagtaag 11280
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gccaatgaag ggtggggagg tgccctgtag ccatgtcatg agggagagaa catgtgtaca 11400
agcataggca accaactatc tacctggaac acctaagaag tctatcttta ttcatgttct 11460
tttttttttt taatctcaat gttccatttc ccagcaagtg gagggtcaac agaatctgtt 11520
ctcagaacac cacatgccac ttacatatat ttttgtccag gagacattgt ctcgttctga 11580
caaaggctca gatatctttt tgtttcccat ttcatgataa cctccttgca tcagggcctc 11640
caccgtggaa cataggttga tgtcctcccc tctagcagat gggtggtgac ctcgactgag 11700
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gtcaggatta ttatatcatt ctctgatgtt tgaggagact ccaaagacct ccccaaagga 11820
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gtgagagccc cctaggtaca gcggggctgc agcgtgatcg cctgctcacg cacaggaagt 11940
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gttccatgct gctgacgtac ggtgcttaat gagaagttgc ccgcgtgttt ttcgctttat 12060
atgtgacgaa acattcgcgg tgcacttctt tttcagcatc ctattctacg ttgaagactt 12120
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ctcagccgtg gtacctgaaa agaagttgcc catgttattt ttcgctttta tttgtgacga 13560
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cccttgctga tggtatgtga gcagatgtct ggccagatgg caagtgcttt tgtttattta 15360
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aggcaaatct gtacataaaa atctagtttc tatcacatcg cttccttctt aattgattga 15480
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tttttttgta taactcattt aatataacaa ttttcgataa catttttttt gtagcaagtt 15720
ttcattgtaa cccaggatac ctttgaattt cttaggtagc tgaggctgac tttgaactcc 15780
tgcttgcctc tgccttccaa acgctggcat caaaggtatg ttaccataac cagctcaaaa 15840
ctgttgctct tgcagaggac catagttcag ttcccagcac ctagactgga tggctacaag 15900
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cacacacaca cacacacaca catgaaccta aacgtagctg gacattgttc ctaaagagca 16140
gacccagttc acacacagct acatttgccg ttgctgctcc tagggtcagg acagatgaac 16200
acatttgctc ccgtaaccag ctatcagatc ccctaacgaa ttctgtcctg cttctttcta 16260
gggtctcctg gcctcatagg gcactatgaa aggaagcagg tgtagcccac tggtaagtga 16320
cctatccatg cacttgaagg tgtttgtgag gttttctgct ttaacaagct gtagatacaa 16380
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tacccagctt tatgaaactc tctggccagt tcctacttta ttaaaacatg acccatgaca 16500
gcaccactat ttggacatat atgggagggc tggtcacaga gcatatgttc tatgtgtggg 16560
gactatcacc tggcctactt gtcttcggcc tcaaggctaa gatgacgaag atgttggagt 16620
taattagctg agttggggtt ttcagtcctt ctttgctttt tttttttttt ttttttttaa 16680
ccaaagattt atagtgtcgg tactggtatg cctctgtgtc tgatgtactc aaaaaagatt 16740
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actaggctgt gtgacaacca gggctatgtt taactgtacg gtgggctcta gatacacttc 17160
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ggctgtgccg agggcgcctg tctgctgcct tcttcatttc tgacggatta ggcctcggct 17460
ctttctcttc aggactaaat cttttggtat ttaaaaggtg gatattcctt ctatgtttat 17520
gctttttgtg attaaacata gaggaaattt cacgttttca gtgtcaaatg ctgctgggta 17580
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ttgagagctt ccctcatggg ctgccaactc agccagaggt caggggtctc gttctggaat 17760
cccccacagc taacaagtct ttcccattgt gtcccttctg tcgcagatag gactgtccta 17820
ttggatgtcc caagagttta agtctgatat ctaaaaggta gatttccctt ctgtggtttt 17880
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tattccttct atggttacgt gcttcctgga taatcataga ggaacatcca ctttttcagt 18300
atcaaatgtc gctctggaac tatttctgga agattctgta gggtctgggg ctggggggga 18360
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ctgcaggaga gggagaattt attgaggcag agtaacctca gaaggcaccc ccccccccat 23580
gtactctcac agtgacagct ttgaggtggc aacagctttg gtggcttgct tctttgtgct 23640
tggtctggag aacactgaga ataactcacc tgtctgttgt tgctgttaag tcttagttca 23700
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tgtgtgtgtg tgtgcctgca tgcatgcttg tacaaattgt tggttagtgt agggcctctc 24060
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ggcctaagtc aatggatcct gacccttact ggagagccct ccctggcgtg ctcgtgcggg 37320
gcagccatac acactggcac aaggggaccc tgcgggatct ccttccgctg ttctttctct 37380
cctccctcca tgtttatctt tgaagcatta cttgcttggt ttataggact ggatggtcaa 37440
gcagttcttg ctatgacatc accgtggggg gagggggcag gtgacagggc ggggatgcca 37500
gggtcgtggg gctgcagtgg ttgggtgggc ccaaggagga gcatctctgg atgatgcagt 37560
cattgcctcc tcgcttctgg aaggcatcgt ctctgggagg gtggtgtggt atatgcgcag 37620
ggtctcagca tctccctatc tccagcttac aaaggagaga tagagtaagc agagttctgc 37680
acccacttct gccccgagtc agctcctcgc tacctgggtc tcaaggttgt ctgggaaggc 37740
tttagatatt cttggaaggt gaaagggtgg tagattgcac tggggaggtg atggaataat 37800
tgctttcacg tggtggaggg tggctcctca ctgaatgggg agttataatc tctgaggggc 37860
tccaggatgg ttcttctgga aactcagcca tcggcctcgt tctgagcatc cgagcctctc 37920
cgtggtactc ggagagaggt tacccgagca actttgcatc tggaggacga atgttgctcg 37980
gtgaacccct tttcggtatc aaatccctcc agggaggcca cctcagggaa gaccatggac 38040
tcatctcgct ctggggtatg ggacggatgg tcgaccagct ggaaagtaat tgtttctaat 38100
gtacttcacc tggtccacta gccgtcggtg cccgctgcag cctgcgccca ggatgtcaca 38160
gcctcagctc aacacctctg ctggtacttg aagggagatc gaccgtgtta tattcgcttg 38220
gctgacttcg aataatacat ggttgatctt ttctcagtat caacgctcag cttggagaag 38280
ctcttggagt tgcagcccct gtgggggtgg ggacagcatg gtgcttctag gttgctgcct 38340
ccgcggggaa ctgggctggg tggaacaggc tgtgtgctgc ctgtgtcaac cctactcacc 38400
atttatatgc aatccccccc ttccccccag gacagcttca ggtggtgatt ccagctccag 38460
ggttgctgcg gtcaacactg ggtacttgag gagaggttgt ctgtgatgag ttcgctttat 38520
taatgacgaa tataacacag atggcctgtt ttcaatacca cctgccactc cggtcactcg 38580
gcagtacata ccaggtgtca caccactgcc cggtaggtaa atgcatggac tctgtatgac 38640
gcttgtcacc ccctcttcac tgaacctcag ctctgaggag cctcctggga tcgcaccaac 38700
cttgtaggct gggccacgaa gcattggcca gatgtgcaat ggatggctgt ccactttcca 38760
tgcctctttc ccgccacaac aatgggtgtt tgtccctgtc taaggcttcc accgagggct 38820
gcatgctcaa atgccctgta ccctgggtgc ttctcaatac catgagggct tggaggggct 38880
agcatgatac ttagggaaga gccaggccag ttggttacac gtgcagttcc tagtatctga 38940
ggtgagattg cccgtgacgg gtttccattc ttaatgctgg tacagtgcat ggtcacctct 39000
ctttatcatt ggctcttact gtgtgagcat gggtgtcagg ggagggacac actttgctga 39060
cccactggac accactgatg gtcaggcatg tagctgactc atcctgaccc agagcctcac 39120
atctcctgag gtgggggttg ggaagtccag aagggcatct tagaggaaga agcatcctaa 39180
gtagagtccg tgctggtggt acctgagcta gcttgtctct gagacgtttg ttttctatct 39240
gatgactatc ccacagccta cttctctgca ccatgtccta ccctagacca tttctacttt 39300
gaggcattga tgccaagaac tgaagccttt gtgttggttg actctctagt ctgtatgtga 39360
gaccatccct tggcctgtct tgtcctcagt gccaccctgt tggaaatagc acagaatgtc 39420
ctcctgagtc tacaaggcag tgatacccaa gctctgtccc tgcttcacga gcacaggggg 39480
cccagtaggg attagcctgc acttcttttt tttttttttt ttttttattt tttttttttt 39540
tttcattttt tttttattag gtatttagct catttacatt tccaatgcta taccaaaagt 39600
cccccttacc cacccacccc cactccccta cccacccact cccccccttt ggccctggcg 39660
ttcccctgta ccggggcaca caaagtctgc gtgtccaatg tagcctgcac ttcttcatgt 39720
ttcctccaac ttaacactct ggctctgtca gactcctgtg agcttactgt agaggcttga 39780
cctagagtct caaggacccc agaaagtacc tgatcacacc cagtaggagc ctttgaaaga 39840
caggctatag atttttggta tttagtaagg ctccccaggg tggcaaagag ctctttctga 39900
ttgggcttgc tccccattgg agcaagtagc accctcaccc tggcaactcc accctgcatg 39960
ctttttctcc tcttctgggc ctcctcagca gcaaaatgct cttccaacag agatagtggc 40020
tgcgcaccct ggcttgtacc tagcacatgg tctcctttag atttcttctc ttgttcagga 40080
tggtctgccc aggcgccctc tctctgggag ttggtcctgg ttactgtctc ccacagtcca 40140
tcccccttcc ttggtcctca agcttgtagg ccccctccac aggagttcaa gactcggagg 40200
ggatcgtgtt ccctgctctg cagtgacagt gcaggcagcc tgacactctt atccagctcc 40260
ttcctttgtg atatgacatc agactgcttg tcagctatgg ctccccaggt gcctgctttc 40320
ccaaactgcc tagtaccttg gttcccagcc tctccctgac cccaaccaaa acaaaacaaa 40380
acaaaacaaa acaaaaaaaa aaaaaaaaga agaagagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa 40440
agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaaaagc tttaagattt 40500
cccaaggcag acgaggacct ttcctttgcg tcttttctct ttcctctgtt ttactcccta 40560
ccccttccct ccctcccatc ttacttccct gacttatctt ctgctgtatt ctaagcctta 40620
ggatccaggc caggtctata gtgacagaat aatggagtgt gctgattgac taatagagtc 40680
cccaaaggca gaaaccatat taggttaatc cccaggaagg tggtgagcat gaagcaggaa 40740
ttccataaga tgtggtggct gattccataa atatagaagc tgggttcact tagtctttgc 40800
atttgttaga ggcctcccac cccagctagt caccgatttt tgagacgtac agcgataggg 40860
gacagacagg tcagctatgt ctgcgggctt ttctttactt ttgtagctgg gggtctcatg 40920
ctaggcttca aattcatctg agcacaaccc ccaccctcca ctccgtgatc tgaggcggaa 40980
agaaccagat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atagtactgt gcacggacta 41040
acagaagaac ccgttgtgac gtctccgtgg cagcaagcca gaggcccctc agaggccctc 41100
gtgcagcagg cctgagctgc tgtcagggct aatattttat gcatggacct aagcaaatgg 41160
gaacatttgg agatggaaat tgctgttaat gacacatctt tggaatatat taaacgcgtg 41220
caagaaggct gctgatctct ccatttaatt gctccagtgt aagcgcagtc acaccacggc 41280
atccacagat aggctacccc tagtctctgc atcaccgatg gggaaagccc caggtacctc 41340
agccaccaag ggagtattat gtacaagatg gaatgtcagc tggggtgcca agcaaccacc 41400
gacacgcaca ctccaaattc attggagacc ctaagaggat ggtccctcct gctcggtgca 41460
gacttttatt aaaagcaaaa ttactagatt tatctattgt ttgagaagaa gaaaagacaa 41520
ataaaggact tttctcatcc agtgagtcaa gtgaaaatgt ctgcccctca ggcagacagg 41580
aggaaagcct ctggggtggg ggactttcag aggtcagaga attcaccatt cccaagatag 41640
cgtgttaacc taatgtgcca aggtcacagg acacaggcta gttcaggtga tcaagtcagt 41700
ttgcctatcc cacagttcct tggggtgtgg ttagactaag gcagtggtct gttcctttac 41760
tattttcaag gagatggtgt gtagcttgtg tgtgtgtatg tgtgtgtgtg tactggctgt 41820
ccccaataag catgtgtgga gggtgaggaa agattggctc aaagaggtgg agttgtcttc 41880
ccaggatcac acagctagag acagggctcc aggctggatg tccttaagat ctttgcttgt 41940
Claims (5)
1.pUC57kan-T7重组质粒的构建法，其特征在于包括以下步骤：
①、根据小鼠miR-379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA，5’端设计的gRNA为gRNA1和gRNA2；3’端设计的gRNA为gRNA3和gRNA4：
gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG
gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG
gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG
gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG
②、引物退火形成的双链克隆入pUC57kan-T7载体，得到pUC57kan-T7重组质粒。
2.利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将pUC57kan-T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；
2)、基于PMD-18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；
3)、基于PMD-18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；
4)、构建miR-379/410CKO。
3.根据权利要求2所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于：
所述步骤4)为：利用Cas9蛋白、体外转录获得的sgRNA、5’同源臂Donor、3’同源臂Donor，构建miR-379/410CKO。
4.根据权利要求3所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于，所述步骤2)为：
针对miR-379上游，设计5’arm同源臂引物和3’arm同源臂引物，以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR的方法，从小鼠基因组中扩增出带有lox P的5’arm片段和带有lox P的3’arm片段；然后通过SILAC的方法将5’Donor的5’arm片段、3’arm片段和线性化的pMD-18T片段连接，获得5’donor重组质粒。
5.根据权利要求2～4任一所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于：
受体鼠出生的F0代小仔，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型；
当采用引物①进行PCR：当PCR产物为322bp时，为WT小鼠；当PCR产物有414bp和322bp两条带时，此为miR-379/410CKO杂合子小鼠；当PCR产物是单一的414bp时，此为miR-379/410CKO纯合子小鼠；
当采用引物②进行PCR：当PCR扩增不出任何条带时，为WT小鼠；当PCR产物是323bp时，此为miR-379/410CKO杂合子小鼠或者miR-379/410CKO纯合子小鼠。
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