CN112424601A - 检测癌症患者中肿瘤抗原的诊断性测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性涉及使用细胞培养物的诊断性测定法，特别是用于分析样品，特别是患者样品中表达报告细胞的嵌合抗原受体(CAR)的测定法，以通过量化肿瘤抗原的表达和/或预测对癌症免疫疗法的临床反应来诊断癌症。本发明的另一方面是提高例如癌症免疫疗法的安全性。

Description

检测癌症患者中肿瘤抗原的诊断性测定法
技术领域
本发明一般性涉及使用细胞培养物的诊断性测定法，特别是用于分析样品，特别是患者样品中表达报告细胞的嵌合抗原受体(CAR)的测定法，以通过量化肿瘤抗原的表达和/或预测对癌症免疫疗法的临床反应来诊断癌症。本发明的另一方面是提高例如癌症免疫疗法的安全性。
背景技术
在所有年龄段的人群中，癌症都是导致死亡的首要起因之一。癌症是细胞的一种异常阶段，其导致一个或多个细胞群不受控制的增殖。最终，增殖导致正常生物学功能异常，从而导致多种临床和非临床症状。肿瘤细胞通常表现出一种或几种将肿瘤细胞与正常细胞区分开的特性，例如形态、胎抗原的表达、接触抑制缺乏和生长因子不依赖性。
不幸的是，大多数癌症在疾病的早期阶段是无症状的，这导致了具有挑战性的情况，例如，对于肺癌，只有15％在发现时还处于早期局部化阶段。但是，对于这些得到早期诊断的患者，五年生存率可能高达85％，而当癌症扩散到其他器官后，此类患者中只有2％的人可以生存5年。尽管数十年来癌症治疗的改进令人鼓舞，但成功治疗癌症最重要的预测指标仍然是疾病的早期检测和分类。
通常，由于这些细胞源于“自身”，因此免疫***不会发出警报并触发对肿瘤细胞的识别。癌症免疫疗法的目的是通过识别仅由肿瘤表达的独特蛋白，同时促进免疫细胞的作用，从而控制免疫***攻击肿瘤细胞，例如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或T细胞细胞毒性，从而实现对肿瘤细胞的破坏。这种促进可以通过经典的具有ADCC能力的抗体和/或T细胞双特异性抗体，或表达识别肿瘤抗原或人工嵌合抗原(CAR-T)的天然T细胞受体(TCR-T)的工程化的T细胞来实现。抗体可识别常规肿瘤表面蛋白或MHC复合体(pMHC)背景中呈递的蛋白衍生肽。在任一种方法中，都不是所有患者均对临床疗法产生反应，因为在各种癌症类型的患者中，肿瘤细胞表面或pMHC上表达的肿瘤抗原密度差异很大。
因此，有效检测并量化肿瘤抗原(表面和/或pMHC)的工具将确保更好地诊断癌症患者，并且可以预测对相应癌症免疫疗法产生临床反应的可能性。此外，癌症免疫疗法有时会触发针对正常组织的有害免疫反应。早期预测免疫疗法安全性将有助于医生监测患者潜在的致命副作用。
鉴于例如淋巴或血液中已经存在非常少量的存活肿瘤细胞可能指示疾病进展中的重要标志，检测多种体液中的肿瘤抗原仍然是最重要的。免疫学诊断性测定为此提供了一种能够检测多种疾病的重要工具。然而，例如在MHC呈递的蛋白衍生肽的背景中，此类测定的灵敏性和/或特异性可能并不总是足以可靠地检测肿瘤细胞。
因此，仍然需要高度灵敏且稳健的诊断性测定法，以检测适用于检测恶性细胞的癌抗原和/或预测靶上组织外效应，以提高免疫疗法的安全性并预测患者对特定免疫疗法的反应。
本发明人开发了一种具有集成简明读出的高度灵活的测定法，在用以筛选癌症患者中的肿瘤抗原的高通量形式中可行，同时适用于经典表面癌抗原和MHC复合体呈递的蛋白衍生肽。本发明适用于癌症患者的诊断、免疫疗法临床反应的预测以及免疫疗法的安全性测量。
发明内容
本发明一般性涉及用于确定样品中特别是源自患者的样品中靶抗原例如肿瘤靶抗原和/或肿瘤细胞的存在的诊断性测定法，并将靶抗原的检测与报告细胞响应于肿瘤细胞的激活相结合。本发明的测定法适合于筛选患者样品并允许在表面抗原和/或MHC呈递的蛋白衍生肽的背景中精确测量抗原密度。本发明的测定法还可用于预测对癌症免疫疗法产生临床反应的可能性。
因此，本文提供了用于确定样品中肿瘤细胞的存在的诊断性测定法，所述诊断性测定法包括以下步骤：
a)使所述样品与表达报告T(CAR-T)细胞的嵌合抗原受体(CAR)接触，其中所述报告CAR-T细胞包含：
i.能够与所述肿瘤细胞特异性相互作用的CAR，其中所述CAR可操作地偶联至响应元件；
ii.在所述响应元件控制下的报告基因；以及
b)通过测量所述报告基因的表达来测定T细胞的激活以确定所述肿瘤细胞的存在。
在一个实施例中，所述CAR包含能够与肿瘤靶抗原特异性结合的靶抗原结合部分。
在一个实施例中，所述靶抗原结合部分是Fab片段。
在一个实施例中，所述报告T细胞是Jurkat细胞。
在一个实施例中，所述肿瘤靶抗原是细胞表面抗原和/或受体。
在一个实施例中，所述肿瘤靶抗原选自由CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1或其片段组成的组。
在一个实施例中，所述肿瘤靶抗原是与人类主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。
在一个实施例中，所述靶抗原结合部分是T细胞受体样(TCRL)抗原结合部分。
在一个实施例中，所述CAR包含至少一个细胞内刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域。
在一个实施例中，所述细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活导致响应元件的激活。
在一个实施例中，所述响应元件的激活导致报告基因的表达。
在一个实施例中，所述响应元件是NFAT途径、NF-κB途径或AP-1途径的一部分。
在一个实施例中，所述报告基因编码发光蛋白。
在一个实施例中，所述报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。
在一个实施例中，所述样品是源自患有疾病的个体的患者样品，特别是其中疾病是癌症。
在一个实施例中，提供了一种预测抗肿瘤CAR-T细胞治疗疗效的方法，包括提供来自患有肿瘤的受试者的样品，以及根据实施例1至15中任一个所述的诊断性测定法，通过测量所述报告基因的表达来确定T细胞激活，其中所述报告基因的激活指示所述抗肿瘤CAR-T细胞治疗在应用于所述受试者时的疗效。
附图说明
图1示出诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的示意图。图1A示出诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的一个实施例。肿瘤相关抗原(TAA)可通过表达抗TAA抗原结合受体的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。这种识别导致的细胞激活可通过测量发光来检测。图1B示出诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的另一个实施例。在Fc(识别结构域)中被地高辛配基化的靶抗原结合的IgG可以通过表达抗地高辛配基CAR的JurkatNFAT报告T细胞识别。这种识别导致的细胞激活可通过测量发光(cps)来检测。图1C示出诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的另一个实施例。含有P329G突变的TAA结合的IgG可以通过表达抗P329G CAR的Jurkat NFAT报告T细胞识别。这种识别导致的细胞激活可通过测量发光(cps)来检测。
图2示出本发明中使用的不同CAR形式的架构。图2A示出Fab形式的架构。所示为包含由Ig重链片段和Ig轻链组成的抗原结合部分的细胞外结构域。附接至重链的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。图2B示出具有重链和轻链交换的Fab形式的架构。所示为包含由Ig重链片段和Ig轻链组成的抗原结合部分的细胞外结构域。附接至轻链恒定结构域的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。图2C示出scFab形式的架构。所示为包含由Ig重链片段和Ig轻链组成的抗原结合部分的细胞外结构域，二者均通过接头连接。附接至重链的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。图2D示出具有VH-VL交换的crossFab形式的架构。所示为包含由Ig重链片段和Ig轻链组成的抗原结合部分的细胞外结构域，其中VH和VL结构域被交换。附接至重链恒定结构域的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。图2E示出具有CH-CL交换的crossFab形式的架构。所示为包含由Ig重链片段和Ig轻链组成的抗原结合部分的细胞外结构域，其中CH和CL结构域被交换。附接至轻链恒定结构域的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。图2F示出具有细胞外抗原识别结构域的经典scFv形式的架构，该结构域由可变重链和可变轻链组成，二者均通过接头连接。附接至可变轻链的接头将抗原识别结构域与锚定跨膜结构域(ATD)连接，该锚定跨膜结构域与细胞内共刺激信号传导结构域(CSD)融合，而该细胞内共刺激信号传导结构域又与刺激信号传导结构域(SSD)融合。
图3示出示意图，图示编码依照本发明使用的CAR的示例性表达构建体的模块组成的示意图。图3A和图3B示出示例性Fab形式。图3C示出示例性scFab形式。图3D和图3E示出示例性crossFab形式。图3F示出经典scFv形式。
图4示出使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的单个克隆作为报告细胞。
图5示出使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的细胞群作为报告细胞。
图6示出使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的细胞群作为报告细胞。
图7示出使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的诊断性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的细胞群作为报告细胞。
图8A和图8B示出使用经RMF肽或VLD肽脉冲刺激的T2细胞通过FACS对WT1/HLA结合物5E11和33H09进行的特异性评定。
图9示出与经RMF肽或VLD肽脉冲刺激的T2细胞共孵育时，一个抗WT1/HLA-Fab表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞群中CAR-NFAT信号传导的激活。比较RMF肽(靶标)与VLD肽(脱靶)的信号有助于评定激活的特异性。
图10示出与经RMF肽或VLD肽脉冲刺激的T2细胞共孵育时，多个抗WT1/HLA-Fab表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞群中CAR-NFAT信号传导的激活。比较RMF肽(靶标)与VLD肽(脱靶)的信号有助于评定激活的特异性。在没有靶细胞的情况下孵育的NFAR报告CAR-T细胞群的信号说明测定的背景较低。
图11示出多个表达CAR结合物的Jurkat NFAT Fab-CAR-T细胞群中到不同肽/HLA靶标的CAR-NFAT信号传导的激活。Jurkat NFJAT CAR-T细胞群F06、F29和F30与无关肽结合至盲肽/HLA靶标。
图12示出用于检测MHC呈递肽的诊断性报告CAR-T细胞测定的示意图。
图13示出使用抗WT1/HLA-Fab-CAR转导的Jurkat NFAT报告细胞来检测AML患者骨髓中WT1阳性细胞的诊断性报告CAR-T细胞测定的示意图。
具体实施方式
“亲和力”是指分子(例如，抗体或CAR)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，所述固有结合亲和力反映了结合对的成员(例如，抗原结合部分和抗原和/或受体及其配体)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的完善确立的方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的优选方法是表面等离子体共振(SPR)，并且测量的优选温度是25℃。
术语“氨基酸”(“aa”)是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢原子、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。在本文中，氨基酸可能用它们众所周知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来表示。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、***和修饰。可以进行取代、缺失、***和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征。氨基酸序列缺失和***包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和***。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用天然存在的二十种标准氨基酸的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。因此，在本发明的背景中，术语抗体涉及完整的免疫球蛋白分子以及这种免疫球蛋白分子的一部分。此外，如本文所讨论，该术语涉及修饰和/或改变的抗体分子，特别是涉及修饰的抗体分子。该术语还涉及以重组或合成方式生成/合成的抗体。在本发明的背景中，术语抗体与术语免疫球蛋白可互换使用。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实施例包括但不限于Fv、Fab、交换型Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单结构域抗体、单链抗体分子(例如scFv、scFab)，以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc NatlAcad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，如本文所述，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指与抗原决定簇特异性结合的分子。抗原结合分子的实施例是抗体/免疫球蛋白及其衍生物，例如其片段。此外，如本文所讨论，该术语涉及修饰和/或改变的抗原结合分子，特别是涉及修饰的抗体分子。该术语还涉及以重组或合成方式生成/合成的抗体。在本发明的背景中，抗原结合分子优选是抗体或其片段。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将与其附接的实体(例如免疫球蛋白或CAR)引导至靶位点，例如引导至携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质或与肿瘤细胞上的抗原决定簇结合的免疫球蛋白。在另一个实施例中，抗原结合部分能够通过其靶抗原激活信号传导，例如在抗原决定簇与T细胞上的CAR结合时激活信号传导。在本发明的背景中，抗原结合部分可包含在如本文进一步定义的抗体及其片段以及抗原结合受体(例如CAR)及其片段中。抗原结合部分包括抗原结合结构域，例如，其包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
在本发明的背景中，术语“抗原结合受体”涉及包含锚定跨膜结构域和包含至少一个抗原结合部分的细胞外结构域的分子。抗原结合受体(例如CAR)可以由不同来源的多肽部分制成。因此，它也可理解为“融合蛋白”和/或“嵌合蛋白”。通常，融合蛋白是通过两个或多个最初为单独蛋白编码的基因(或优选为cDNA)的结合而产生的蛋白。该融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单个多肽，优选地具有源自每个原始蛋白的功能特性。重组融合蛋白通过重组DNA技术人工产生，用于生物学研究或治疗。在本发明的背景中，CAR(嵌合抗原受体)理解为包含细胞外部分的抗原结合受体，该细胞外部分包含通过间隔序列与锚定跨膜结构域融合的抗原结合部分，该锚定跨膜结构域本身与例如CD3z和CD28的细胞内信号传导结构域融合。
“抗原结合位点”是指提供与抗原的相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab或scFv分子通常具有单个抗原结合位点。
术语“抗原结合结构域”是指抗体或抗原结合受体(例如CAR)的一部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个免疫球蛋白可变结构域(也称为可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指免疫球蛋白重链或轻链的参与免疫球蛋白与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co，第91页(2007)。单个VH或VL结构域通常足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“ATD”是指“锚定跨膜结构域”，其定义了能够整合在细胞的细胞膜中的一段多肽。ATD可以与其他细胞外和/或细胞内多肽结构域融合，其中这些细胞外和/或细胞内多肽结构域也会被约束在细胞膜中。在如本发明所用的抗原结合受体的背景下，ATD赋予抗原结合受体例如根据本发明使用的CAR的膜附接和约束。
如在根据本发明使用的抗原结合受体(例如CAR)的背景中所用，术语“结合至”定义了“抗原相互作用位点”和抗原彼此的结合(相互作用)。术语“抗原相互作用位点”定义了多肽的基序，其显示出与特定抗原或特定抗原组特异性相互作用的能力。所述结合/相互作用也应理解为定义“特异性识别”。根据本发明，术语“特异性识别”是指抗原结合受体能够与识别结构域即本文定义的修饰的分子特异性相互作用和/或结合，而未修饰的分子不被识别。抗原结合受体(例如CAR)的抗原结合部分可以识别相同分子上的不同表位、与相同分子上的不同表位相互作用和/或结合相同分子上的不同表位。该术语涉及抗原结合受体的特异性，即，其区分分子的特定区的能力。抗原相互作用位点与其特定抗原的特异性相互作用可能导致信号的启动，例如，由于诱导包含抗原的多肽的构象的变化，导致包含抗原的多肽的寡聚、抗原结合受体的寡聚等。因此，抗原相互作用位点的氨基酸序列中的特定基序和抗原由于其一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰而彼此结合。术语“结合至”不仅涉及线性表位，而且还涉及由靶分子或其一部分的两个区域组成的构象表位、结构表位或不连续表位。在本发明的背景中，构象表位由两个或更多个在初级序列中分离的离散氨基酸序列定义，当多肽折叠成天然蛋白时，该初级序列在分子表面上聚集(Sela,Science166(1969),1365和Laver,Cell 61(1990),553-536)。此外，在本发明的背景中，术语“结合至”可与术语“与...相互作用”互换使用。CAR或抗体的抗原结合部分(例如Fab或scFv结构域)与特定靶抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析))(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，特别是如通过SPR所测得的，抗原结合部分与不相关蛋白的结合程度小于抗原结合部分与靶抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与靶抗原结合的抗原结合部分的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。当抗原结合部分具有1μM或更小的KD时，认为抗原结合部分“特异性结合”靶抗原，并且这种相互作用在本文中称为“特异性结合”。因此，根据本发明使用的抗原结合受体(例如CAR)与肿瘤靶抗原特异性结合/相互作用。可以例如通过评定一组抗原结合部分在常规条件下与目标靶抗原的结合来测试所研究的一组构建体的交叉反应性(参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)和Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1999))。这些方法尤其可以包括具有结构和/或功能上紧密相关的结构域的结合研究、阻断和竞争研究。结合研究还包括FACS分析、表面等离子体共振(SPR，例如使用BIAcore)、分析超速离心、等温滴定量热法、荧光各向异性、荧光光谱法或通过放射性同位素标记的配体结合测定。
如本文所用，术语“CDR”涉及本领域众所周知的“互补决定区”。CDR是免疫球蛋白、抗原结合部分和/或抗原结合受体的一部分，其确定所述分子的特异性并与特异性配体接触。CDR是分子中最易变的部分，有助于这些分子的抗原结合多样性。每个V结构域中都有三个CDR区CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H描述可变重链的CDR区，而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH表示可变重链，VL表示可变轻链。可如“Kabat”(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版NIH Publication no.91-3242U.S.Department ofHealth and Human Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917)或“Chothia”(Nature 342(1989),877-883)中所述，确定源自Ig的区域的CDR区。
术语“CD3z”是指T细胞表面糖蛋白CD3ζ链，也称为“T细胞受体T3ζ链”和“CD247”。
术语“嵌合抗原受体”或“嵌合受体”或“CAR”是指由抗原结合部分(例如，scFv或Fab)的细胞外部分组成的抗原结合受体，该抗原结合部分通过间隔序列与(例如CD3z和CD28的)细胞内信号传导结构域融合。
抗体或免疫球蛋白的“类”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“交换型Fab分子”(也称为“crossFab”或“交换型Fab片段”)是指一种Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区被交换，即crossFab片段包含由轻链可变区和重链恒定区组成的肽链，以及由重链可变区和轻链恒定区组成的肽链。为清楚起见，在Fab轻链和Fab重链的可变区被交换的crossFab片段中，包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换型Fab分子的重链。相反地，在Fab轻链和Fab重链的恒定区被交换的crossFab片段中，包含重链可变区的肽链在本文中称为crossFab片段的重链。因此，crossFab片段包含由重链可变区和轻链恒定区组成的重链或轻链(VH-CL)，以及由轻链可变区和重链恒定区组成的重链或轻链(VL-CH1)。与此相比之下，“Fab”或“常规Fab分子”是指处于天然形式的Fab分子，即，包含由重链可变区和恒定区组成的重链(VH-CH1)，以及由轻链可变区和恒定区组成的轻链(VL-CL)。
如本文所用，术语“CSD”是指共刺激信号传导结构域。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实施例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞激活。
如本文所用，术语“工程化、工程化的、工程改造”被认为包括对肽骨架的任何操纵，或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程改造包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，以及允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。
“Fab分子”是指由抗原结合分子的重链(“Fab重链”)的VH和CH1结构域和轻链(“Fab轻链”)的VL和CL结构域组成的蛋白。
本文的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链Fc区的边界可能略有不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸至该重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据“EU编号”***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的Fc结构域的亚基是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，该多肽能够稳定自缔合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”表示由两个“全长抗体重链”和两个“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是在N末端至C末端方向上由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)、抗体重链恒定结构域3(CH3)组成的多肽，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；如果是IgE亚型的抗体，则还可选地由抗体重链恒定结构域4(CH4)组成。优选地，“全长抗体重链”是在N末端至C末端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N末端至C末端方向上由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过CL结构域和CH1结构域之间以及全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键链接在一起。典型全长抗体的实施例是天然抗体，如IgG(例如IgG1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以来自单一物种，例如人，或者它们可以是嵌合抗体或人源化抗体。全长抗体通常包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点均由一对VH和VL形成，二者均特异性结合同一抗原。此外，全长抗体可以包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点均由一对VH和VL形成，其中两个抗原结合位点结合至不同的抗原，例如其中抗体是双特异性的。全长抗体的重链或轻链的C末端表示在所述重链或轻链的C末端的最后一个氨基酸。
“融合”是指组分(例如Fab和跨膜结构域)直接地或经由一个或多个肽接头，通过肽键链接。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可用于产生根据本发明的抗体的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变及/或形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域区域中的任一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，来自互补决定区的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为互补决定区(CDR)，并且这些术语在本文中可互换地用于指形成抗原结合区的可变区部分。该特定区域已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)以及Chothia等人，J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中所述定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，使用这两者中的任一定义来指代抗体的CDR和/或抗原结合受体或其变体应在如本文所定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下表1中列出了包含如上文引用的参考文献中的每一者所定义的CDR的相应氨基酸残基。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表1：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人提出的编号惯例(参见下文)。
2如表1中所用的具有小写字母“b”的“AbM”是指由Oxford Molecular的
“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员可以明确地将该Kabat编号***分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所述的编号***。除非另有说明，否则提及抗原结合部分可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号***。序列表的多肽序列不是根据Kabat编号***编号的。然而，将序列表的序列编号转换为Kabat编号完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。
“分离的核酸”分子或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被视为分离的。分离的多核苷酸的另外的实施例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或处于溶液中的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含在通常包含多核苷酸分子的细胞中，但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“一致”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，其是指除了多核苷酸序列可包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多五个点的突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是一致的。换句话讲，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％一致的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可缺失或被另外的核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸的至多5％的数量的核苷酸可***到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任意位置，或单个地散布在参考序列的残基之中，或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。作为一种实际情况，可以使用已知的计算机程序，诸如下文针对多肽所讨论的程序(例如ALIGN-2)，常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
“分离的多肽”或变体或其衍生物意指不是处于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可以从多肽的天然或自然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是出于本发明的目的而分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是出于本发明的目的而分离的。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列一致性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列一致性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列一致性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作***上使用，所述UNIX操作***包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列一致性％)计算如下：100乘以分数X/Y；其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“核酸分子”涉及由多核苷酸组成的包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基序列，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构。在此，术语核酸分子包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、DNA的合成形式以及包含两个或多个这些分子的混合聚合物。此外，术语核酸分子同时包括有义链和反义链。此外，如本领域技术人员容易理解的，本文所述的核酸分子可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。
如本文所用，“NFAT”是指“激活T细胞的核因子”，并且是在大多数免疫细胞中表达的转录因子家族。NFAT家族转录因子的激活取决于钙信号传导。例如，通过T细胞突触的T细胞激活导致钙流入。增加的细胞内钙水平激活钙敏感性磷酸酶、钙调磷酸酶，其迅速使NFAT蛋白氨基末端的富含丝氨酸区(SRR)和SP重复序列去磷酸化。这导致构象变化，其暴露出促进NFAT核导入和靶基因激活的核定位信号。
如本文所用，“NFAT途径”是指导致NFAT转录因子家族成员活性调制的刺激。NFATDNA元件是本领域已知的，在本文中也称为“NFAT途径的响应元件”。因此，“NFAT途径的受体”是指可以触发NFAT活性调制的受体。“NFAT途径的受体”的实施例是例如T细胞受体和B细胞受体。
如本文所用，“NF-κB”是指“激活的B细胞的核因子κ轻链增强子”，并且是转录因子，其牵涉许多基因调控，所述基因编码细胞凋亡、病毒复制、肿瘤发生、各种自身免疫性疾病和炎症反应的介质。NFκB存在于几乎所有真核细胞中。通常，由于它与抑制性κB(IκB)蛋白形成复合物，因此它以非活性状态位于细胞质中。通过配体与完整膜受体(也称为“NF-κB途径受体”)的结合，IκB激酶(IKK)被激活。IKK是一种酶复合物，由两个激酶和一个调节亚基组成。该复合物使IκB蛋白磷酸化，从而导致这些蛋白泛素化并因此被蛋白酶体降解。最终，游离的NFκB处于活性状态，易位至细胞核并与κB DNA元件结合并诱导靶基因的转录。
如本文所用，“NF-κB途径”是指导致NF-κB活性调制的刺激。例如，通过配体或抗体的结合使Toll样受体信号传导、TNF受体信号传导、T细胞受体和B细胞受体信号传导激活，导致NF-κB激活。随后，磷酸化的NF-κB二聚体与κB DNA元件结合并诱导靶基因的转录。κBDNA元件是本领域已知的，在本文中也称为“NF-κB途径的响应元件”。因此，“NF-κB途径的受体”是指可以触发NF-κB活性调制的受体。“NF-κB途径的受体”的实施例是Toll样受体、TNF受体、T细胞受体和B细胞受体。
如本文所用，“AP-1”是指“激活蛋白1”，并且是涉及许多细胞过程的转录因子，包括分化、增殖和凋亡。AP-1功能取决于有助于AP-1二聚体的特定Fos和Jun亚基。AP-1与回文DNA基序(5’-TGA G/C TCA-3’)结合以调节基因表达。
术语“药物组合物”是指一种制备物，该制备物的形式允许该制备物中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制备物不含对制剂将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。药物组合物通常包含一种或多种药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂，或防腐剂。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性链接的单体(氨基酸)构成的分子。术语多肽是指具有两个或更多个氨基酸的任何链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白、氨基酸链或用于指代具有两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在多肽的定义内，并且术语多肽可以代替这些术语中的任何一者使用，或与这些术语中的任何一者互换地使用。术语多肽还旨在指代多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割，或用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，而不一定从指定的核酸序列翻译而来。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。本发明的多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，但它们不一定具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽被称为折叠的；并且不具有确定的三维结构，而是可以采用大量不同构象的多肽则被称为未折叠的。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(messenger RNA，mRNA)、病毒来源的RNA，或质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中存在的)。术语核酸分子是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。
术语“具有固有荧光的蛋白”是指能够通过蛋白中内部氨基酸的环化和氧化或经由酶促添加荧光辅助因子而形成高效荧光固有发色团的蛋白。术语“具有固有荧光的蛋白”包括野生型荧光蛋白和表现出改变的光谱或物理特性的突变体。该术语不包括仅由于蛋白内未修饰的酪氨酸、色氨酸、组氨酸和苯丙氨酸基团的荧光作用而显示弱荧光的蛋白。具有固有荧光的蛋白是本领域已知的，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP，Heim等人，1994，1996)、一种青色荧光变体，称为CFP(Heim等人1996；Tsien1998)；一种黄色荧光变体，称为YFP(Ormo等人1996；Wachter等人1998)；一种紫色可激发的绿色荧光变体，称为Sapphire(Tsien 1998；Zapata-Hommer等人2003)；一种青色可激发的绿色荧光变体，称为增强绿色荧光蛋白或EGFP(Yang等人1996)，并且可以通过例如活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法测量。
“降低的结合”是指对相应相互作用的亲和力降低，例如通过SPR所测量的。为清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测极限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”是指对相应相互作用的结合亲和力增加。
术语“调节序列”是指对于实现与其连接的编码序列的表达是必需的DNA序列。这些控制序列的性质取决于生物体。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子，并且在某些情况下包括增强子、反式激活子或转录因子。术语“控制序列”旨在至少包括表达所必需的所有组分，并且还可以包括其他有利的组分。
如本文所用，“报告基因”是指其表达可以被测定的基因。在一个优选实施例中，“报告基因”是编码蛋白的基因，该蛋白的产生和检测被用作替代物以间接检测待测抗体或配体的活性。报告蛋白是报告基因编码的蛋白。优选地，报告基因编码其催化活性可以通过简单的测定方法检测的酶或具有诸如固有荧光或发光的性质的蛋白，从而可以在需要极少样品制备工作的简单快速的测定中检测报告基因的表达。可以检测其催化活性的酶的非限制性实施例是荧光素酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶。荧光素酶是一种单体酶，分子量(MW)为61kDa。它充当催化剂，并能够在三磷酸腺苷(ATP)和Mg2+存在下将D-荧光素转化为荧光素腺苷酸。此外，焦磷酸(PPi)和单磷酸腺苷(AMP)也作为副产物生成。然后将中间体荧光素腺苷酸氧化为氧化荧光素、二氧化碳(CO2)和光。氧化荧光素是一种生物发光产物，可以通过反应中释放的光在发光计中进行定量测量。荧光素酶报告基因测定是可商购的并且是本领域已知的，例如，荧光素酶1000测定***和ONE-GloTM荧光素酶测定***。
“响应元件”是指特定转录因子结合元件或顺式作用元件，其可在结合某些转录因子时被激活或沉默。在一个实施例中，响应元件是位于最小启动子(例如，TATA盒启动子)上游的顺式作用增强子元件，其在转录因子结合后驱动报告基因的表达。
如本文所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性链接的氨基酸单体的分子。在某些实施例中，抗原结合部分之一是scFv片段，即，通过肽接头连接的VH结构域和VL结构域。在某些实施例中，抗原结合部分之一是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接以形成单肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施例中，单链Fab分子中Fab轻链的C末端连接至Fab重链的N末端。
如本文所用，术语“SSD”是指刺激信号传导结构域。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或在临床病理学过程中执行的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。
在本发明的背景中，术语“标签”是指附接或嫁接至生物分子例如蛋白，特别是抗原结合分子上的分子。标签的功能是标记或标注“有标签”蛋白(例如免疫球蛋白或其片段)，以使其可以通过能够结合标签但不能结合无标签蛋白的特定抗原结合部分被识别。该术语与“分子标签”同义，并且包含但不限于荧光标签、蛋白标签、亲和标签、增溶标签、色谱标签、表位标签和小分子标签诸如半抗原标签。小分子标签，例如半抗原，可以与生物分子共价或非共价化学偶联，而“蛋白标签”或“多肽标签”是可以遗传移植到蛋白上并随后通过能够结合标签但不能结合无标签蛋白的特定抗原结合部分被识别的肽序列。半抗原标签在附接至载体蛋白时能够引发免疫反应，因此适合于生成能够识别载体例如蛋白上的标签的特定抗原结合部分。在本发明的优选实施例中，标签是半抗原标签或多肽标签。
如本文所用，术语“靶抗原决定簇”与“靶抗原”、“靶表位”和“靶细胞抗原”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如，一段连续的氨基酸或由具有非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗体与该位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中称为抗原的蛋白(例如CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1)可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白，该脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)等哺乳动物。在一个具体实施例中，靶抗原是人蛋白。当提及本文中的特定靶蛋白时，该术语涵盖“全长”、未加工的靶蛋白，以及由靶细胞内加工而产生的任何形式的靶蛋白。该术语还涵盖天然存在的靶蛋白变体，例如剪接变体或等位基因变体。可用作抗原的示例性人靶蛋白包括但不限于：CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1。
抗体可以具有一个、两个、三个或更多个结合结构域，并且可以是单特异性、双特异性或多特异性的。抗体可以是来自单一物种的全长抗体，也可以是嵌合的或人源化的。对于具有两个以上抗原结合结构域的抗体，一些结合结构域可以是相同的和/或具有相同的特异性。
如本文所用，“T细胞激活”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。测量T细胞激活的合适测定是本领域已知的并在本文中描述的。
根据本发明，术语“T细胞受体”或“TCR”是本领域公知的。特别地，在本文中，术语“T细胞受体”是指任何T细胞受体，前提是满足以下三个标准：(i)肿瘤特异性，(ii)(大多数)肿瘤细胞的识别，这意味着抗原或靶标应在(大多数)肿瘤细胞中表达，以及(iii)TCR与治疗对象的HLA类型匹配。在此背景中，满足上述三个标准的合适的T细胞受体是本领域已知的，例如识别NY-ESO-1(关于序列信息，参见例如PCT/GB2005/001924)和/或HER2neu(关于序列信息，参见WO-A12011/0280894)的受体。主要组织相容性复合体(MHC)I类分子将肽从内源性抗原呈递给CD8+细胞毒性T细胞，因此，MHC-肽复合体是免疫疗法的合适靶标。MHC-肽复合体可以被重组T细胞受体(TCR)靶向。然而，大多数TCR的亲和力对于免疫疗法而言可能太低，而具有TCR特异性的高亲和力结合部分将是有益的。为此，可以例如通过生成噬菌体展示文库(例如组合文库)并筛选此类文库来生成具有TCR样特异性的高亲和力可溶性抗体分子。如本文所述的这些具有TCR样特异性的可溶性抗原结合部分，例如scFv或Fab，称为“T细胞受体样抗原结合部分”或“TCRL抗原结合部分”。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所需治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并引导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的抗原结合受体或其片段的多核苷酸序列。
在此背景中，本文提供了用于检测样品中的细胞特别是肿瘤细胞的诊断方法，特别是体外方法。在一个优选实施例中，样品是患者样品，例如源自活检或需要检测异常细胞的体液。本发明的测定将包含抗原结合部分特别是scFv和/或Fab片段的嵌合抗原受体(CAR)的高特异性与报告信号的发光检测灵敏度结合在一起。在本文描述的方法和测定中，靶抗原结合部分介导靶细胞特别是癌细胞与报告细胞特别是T细胞(例如Jurkat细胞)之间的接触。在此背景中，本文所述的方法可用于根据在合适的报告细胞(优选报告T细胞，例如Jurkat细胞)中引入的CAR的结合特异性来检测癌细胞。
因此，在一个实施例中，提供了用于确定样品中肿瘤细胞的存在的诊断性测定法，所述诊断性测定法包括以下步骤：
a)使所述样品与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触，其中所述报告CAR-T细胞包含：
i.能够与所述肿瘤细胞特异性相互作用的CAR，其中所述CAR可操作地偶联至响应元件；
ii.在所述响应元件控制下的报告基因；以及
b)通过测量所述报告基因的表达来测定T细胞的激活以确定所述肿瘤细胞的存在。
进一步提供并用于本发明的是能够表达本文所述的CAR分子的转导T细胞。所转导的T细胞包含在响应元件控制下的报告基因，其中CAR如本文所述可操作地偶联至响应元件。当靶抗原结合部分与靶细胞例如肿瘤细胞结合后，报告CAR-T细胞例如Jurkat细胞被激活并表达报告基因。因此，报告基因的表达指示在通过T细胞与靶细胞例如在肿瘤细胞上的结合而诱导的T细胞激活的背景下CAR的(特异性)结合。
在此背景中，本发明的方法进一步描述并用于能够与肿瘤靶抗原特异性结合的CAR。在一个实施例中，所述CAR包含能够与肿瘤靶抗原特异性结合的靶抗原结合部分。合适的肿瘤靶标的实施例是仅或主要在肿瘤细胞表面表达的蛋白，例如但不限于CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1或其片段。
本发明进一步描述了T细胞，诸如CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD3+T细胞、γδT细胞或自然杀伤(NK)T细胞和永生化细胞系，例如Jurkat细胞的转导和用途，以引入本文所述的报告基因***和本文所述的一个或多个CAR以及由本文所述的CAR介导的它们的靶向募集和激活，所述CAR能够直接结合至靶细胞表面上的靶抗原，例如肿瘤细胞表面上。
因此，本发明提供了一种通用的诊断平台，其中CAR可以用作免疫细胞的特异性指导，特别是其中T细胞通过本文所述的CAR被特异性地靶向肿瘤细胞。在CAR与肿瘤细胞表面上的靶抗原结合后，报告细胞被激活，其中激活可以例如通过读出荧光或发光信号来测量。通过允许使用多种现有或新开发的靶抗原结合部分，该平台具有灵活性和特异性。
能够与靶抗原例如肿瘤抗原特异性结合的抗原结合部分可以通过免疫例如哺乳动物免疫***生成。这样的方法是本领域已知的，并且例如描述于Burns，Methods inMolecular Biology 295:1-12(2005)中。或者，可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离具有所需活性的抗原结合部分。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16:498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于生成噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗原结合部分。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines andImmunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews inBiotechnology 36:276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并进一步描述于例如McCafferty等人，Nature348:552-554中；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)中；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)和Marks和Bradbury，Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编辑，Human Press,Totowa,NJ,2003)中；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)中；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)中；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)中；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review ofImmunology 12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗原结合部分，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗原结合部分的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12:725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal ofMolecular Biology 227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利No.5,750,373；No.7,985,840；No.7,785,903和No.8,679,490以及美国专利出版物No.2005/0079574、No.2007/0117126、No.2007/0237764、No.2007/0292936和No.2009/0002360。本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗原结合部分的组合文库的方法的其他实施例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods in Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf等人，Methods inMolecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology889:73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research25:5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94:4937-4942(1997)中。
在本发明的第一个说明性实施例中，作为概念证明，提供了报告细胞，例如表达能够与靶抗原人CD20特异性结合的CAR的Jurkat细胞的使用。
在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区(CDR)以及SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR。
在一个优选实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含重链可变区，其包含：
(a)YSWIN的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)；
(b)RIFPGDGDTDYNGKFKG的CDR H2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；
(c)NVFDGYWLVY的CDR H3氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；
和轻链可变区，其包含：
(d)RSSKSLLHSNGITYLY的轻链(CDR L)1氨基酸序列(SEQ ID NO:4)；
(e)QMSNLVS的CDR L2氨基酸序列(SEQ ID NO:5)；以及
(f)AQNLELPYT的CDR L3氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，所述轻链可变区包含的氨基酸序列与SEQID NO:10所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQID NO:10所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，至少一个抗原结合部分是scFv、Fab、crossFab或scFab片段。在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含Fab片段。在一个优选实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含Fab片段，所述Fab片段包含SEQ ID NO:8所示的重链和SEQ IDNO:9所示的轻链。
在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的抗原结合部分是包含重链和轻链的Fab片段，所述重链包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成，所述轻链包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个具体实施例中，抗原结合部分是能够与CD20特异性结合的Fab片段，其中抗原结合受体包含重链融合多肽和轻链多肽，所述重链融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ IDNO:7所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，所述轻链多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一个优选实施例中，抗原结合部分是能够与CD20特异性结合的Fab片段，其中抗原结合受体包含重链融合多肽和轻链多肽，所述重链融合多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，能够与CD20特异性结合的CAR包含scFv片段，其是由重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和接头组成的多肽，其中所述可变结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下构型之一：a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施例中，scFv片段具有构型VH-接头-VL。
在本发明的另一个说明性实施例中，作为概念证明，提供了报告细胞，例如表达能够与人癌胚抗原(CEA)特异性结合的CAR的Jurkat细胞的使用。
在一个实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区(CDR)以及SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41所示的轻链CDR。
在一个优选实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含重链可变区，其包含：
(a)EFGMN的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列(SEQ ID NO:36)；
(b)WINTKTGEATYVEEFKG的CDR H2氨基酸序列(SEQ ID NO:37)；
(c)WDFAYYVEAMDY的CDR H3氨基酸序列(SEQ ID NO:38)；和轻链可变区，其包含：
(d)KASAAVGTYVA的轻链(CDR L)1氨基酸序列(SEQ ID NO:39)；
(e)SASYRKR的CDR L2氨基酸序列(SEQ ID NO:40)；以及
(f)HQYYTYPLFT的CDR L3氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。
在一个实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:44所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，所述轻链可变区包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:45所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一个实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，至少一个抗原结合部分是scFv、Fab、crossFab或scFab片段。在一个实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含scFv片段，其是由重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和接头组成的多肽，其中所述可变结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下构型之一：a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施例中，scFv片段具有构型VH-接头-VL。
在一个优选实施例中，能够与CEA特异性结合的CAR包含scFv片段，其包含SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个说明性实施例中，作为概念证明，提供了报告细胞，例如表达能够与肽/MHC复合体特异性结合的CAR的Jurkat细胞的使用，其中肽源自人Wilms肿瘤1(WT1)。
在一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示的重链互补决定区(CDR)以及SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50和SEQ ID NO:51所示的轻链CDR。
在另一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:57所示的重链互补决定区(CDR)以及SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50和SEQ ID NO:58所示的轻链CDR。
在一个优选实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区，其包含：
(a)GGTFSSYAIS的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列(SEQ ID NO:46)；
(b)GIIPIFGTANYAQKFQG的CDR H2氨基酸序列(SEQ ID NO:47)；
(c)CDR H3氨基酸序列，选自由SIELWWGGFDY(SEQ ID NO:48)和GSYDLFSLDY(SEQID NO:57)组成的组；
和轻链可变区，其包含：
(d)RASQSISSWLA的轻链(CDR L)1氨基酸序列(SEQ ID NO:49)；
(e)DASSLES的CDR L2氨基酸序列(SEQ ID NO:50)；以及
(f)CDR L3氨基酸序列，选自由QQYEDYTT(SEQ ID NO:51)和QQYYDGIT(SEQ ID NO:58)组成的组。
在一个特定实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区，其包含：
(g)GGTFSSYAIS的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列(SEQ ID NO:46)；
(h)GIIPIFGTANYAQKFQG的CDR H2氨基酸序列(SEQ ID NO:47)；
(i)SIELWWGGFDY的CDR H3氨基酸序列(SEQ ID NO:48)；
和轻链可变区，其包含：
(j)RASQSISSWLA的轻链(CDR L)1氨基酸序列(SEQ ID NO:49)；
(k)DASSLES的CDR L2氨基酸序列(SEQ ID NO:50)；以及
(l)QQYEDYTT的CDR L3氨基酸序列(SEQ ID NO:51)。
在另一个特定实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区，其包含：
(a)GGTFSSYAIS的重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列(SEQ ID NO:46)；
(b)GIIPIFGTANYAQKFQG的CDR H2氨基酸序列(SEQ ID NO:47)；
(c)GSYDLFSLDY的CDR H3氨基酸序列(SEQ ID NO:57)；
和轻链可变区，其包含：
(d)RASQSISSWLA的轻链(CDR L)1氨基酸序列(SEQ ID NO:49)；
(e)DASSLES的CDR L2氨基酸序列(SEQ ID NO:50)；以及
(f)QQYYDGIT的CDR L3氨基酸序列(SEQ ID NO:58)。
在一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:61组成的组的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，所述轻链可变区包含的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:62组成的组的氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，至少一个抗原结合部分是scFv、Fab、crossFab或scFab片段。
在一个具体实施例中，抗原结合部分是能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的Fab片段，其中抗原结合受体包含重链融合多肽和轻链多肽，所述重链融合多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:52所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，所述轻链多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:54所示氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在一个优选实施例中，抗原结合部分是能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的Fab片段，其中抗原结合受体包含重链融合多肽和轻链多肽，所述重链融合多肽包含SEQ IDNO:52所示的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，能够与WT1肽/MHC复合体特异性结合的CAR包含scFv片段，其是由重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和接头组成的多肽，其中所述可变结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下构型之一：a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施例中，scFv片段具有构型VH-接头-VL。
在一个优选实施例中，能够与WT1肽/MHC特异性结合的CAR包含scFv片段，其包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在一个具体实施例中，能够与WT1肽/MHC特异性结合的CAR包含氨基酸序列，其与以下氨基酸序列至少约有95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性：SEQ ID NO:59。
在一个优选实施例中，能够与WT1肽/MHC特异性结合的CAR包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗原结合部分，诸如本文所述的Fab、crossFab、scFv和scFab片段，可以通过在VH和VL结构域之间引入链间二硫桥来进一步稳定化。因此，在一个实施例中，包含在根据本发明的抗原结合受体中的Fab片段、crossFab片段、scFv片段和/或scFab片段可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键来进一步稳定化。这种稳定化的抗原结合部分在本文中用术语“ds”指代。
如本文所提供和使用的CAR包含细胞外结构域，其包含能够与靶抗原特异性结合的抗原结合部分、锚定跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域和/或至少一个共刺激信号传导结构域。锚定跨膜结构域介导CAR在报告细胞例如Jurkat细胞的细胞膜上的约束。细胞内信号传导和/或至少一个共刺激信号传导结构域将CAR与细胞内信号的结合转移，例如T细胞激活，这可以通过测量报告基因的表达来评定。在本发明的背景中，如本文所述的报告基因的表达指示如本文所述的靶抗原结合部分与靶抗原的结合以及由此导致的T细胞激活。
CAR的锚定跨膜结构域的特征在于不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点。蛋白酶是指能够水解包含蛋白酶切割位点的跨膜结构域的氨基酸序列的蛋白水解酶。术语蛋白酶包括内肽酶和外肽酶。在本发明的背景中，跨膜蛋白的任何锚定跨膜结构域，尤其是通过CD命名法规定的，可用于生成根据本发明的合适的CAR，其在与靶细胞结合后激活T细胞，如本文所述。
因此，在本发明的背景中，锚定跨膜结构域可包含鼠/小鼠或优选人跨膜结构域的一部分。这种锚定跨膜结构域的实施例是CD28的跨膜结构域，例如，其具有如文本中SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码)。在本发明的背景中，CAR的跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码)。
或者，任何具有跨膜结构域的蛋白，如由CD命名法所提供的，可用作本发明提供和使用的CAR的锚定跨膜结构域。如上所述，CAR可以包含CD28的锚定跨膜结构域，其位于人全长CD28蛋白的氨基酸153至179、154至179、155至179、156至179、157至179、158至179、159至179、160至179、161至179、162至179、163至179、164至179、165至179、166至179、167至179、168至179、169至179、170至179、171至179、172至179、173至179、174至179、175至179、176至179、177至179或178至179，如SEQ ID NO:68所示(如由SEQ ID NO:67所示的cDNA编码)。因此，在本发明的背景中，锚定跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQ ID NO:29所示的DNA序列编码)。
如本文所述，根据本发明使用的CAR包含至少一个刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域。刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域将CAR与肿瘤靶抗原的结合转导至报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)中的细胞内信号。因此，CAR优选地包含提供T细胞激活的刺激信号传导结构域。在一个优选实施例中，靶抗原结合部分与靶标的结合导致细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活。在某些实施例中，本文提供的CAR包含刺激信号传导结构域，其是鼠/小鼠或人CD3z(人CD3z的UniProt条目为P20963(版本号177，序列号2)；鼠/小鼠CD3z的UniProt条目为P24161(主要可引用登录号)或Q9D3G3(辅助可引用登录号)，版本号143，序列号1)、Fcgr3A(人FCGR3A的UniProt条目为P08637(版本号178，序列号2))或NKG2D(人NKG2D的UniProt条目为P26718(版本号151，序列号1)；鼠/小鼠NKG2D的UniProt条目为O54709(版本号132，序列号2))的片段/多肽部分。因此，CAR中包含的刺激信号传导结构域可以是全长CD3z、Fcgr3A或NKG2D的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD3z的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:65(鼠/小鼠如由SEQ ID NO:66所示的DNA序列编码)。人全长CD3z的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:63(人如由SEQ ID NO:64所示的DNA序列编码)。根据本发明提供和使用的CAR可以包含CD3z、Fcgr3A或NKG2D的片段作为刺激结构域，前提条件是包括至少一个信号传导结构域。具体地，只要包含至少一个信号传导动机，CD3z、Fcgr3A或NKG2D的任何部分/片段都适合作为刺激结构域。然而，更优选地，CAR包含源自人源的多肽。优选地，CAR包含如本文中示为SEQ ID NO:63(CD3z)的氨基酸序列(人如由SEQ ID NO:64(CD3z)所示的DNA序列编码)。例如，可以包含在CAR中的人CD3z的片段/多肽部分可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQ ID NO:31所示的DNA序列编码)。因此，在一个实施例中，CAR包含SEQ ID NO:16所示的序列或与SEQ ID NO:16相比具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个取代、缺失或***并且其特征在于具有刺激信号传导活性的序列。下文以及实施例和附图中提供了包含刺激信号传导结构域的CAR的特定构型。可以确定刺激信号传导活性；例如，通过ELISA(IL-2、IFNγ、TNFα)测量的细胞因子释放增加，增殖活性增加(通过增加的细胞数测量)，或通过LDH释放测定测量的裂解活性增加。
CAR优选地进一步包含至少一个共刺激信号传导结构域，其为报告CAR-T细胞提供额外的活性。CAR可以包含共刺激信号传导结构域，其是鼠/小鼠或人CD28(人CD28的UniProt条目为P10747(版本号173，序列号1)；鼠/小鼠CD28的UniProt条目为P31041(版本号134，序列号2))、CD137(人CD137的UniProt条目为Q07011(版本号145，序列号1)；鼠/小鼠CD137的UniProt条目为P20334(版本号139，序列号1))、OX40(人OX40的UniProt条目为P23510(版本号138，序列号1)；鼠/小鼠OX40的UniProt条目为P43488(版本号119，序列号1))、ICOS(人ICOS的UniProt条目为Q9Y6W8(版本号126，序列号1)；鼠/小鼠ICOS的UniProt条目为Q9WV40(主要可引用登录号)或Q9JL17(辅助可引用登录号)，版本号102，序列号2)、CD27(人CD27的UniProt条目为P26842(版本号160，序列号2)；鼠/小鼠CD27的UniProt条目为P41272(版本号137，序列号1))、4-1-BB(鼠/小鼠4-1-BB的UniProt条目为P20334(版本号140，序列号1)；人4-1-BB的UniProt条目为Q07011(版本号146，序列号))、DAP10(人DAP10的UniProt条目为Q9UBJ5(版本号25，序列号1)；鼠/小鼠DAP10的UniProt条目为Q9QUJ0(主要可引用登录号)或Q9R1E7(辅助可引用登录号)，版本号101，序列号1)或DAP12(人DAP12的UniProt条目为O43914(版本号146，序列号1)；鼠/小鼠DAP12的UniProt条目为O054885(主要可引用登录号)或Q9R1E7(辅助可引用登录号)，版本号123，序列号1)的片段/多肽部分。在某些实施例中，CAR可包含本文定义的一个或多个，即1、2、3、4、5、6或7个共刺激信号传导结构域。因此，在本发明的背景中，CAR可以包含鼠/小鼠或优选人CD28的片段/多肽部分作为第一共刺激信号传导结构域，并且第二共刺激信号传导结构域选自由鼠/小鼠或优选人CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12或其片段组成的组。优选地，CAR包含源自人源的共刺激信号传导结构域。因此，更优选地，包含在CAR中的共刺激信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQ ID NO:30所示的DNA序列编码)。
因此，CAR中可以可选地包含的共刺激信号传导结构域是全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10和DAP12的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD28的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:70(鼠/小鼠如由SEQ ID NO:69所示的DNA序列编码)。然而，由于在本发明的背景中，人序列是最优选的，CAR蛋白中可以可选地包含的共刺激信号传导结构域是人全长CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10或DAP12的片段/多肽部分。人全长CD28的氨基酸序列在本文中示为SEQ ID NO:68(人如由SEQ ID NO:67所示的DNA序列编码)。
在一个优选实施例中，CAR包含CD28或其片段作为共刺激信号传导结构域。CAR可以包含CD28的片段作为共刺激信号传导结构域，前提条件是包括至少一个CD28的信号传导结构域。具体地，只要包含CD28的至少一种信号传导动机，CD28的任何部分/片段均适用于CAR。例如，包含在CAR中的CD28多肽可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQ ID NO:30所示的DNA序列编码)。在本发明中，充当共刺激信号传导结构域的CD28的细胞内结构域可包含的序列源自具有序列YMNM(SEQ ID NO:71)和/或PYAP(SEQ ID NO:72)的CD28多肽的细胞内结构域。优选地，CAR包含源自人源的多肽。例如，可以包含在CAR中的人CD28的片段/多肽部分可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成(如由SEQID NO:30所示的DNA序列编码)。因此，在一个实施例中，CAR包含SEQ ID NO:15所示的序列或与SEQ ID NO:15相比具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代、缺失或***并且其特征在于具有共刺激信号传导活性的序列。下文以及实施例和附图中提供了包含共刺激信号传导结构域(CSD)的CAR的特定构型。可以确定共刺激信号传导活性；例如，通过ELISA(IL-2、IFNγ、TNFα)测量的细胞因子释放增加，增殖活性增加(通过增加的细胞数测量)，或通过LDH释放测定测量的裂解活性增加。
如上所述，在本发明的一个实施例中，CAR的共刺激信号传导结构域可以源自人CD28基因(Uni Prot条目号：P10747(登录号，条目版本：)173，序列版本1)并提供CD28活性，其定义为本文所述的转导细胞(如转导T细胞)的细胞因子产生、增殖和裂解活性。CD28活性的测量方式可以是ELISA释放细胞因子或细胞因子流式细胞术，诸如干扰素-γ(IFN-γ)或白介素2(IL-2)、T细胞增殖测量例如通过ki67测量、通过流式细胞术进行细胞量化或通过靶细胞实时阻抗测量评定裂解活性(通过使用例如ICELLligence仪器，如在例如Thakur等人，Biosens Bioelectron.35(1)(2012),503-506；Krutzik等人，Methods Mol Biol.699(2011),179-202；Ekkens等人，Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge等人，Proc NatlAcad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell等人，Cell Death Differ.21(12)(2014),1825-1837,勘误表：Cell Death Differ.21(12)(2014),161中所述)。共刺激信号传导结构域PYAP和YMNM对于CD28多肽的功能和上文列举的功能作用是有益的。YMNM结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:71中示出；PYAP结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO:72中示出。因此，在如本文提供和使用的CAR中，CD28多肽优选地包含的序列源自具有序列YMNM(SEQID NO:71)和/或PYAP(SEQ ID NO:72)的CD28多肽的细胞内结构域。这些信号传导动机可以存在于CAR的细胞内结构域内的任何位点。
包含至少一个能够与靶抗原或修饰的识别结构域特异性结合的抗原结合部分的细胞外结构域、不具有哺乳动物蛋白酶切割位点的锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可以包含在单链多功能多肽中。单链融合构建体例如可由一种或多种多肽组成，所述一种或多种多肽包含一个或多个细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个抗原结合部分、一个或多个锚定跨膜结构域、一个或多个共刺激信号传导结构域和/或一个或多个刺激信号传导结构域。在替代实施例中，CAR包含不是单链融合构建体的抗原结合部分，即，抗原结合部分是Fab或crossFab片段。在此类实施例中，CAR不是仅包含一条多肽链的单链融合构建体。优选地，此类构建体将包含与免疫球蛋白轻链结合的单链重链融合多肽，例如，所述重链融合多肽包含一个或多个免疫球蛋白重链、一个或多个锚定跨膜结构域、一个或多个共刺激信号传导结构域和/或一个或多个刺激信号传导结构域，并与免疫球蛋白轻链结合。因此，细胞外结构域、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可通过一个或多个相同或不同的肽接头连接。例如，包含至少一个能够与识别结构域特异性结合的抗原结合部分的细胞外结构域与锚定跨膜结构域之间的接头可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由其组成。因此，锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或刺激信号传导结构域可通过肽接头或替代地通过结构域的直接融合而彼此连接。
在一些实施例中，包含在细胞外结构域中的抗原结合部分是单链可变片段(scFv)，其是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或反之亦然。例如，接头可以具有SEQ IDNO:19所示的氨基和氨基酸序列。尽管去除了恒定区并引入了接头，但scFv抗原结合部分保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96中。
CAR或其部分可以包含信号肽。此类信号肽会将蛋白带到T细胞膜的表面。例如，信号肽可以具有SEQ ID NO:73所示的氨基和氨基酸序列(如由SEQ ID NO:74所示的DNA序列编码)。
CAR的组分可以以多种构型彼此融合以生成激活T细胞的CAR。在一些实施例中，CAR包含由连接至锚定跨膜结构域的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成的细胞外结构域。在一些实施例中，VH结构域可选地通过肽接头在C末端与VL结构域的N末端融合。在其他实施例中，CAR进一步包含刺激信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一个特定的此类实施例中，CAR基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域以及可选地由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。可选地，CAR进一步包含共刺激信号传导结构域。在一个此类特定实施例中，抗原结合受体基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域、以及由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域和共刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合，其中刺激信号传导结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合。在一个替代实施例中，共刺激信号传导结构域连接至锚定跨膜结构域而不是刺激信号传导结构域。在一个优选实施例中，CAR基本上由VH结构域和VL结构域、锚定跨膜结构域、以及由一个或多个肽接头连接的共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域组成，其中VH结构域在C末端与VL结构域的N末端融合，而VL结构域在C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合，其中共刺激信号传导结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。
在优选实施例中，结合部分之一是Fab片段或crossFab片段。在一个优选实施例中，抗原结合部分可选地通过肽接头在Fab或crossFab重链的C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合。在一个替代实施例中，抗原结合部分可选地通过肽接头在Fab或crossFab轻链的C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合。在其他实施例中，CAR进一步包含刺激信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一个特定的此类实施例中，CAR基本上由Fab或crossFab片段、锚定跨膜结构域以及可选地由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域组成，其中Fab或crossFab片段在重链或轻链的C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。优选地，CAR进一步包含共刺激信号传导结构域。在一个此类实施例中，CAR基本上由Fab或crossFab片段、锚定跨膜结构域以及由一个或多个肽接头连接的刺激信号传导结构域和共刺激信号传导结构域组成，其中Fab或crossFab片段在重链或轻链的C末端与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中刺激信号传导结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合。在一个优选实施例中，共刺激信号传导结构域连接至锚定跨膜结构域而不是刺激信号传导结构域。在一个最优选实施例中，CAR基本上由Fab或crossFab片段、锚定跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域组成，其中Fab或crossFab片段在重链的C末端通过肽接头与锚定跨膜结构域的N末端融合，其中锚定跨膜结构域在C末端与共刺激信号传导结构域的N末端融合，其中共刺激信号传导结构域在C末端与刺激信号传导结构域的N末端融合。
抗原结合部分、锚定跨膜结构域、刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域可以直接或通过一个或多个肽接头彼此融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常为约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知的并在本文中描述的。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常是1至10之间的数字，通常是2至4之间。用于连接抗原结合部分和锚定跨膜部分的优选肽接头是根据SEQ ID NO 20的GGGGS(G4S)。适用于连接可变重链(VH)和可变轻链(VL)的示例性肽接头是根据SEQ ID NO 19的GGGSGGGSGGGSGGGS(G4S)4。
另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在抗原结合部分与锚定跨膜结构域的N末端融合的情况下，可以在具有或没有另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其一部分进行融合。
如本文所述，根据本发明提供和使用的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域包含至少一个抗原结合部分。具有单个抗原结合部分的CAR是有用的并且是优选的，特别是在需要CAR的高表达的情况下。在这种情况下，一个以上抗原结合部分的存在可能会限制CAR的表达效率。然而，在其他情况下，具有包含两个或更多个抗原结合部分的CAR将是有利的，例如为优化靶向靶位点或允许靶细胞抗原交联。
在根据本发明的方法的背景中，使报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)与在表面上包含靶抗原的靶细胞(例如肿瘤细胞)接触导致如本文所述的报告基因的表达。因此，在一个实施例中，如本文所述的细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活导致如本文所述的响应元件的激活。在一个优选实施例中，响应元件的激活控制报告基因的表达。在一个优选实施例中，响应元件的激活导致报告基因的表达。因此，当靶抗原结合部分与靶标结合时，报告细胞中的报告基因被表达。在一个实施例中，报告基因的表达指示靶抗原结合部分与靶抗原的结合。在此背景中，CAR与其靶标的结合引发细胞响应，其直接或通过级联细胞信号传导导致响应元件活性的调制。响应元件是可以被转录因子等沉默或激活的DNA元件。响应元件是本领域已知的并且是可商购的，例如在报告基因载体中。通常，响应元件包括DNA重复元件，并且是位于最小启动子上游的顺式作用增强子元件，其在转录因子结合后驱动报告基因的表达。
CAR与靶抗原的结合激活响应元件。在一个实施例中，响应元件是位于细胞核中的核响应元件。在另一个实施例中，所述响应元件位于报告细胞中的质粒上。在一个实施例中，测定包括用表达载体转染报告细胞例如Jurkat细胞的初步步骤，该表达载体包含在响应元件的控制下编码报告基因的DNA序列。另外，可以用包含编码CAR的DNA序列的表达载体转染报告细胞。报告细胞可以用包含信号传导级联的所有元件的表达载体或分别表达不同组分的不同载体转染。在一个实施例中，报告细胞包含在响应元件的控制下编码报告基因的DNA序列和编码CAR的DNA序列。
因此，如本文所述，CAR在功能上链接至响应元件。在一个实施例中，响应元件控制报告基因的表达。在一个实施例中，所述响应元件是NFAT途径、NF-κB途径或AP-1途径，优选地是NFAT途径的一部分。
在一个实施例中，报告基因选自编码荧光蛋白的基因或编码可以检测其催化活性的酶的基因。在一个实施例中，所述报告基因编码发光蛋白。在更多实施例中，荧光蛋白选自由以下组成的组：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP，Heim等人，1994，1996)、一种青色荧光变体，称为CFP(Heim等人1996；Tsien1998)；一种黄色荧光变体，称为YFP(Ormo等人1996；Wachter等人1998)；一种紫色可激发的绿色荧光变体，称为Sapphire(Tsien1998；Zapata-Hommer等人2003)；一种青色可激发的绿色荧光变体，称为增强绿色荧光蛋白或EGFP(Yang等人1996)增强绿色荧光蛋白(EGFP)，并且可以通过例如活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法测量。在一个实施例中，可以检测其催化活性的酶选自由荧光素酶、β半乳糖苷酶和碱性磷酸酶组成的组。在一个实施例中，报告基因编码GFP。在一个优选实施例中，报告基因编码荧光素酶。荧光素酶的活性可以通过可商购的测定来检测，例如通过荧光素酶1000测定***ONE-GloTM荧光素酶测定***(均为Promega)。荧光素酶1000测定***除含有荧光素外，还包含辅酶A(CoA)作为底物，从而产生持续至少一分钟的强光强度。为了测定细胞内荧光素酶，有必要在检测之前裂解细胞。发光计从整个可见光谱中采集作为反应副产物产生的光。在本文所示的实施例中，信号与产生的荧光素酶的量成比例，因此与NFAT启动子的激活强度成比例。在另一个实施例中，使用荧光素酶测定，其中荧光素酶从细胞分泌。因此，可以在不裂解细胞的情况下进行测定。
如本文所述，报告基因的表达可以与靶抗原结合部分和靶细胞的结合以及报告CAR-T细胞例如转导的Jurkat细胞的激活直接相关。例如，当使用编码荧光素酶的基因作为报告基因时，从细胞中检测到的光量与靶抗原结合直接相关，并且在与适当的对照情况相比时指示靶抗原结合。
在一个实施例中，靶抗原是细胞表面抗原和/或受体。在一个实施例中，靶抗原选自由CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1或其片段组成的组。然而，靶抗原不限于位于细胞表面上的蛋白，还可源自暂时或永久位于细胞内的多肽或蛋白。在这种情况下，源自细胞内多肽或蛋白的靶抗原可以通过主要组织相容性复合体(MHC)的一个或几个分子呈递在细胞表面。确实，当前可用的诊断性测定法通常限于呈递在细胞表面的蛋白，然而，由MHC复合体呈递的肽仍然是具有挑战性的靶标。本发明的诊断性测定法的一个特别的优点是可以高灵敏度地特异性检测肽/MHC复合体。因此，在一个实施例中，靶抗原是与MHC的分子结合的肽。在一个实施例中，MHC是人MHC。在一个实施例中，与MHC分子结合的肽的总长度为8至100个氨基酸，优选为8至30个氨基酸，更优选为8至16个氨基酸。在一个实施例中，靶抗原源自仅或主要表达在肿瘤组织中的蛋白。在一个实施例中，蛋白是细胞内蛋白，并且肽由MHC-I或MHC-II途径生成并由I类MHC或II类MHC复合体呈递。在一个实施例中，肽由MHC-I途径生成并由I类MHC复合体呈递。在一个实施例中，所述靶抗原结合部分是T细胞受体样(TCRL)抗原结合部分。TCRL抗原结合部分能够与仅或主要在肿瘤组织中表达的肽抗原特异性结合，其中肽抗原与位于靶细胞特别是癌细胞表面上的MHC分子结合。在此背景中，本发明的方法适合于使用已确立的或新的TCRL靶抗原结合部分，基于靶细胞表面上特异性肽/MHC复合体的存在来检测靶细胞，例如肿瘤细胞的存在。
CAR与靶抗原的结合可以定性或定性地确定，即通过报告基因表达的存在与否；不存在任何荧光或发光指示无结合。为了定量测量结合和激活，可以将报告基因激活的量与参照进行比较。因此，本文所述的诊断性测定法可另外包括将报告基因的表达水平与参照进行比较的步骤。合适的参照通常包括阴性对照，其与省略测定或方法的一种或几种基本成分的参考测定基本上相同。对于本发明的方法，所省略的成分可以是，例如，省略不表达靶抗原的细胞的靶细胞内含物。或者，可以使用不能与靶细胞和/或抗原结合分子的识别结构域结合的报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，参照是在靶细胞不存在的情况下报告基因的表达。在另一个实施例中，参照是在不表达能够与靶细胞特异性结合的CAR的Jurkat细胞存在的情况下报告基因的表达。在特定实施例中，报告基因的表达比报告基因在参照存在的情况下的表达高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍或10000倍。
或者，报告基因表达的不存在可以由某个阈值定义，即在扣除背景信号之后。背景信号通常通过在靶抗原不存在的情况下用所有试剂进行测定来确定。如果在靶抗原存在的情况下报告基因的表达水平相对于在靶抗原不存在的情况下报告基因的表达水平高于预定阈值，则给出来自根据本发明诊断性测定法的阳性信号。在特定实施例中，阈值是2、3、4、5、10、100、1000或10000。
如本文所述的新的诊断性测定法是稳健的，适合于以高通量形式使用，并且就完成测定所需的动手时间而言是有效率的。此外，本发明的诊断性测定法可耐受待分析样品中死细胞的存在。这与细胞测定相反，其中通过测量细胞活力或细胞死亡来确定抗原结合分子的结合和功能。
本文所述的诊断性测定法的一个进一步的优点是不需要洗涤步骤。可以按顺序或同时将报告细胞和/或要测试的抗原结合分子添加至靶细胞，例如肿瘤细胞。在一个实施例中，将报告CAR-T细胞和肿瘤样品以合适的细胞培养形式例如在24孔板的孔中或在96孔板的孔中添加至细胞培养基。优选地，测试培养基是为细胞提供长达48小时存活条件的培养基。在一个实施例中，诊断性测定法在微量滴定板中进行。在一个实施例中，微量滴定板适合于高通量筛选。本发明的诊断性测定法可以以任何允许快速制备、处理和分析多个反应的形式进行。例如，这可以是在多孔测定板中(例如24孔、96孔或384孔)。各种试剂的储备溶液可以手动或自动制备，所有后续的移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读出、数据收集和分析均可使用可商购的分析软件、机器人技术和能够检测荧光和/或发光信号的检测仪器自动完成。
在一个实施例中，在步骤c)中24孔板的每孔提供约100000至约1000000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个优选实施例中，在步骤c)中24孔板的每孔提供约300000至约700000个细胞或约400000至约600000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中24孔板的每孔提供约500000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中96孔板的每孔提供约10000至约100000个报告CAR-T(例如Jurkat细胞)。在一个优选实施例中，在步骤c)中96孔板的每孔提供约30000至约70000个报告CAR-T细胞或约40000至约60000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中96孔板的每孔提供约50000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中384孔板的每孔提供约3000至约30000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个优选实施例中，在步骤c)中384孔板的每孔提供约5000至约15000个细胞或约8000至约12000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中384孔板的每孔提供约10000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中每ml细胞培养基提供约200000至约2000000个报告CAR-T(例如Jurkat细胞)。在一个优选实施例中，在步骤c)中每ml细胞培养基提供约600000至约1400000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)或约800000至约1200000个报告CAR-T细胞(例如Jurkat细胞)。在一个实施例中，在步骤c)中每ml细胞培养基提供约1000000个报告CAR-T(例如Jurkat细胞)。
还提供了能够表达如本文所述的CAR的转导的T细胞，即报告CAR-T细胞(例如转导的Jurkat细胞)及其在根据本发明的诊断性测定法中的使用。CAR涉及的分子天然不包含在T细胞中和/或表面上并且在正常(非转导)T细胞中或上(内源性)表达。因此，在T细胞中和/或上如本文使用的CAR是人工引入到T细胞中。人工引入并随后在T细胞(例如报告CAR-T细胞)中和/或表面上呈递的CAR分子包含结构域，所述结构域包含一个或多个可在抗原上(体外或体内)接近的抗原结合部分。在此背景中，这些人工引入的分子在转导后呈递于所述T细胞中和/或表面上，如下文所述。因此，在转导后，根据本发明的T细胞可以被靶抗原激活。
本文还提供了表达CAR的转导的T细胞(例如Jurkat细胞)，所述CAR由如本文所述的编码CAR的核酸分子编码。因此，在本发明的背景中，转导的细胞可以包含编码本文提供和使用的CAR的核酸分子。
在本发明的背景中，术语“转导的T细胞”(例如，转导的Jurkat细胞)涉及基因修饰的T细胞(即其中故意引入了核酸分子的T细胞)。具体地，可以通过使用逆转录病毒或慢病毒转导将编码本文所述的CAR的核酸分子稳定地整合到T细胞的基因组中。CAR的细胞外结构域可包含本文所述的抗原结合部分的完整细胞外结构域，但也可包含其一部分。所需的最小大小是CAR中抗原结合部分的抗原结合位点。CAR的细胞外部分(即包含抗原结合部分的细胞外结构域)能够在细胞表面上检测到，而细胞内部分(即一个或多个共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域)不能在细胞表面上检测到。CAR的细胞外结构域的检测可以通过使用与该细胞外结构域特异性结合的抗体或细胞外结构域能够结合的靶抗原来进行。可以使用这些抗体或抗原通过流式细胞术或显微镜检术检测细胞外结构域。
转导的细胞可以是任何免疫细胞。这些包括但不限于B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤(NK)T细胞、γδT细胞、先天淋巴样细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或中性粒细胞及其永生化细胞系(例如Jurkat细胞)。优选地，所述免疫细胞是淋巴细胞，优选地是NK或T细胞。所述T细胞包括CD4 T细胞和CD8 T细胞。在白细胞表面上触发CAR会使细胞对靶细胞有反应，与细胞起源于何处无关。激活将发生，与为CAR选择的刺激信号传导结构域或共刺激信号传导结构域无关，并且不依赖于其他细胞因子的外源供应。
转导的细胞可与其他核酸分子例如与编码如本文所述的响应元件的核酸分子共转导。
转导的细胞优选在其自然环境之外的受控条件下生长。具体地，术语“培养”是指细胞(例如转导的细胞)在体外。培养细胞是一种使与其原始组织来源分开的细胞保持活力的实验室技术。在本文中，在允许引入的基因于所述转导细胞中或上表达的条件下培养根据本发明使用的转导的细胞。允许转基因表达的条件是本领域公知的。
本文还提供了编码根据本发明使用的一种或几种CAR的核酸和载体。核酸分子可以在调节序列的控制下。例如，可以使用允许诱导CAR表达的启动子、转录增强子和/或序列。在本发明的背景中，核酸分子在组成型或诱导型启动子的控制下表达。适合的启动子是例如CMV启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、UBC启动子(Qin等人，PLoS One5(5)(2010),e10611)、PGK(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、EF1A启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、CAGG启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、SV40启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、COPIA启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、ACT5C启动子(Qin等人，PLoS One 5(5)(2010),e10611)、TRE启动子(Qin等人，PLoS One.5(5)(2010),e10611)、Oct3/4启动子(Chang等人，Molecular Therapy 9(2004),S367–S367(doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904))或Nanog启动子(Wu等人，Cell Res.15(5)(2005),317-24)。本文中，术语“载体”涉及可以在已导入其的细胞中(即在转导的细胞中)自主复制的环状或线性核酸分子。许多合适的载体是分子生物学领域技术人员已知的，其选择取决于所需的功能，包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因工程中常规使用的其他载体。本领域技术人员公知的方法可以用于构建各种质粒和载体；参见，例如，Sambrook等人(引自上文)和Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。或者，可以将多核苷酸和载体重构为脂质体，以递送至靶细胞。相关序列可以转移到需要特定多肽表达的表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。载体可以是多顺反子。这样的调节序列(控制元件)是技术人员已知的，并且可以包括用于将***序列引入载体的启动子、剪接盒、翻译起始密码子以及翻译和***位点。在本发明的背景中，所述核酸分子与所述表达控制序列可操作地链接，以允许在真核或原核细胞中表达。设想所述载体是表达载体，其包含编码如本文定义的CAR的核酸分子。可操作地链接是指并置，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。可操作地链接至编码序列的控制序列被连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况下，对于技术人员显而易见的是，优选使用双链核酸。
在本发明的背景中，所述载体是表达载体。表达载体是可用于转化所选细胞并提供编码序列在所选细胞中表达的构建体。一个或多个表达载体可以是例如克隆一个或多个载体、一个或多个二进制载体或一个或多个整合载体。表达包括优选地将核酸分子转录成可翻译的mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调控元件是本领域技术人员公知的。在真核细胞的情况下，它们通常包含确保转录起始的启动子并且可选地包含确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如，大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实施例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，此类调控元件还可以在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所使用的表达***，可以将编码能够把多肽引导至细胞区室或将其分泌至培养基中的信号肽的前导序列添加至所述核酸序列的编码序列中，这在本领域中是公知的，另参见例如所附实施例。
前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，优选地，前导序列能够将翻译的蛋白或其部分的分泌引导到周质空间或细胞外介质中。任选地，异源序列可以编码包含N末端识别肽的CAR，该N末端识别肽赋予所需特征，例如稳定或简化纯化表达的重组产物。在此背景中，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Raum等人，Cancer Immunol Immunother 50(2001),141-150)或pSPORT1(GIBCOBRL)。
引入T细胞或其前体细胞中的所述核酸分子或载体可以整合到细胞的基因组中，或者可以在染色体外进行维持。
示例性实施例
1.一种用于确定样品中肿瘤细胞的存在的诊断性测定法，所述诊断性测定法包括以下步骤：
a)使所述样品与表达报告T(CAR-T)细胞的嵌合抗原受体(CAR)接触，其中所述报告CAR-T细胞包含：
i.能够与所述肿瘤细胞特异性结合的CAR，其中所述CAR可操作地偶联至响应元件；
ii.在所述响应元件控制下的报告基因；以及
b)通过测量所述报告基因的表达来测定T细胞的激活以确定所述肿瘤细胞的存在。
2.根据实施例1或2所述的诊断性测定法，其中所述CAR包含能够与肿瘤靶抗原特异性结合的靶抗原结合部分。
3.根据实施例2所述的诊断性测定法，其中所述肿瘤靶抗原是细胞表面抗原和/或受体。
4.根据实施例2或3所述的诊断性测定法，其中所述肿瘤靶抗原选自由CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1或其片段组成的组。
5.根据实施例2至4中任一个所述的诊断性测定法，其中所述肿瘤靶抗原是与人类主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。
6.根据实施例2至5中任一个所述的诊断性测定法，其中所述靶抗原结合部分是T细胞受体样(TCRL)抗原结合部分。
7.根据实施例2至6中任一个所述的诊断性测定法，其中所述靶抗原结合部分是Fab片段。
8.根据实施例1至7中任一个所述的诊断性测定法，其中所述报告CAR-T细胞是Jurkat细胞。
9.根据实施例1至8中任一个所述的诊断性测定法，其中所述CAR包含至少一个细胞内刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域。
10.根据实施例9所述的诊断性测定法，其中所述靶抗原结合部分与所诉靶抗原的结合导致所述细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活。
11.根据实施例9或10所述的诊断性测定法，其中所述细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活导致所述响应元件的激活。
12.根据实施例1至11中任一个所述的诊断性测定法，其中所述响应元件控制所述报告基因的表达。
13.根据实施例1至12中任一个所述的诊断性测定法，其中所述响应元件的激活导致所述报告基因的表达。
14.根据实施例1至13中任一个所述的诊断性测定法，其中所述响应元件是NFAT途径、NF-κB途径或AP-1途径的一部分。
15.根据实施例1至14中任一个所述的诊断性测定法，其中所述报告基因编码发光蛋白。
16.根据实施例1至15中任一个所述的诊断性测定法，其中所述报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。
17.根据实施例1至16中任一个所述的诊断性测定法，其中所述样品是源自患有疾病的个体的患者样品，特别是其中疾病是癌症。
18.根据实施例1至17中任一个所述的诊断性测定法，其另外包括以下步骤：
c)将所述报告基因的表达与参照进行比较。
19.根据实施例18所述的诊断性测定法，其中所述参照是所述报告基因在参照样品存在的情况下的表达，其中所述参照样品不包含所述肿瘤细胞。
20.根据实施例19所述的诊断性测定法，其中所述报告基因在所述患者样品存在的情况下的表达比所述报告基因在所述参照样品存在的情况下的表达高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍或10000倍。
21.根据实施例1至20中任一个所述的诊断性测定法，其中所述样品是患者样品。
22.根据实施例21所述的诊断性测定法，其另外包括以下步骤：
d)如果所述报告基因在所述患者样品存在的情况下的表达相对于所述报告基因在所述参照存在下的表达高于预定阈值，则确定肿瘤细胞的存在。
23.根据实施例22所述的诊断性测定法，其中所述参照是所述报告基因在所述参照样品存在的情况下的表达，其中所述参照样品不包含所述肿瘤细胞。
24.根据实施例22或23所述的诊断性测定法，其中阈值是2、3、4、5、10、100、1000或10000。
25.根据实施例1至24中任一个所述的诊断性测定法，其中所述患者是哺乳动物，特别是其中所述患者是人。
26.根据实施例1至25中任一个所述的诊断性测定法，用于诊断癌症。
27.一种用于监测抗肿瘤治疗疗效的方法，包括提供来自接受过抗肿瘤治疗的受试者的样品，并使用实施例1至25中任一个所述的诊断性测定法确定肿瘤细胞的存在。
28.一种预测抗肿瘤CAR-T细胞治疗疗效的方法，包括提供来自患有肿瘤的受试者的样品，以及根据实施例1至25中任一个所述的诊断性测定法，通过测量所述报告基因的表达来确定T细胞激活，其中所述报告基因的激活指示所述抗肿瘤CAR-T细胞治疗在应用于所述受试者时的疗效。
29.如上文参考任何实施例或任何附图所描述的诊断性测定法和方法。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。
蛋白纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mMNaCl pH 6.0中将聚集的蛋白与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPOREAmicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的一部分以例如通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱法(SEC)来进行后续的蛋白分析和分析特征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure GDA0002907774350000511
预制凝胶***(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％
Figure GDA0002907774350000512
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure GDA0002907774350000513
MES(还原凝胶，具有
Figure GDA0002907774350000514
抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(SEC)。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC***上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
抗体产生
通过使用聚乙烯亚胺将HEK293-EBNA细胞与哺乳动物表达载体共转染来产生相应的抗体。用相应的重链和轻链表达载体以1:1的比例转染细胞。
Jurkat NFAT CAR-T细胞的慢病毒转导
为了产生慢病毒载体，将用于正确组装CAR的各个DNA序列在组成型活性人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)下框内克隆在慢病毒多核苷酸载体中。逆转录病毒载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后的调控元件(WPRE)、中央多嘌呤束(cPPT)元件、pUC复制起点和在细菌中为了可促进繁殖和选择的抗生素抗性编码的基因。
为了产生功能性病毒颗粒，使用60-70％汇合Hek293T细胞(ATCC CRL3216)和含有CAR的载体以及3:1:1:1比例的pCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV转移载体进行基于Lipofectamine LTXTM的转染。48小时后，收集上清液，以250g离心5分钟以除去细胞碎片，并通过0.45μm或0.22μm的聚醚砜过滤器过滤。使用浓缩的病毒颗粒(Lenti-x-Concentrator,Takara)转导Jurkat NFAT细胞(Signosis)。使用FACS-ARIA分选仪(BD Bioscience)将阳性转导的细胞分选为细胞群或单个克隆。细胞扩增至适当密度后，将Jurkat NFAT报告CAR-T细胞用于实验。
实施例1
本文描述了使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞以及表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞的经过分选的单个克隆作为靶细胞的Jurkat NFAT T细胞报告基因测定(图4)。作为阳性对照，将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,CAT-No.655185)的某些孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μg/ml CD3抗体(来自
Figure GDA0002907774350000521
)包被，在4℃下过夜或在37℃下持续至少1小时。用PBS将CD3抗体包被的孔洗涤两次，在最后的洗涤步骤之后将PBS完全去除。使用Cedex HiRes对经过工程化以表达抗原结合受体抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT野生型细胞或JurkatNFAT CAR细胞(进一步称为报告细胞)进行计数并检查其活力。将细胞数调节至每ml1x106个活细胞。因此，将合适的细胞悬液等分试样在室温(RT)下以210g沉淀5分钟，然后重悬于新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中。同样对表达目标抗原的靶细胞进行计数并检查其活力。在生长培养基中将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。将靶细胞和报告细胞按10:1、5:1、2:1或1:1E:T比(每孔总共110.000个细胞)一式三份铺板于96孔悬浮培养板(Greiner-bio one)中，最终体积为200μl。之后，将96孔板以190g在RT下离心2分钟，并用
Figure GDA0002907774350000531
密封。
在37℃和5％CO2下，在潮湿气氛中孵育20小时后，使用多通道移液器向上和向下移液10次，混合各孔的内容物。将100μl细胞悬液转移至新的白色透明底部96孔板(Greiner-bio-one)中，并添加100μl ONE-GloTM荧光素酶测定(Promega)。在黑暗中于300rpm的旋转振荡器上孵育15分钟后，使用
Figure GDA0002907774350000532
Spark10M读板器以1秒/孔的检测时间测量RT发光。
柱状图示出表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞的激活，取决于不同的E:T比并且取决于和靶细胞共培养的时间。示出Jurkat NFAT T细胞的激活取决于和靶细胞共培养的持续时间并且取决于E:T比。对于所有测试条件，20小时的孵育时间显示出最高的发光信号。此外，在不同的E:T比中，10:1的E:T比示出可检测的最高发光信号。Jurkat NFAT野生型T细胞仅示出发光信号时间依赖性的增强，其中40小时后可检测到最高的发光信号。检测到的发光信号与E:T比无关，并且通常也明显低于在各个时间点针对表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞检测到的每个发光信号。通常，如果将细胞在CD3抗体包被的孔中孵育，可检测到最高的发光信号。与未转导的Jurkat NFAT对照T细胞相比，表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFATT细胞显示出更高的信号。每个点代表两次技术重复的平均值。
实施例2
本文描述了使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞以及表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFATT细胞的经过分选的细胞群作为靶细胞的Jurkat NFAT T细胞报告基因测定(图5)。作为阳性对照，将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,CAT-No.655185)的孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μg/ml CD3抗体(来自
Figure GDA0002907774350000541
)包被，在4℃下过夜。用PBS将CD3抗体包被的孔洗涤两次，在最后的洗涤步骤之后将PBS完全去除。使用Cedex HiRes对经过工程化以表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT野生型细胞或Jurkat NFAT T细胞(进一步称为报告细胞)进行计数并检查其活力。将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。因此，将合适的细胞悬液等分试样在室温(RT)下以210g沉淀5分钟，然后重悬于新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中。同样对表达目标抗原的靶细胞进行计数并检查其活力。在生长培养基中将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。将靶细胞和报告细胞按5:1E:T比(每孔总共110.000个细胞)一式三份铺板于96孔悬浮培养板(Greiner-bio one)中，最终体积为200μl。之后，将96孔板以190g在RT下离心2分钟，并用
Figure GDA0002907774350000542
密封。
在37℃和5％CO2下，在潮湿气氛中孵育20小时后，使用多通道移液器向上和向下移液10次，混合各孔的内容物。将100μl细胞悬液转移至新的白色透明底部96孔板(Greiner-bio-one)中，并添加100μl ONE-GloTM荧光素酶测定(Promega)。在黑暗中于300rpm的旋转振荡器上孵育15分钟后，使用
Figure GDA0002907774350000543
Spark10M读板器以1秒/孔的检测时间测量RT发光。
柱状图示出表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞和表达抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞在与靶细胞共培养后的激活。如果表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞或Jurkat NFAT对照T细胞在没有靶细胞的情况下培养，则未检测到发光信号。当表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞或Jurkat NFAT对照T细胞在CD3抗体包被的板中与靶细胞共培养时，检测到最高的发光信号。出人意料地，crossFab形式与CD3介导的信号传导一起导致Jurkat NFAT T细胞的强烈激活。每个点代表三次技术重复的平均值。标准偏差由误差条指示。
实施例3
本文描述了使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞以及表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞的经过分选的细胞群作为靶细胞进行的Jurkat NFAT T细胞报告基因测定(图6)。
作为阳性对照，将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,CAT-No.655185)的孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μg/ml CD3抗体(来自
Figure GDA0002907774350000553
)包被，在4℃下过夜或在37℃下持续至少1小时。用PBS将CD3抗体包被的孔洗涤两次，在最后的洗涤步骤之后将PBS完全去除。使用Cedex HiRes对经过工程化以表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT野生型T细胞或Jurkat NFAT T细胞(进一步称为报告细胞)进行计数并检查其活力。将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。因此，将合适的细胞悬液等分试样在室温(RT)下以210g沉淀5分钟，然后重悬于新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中。同样对表达目标抗原的靶细胞进行计数并检查其活力。在生长培养基中将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。将靶细胞和报告细胞按10:1、5:1、2:1或1:1E:T比(每孔总共110.000个细胞)一式三份铺板于96孔悬浮培养板(Greiner-bio one)中，最终体积为200μl。之后，将96孔板以190g在RT下离心2分钟，并用
Figure GDA0002907774350000551
密封。
在37℃和5％CO2下，在潮湿气氛中孵育20小时后，使用多通道移液器向上和向下移液10次，混合各孔的内容物。将100μl细胞悬液转移至新的白色透明底部96孔板(Greiner-bio-one)中，并添加100μl ONE-GloTM荧光素酶测定(Promega)。在黑暗中于300rpm的旋转振荡器上孵育15分钟后，使用
Figure GDA0002907774350000552
Spark10M读板器以1秒/孔的检测时间测量RT发光。
柱状图示出表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞在不同的E:T比下与SUDHL4靶细胞共培养20小时后的激活。在不同的E:T比中，10:1和5:1的E:T比示出最高发光信号(图6黑色条)。同样，在CD3抗体包被的孔中以10:1的E:T比共培养的表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞示出与没有CD3刺激的相同条件相当的高发光信号。
进一步的Jurkat NFAT野生型细胞未示出与不同E:T比无关的任何激活，但如果以10:1的E:T在CD3抗体包被的孔中共培养，则可检测到清晰的发光信号，证明了它们的功能。
进一步的对照实验表明，靶细胞或仅表达抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的T细胞以及带有靶细胞的CD3抗体包被的孔均未示出任何激活。每个点代表三次技术重复的平均值。标准偏差由误差条指示。
实施例4
本文描述了使用表达CD20的SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞以及表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞或表达抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞的经过分选的细胞群作为靶细胞进行的Jurkat NFAT T细胞报告基因测定(图7)。
作为阳性对照，将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,CAT-No.655185)的孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10μg/ml CD3抗体(来自
Figure GDA0002907774350000561
)包被，在4℃下过夜或在37℃下持续至少1小时。用PBS将CD3抗体包被的孔洗涤两次，在最后的洗涤步骤之后将PBS完全去除。使用Cedex HiRes对经过工程化以表达抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD或抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT野生型T细胞或Jurkat NFAT T细胞(进一步称为报告细胞)进行计数并检查其活力。将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。因此，将合适的细胞悬液等分试样在室温(RT)下以210g沉淀5分钟，然后重悬于新鲜的RPMI-160+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中。同样对表达目标抗原的靶细胞进行计数并检查其活力。在生长培养基中将细胞数调节至每ml 1x106个活细胞。将靶细胞和报告细胞按10:1、5:1、2:1或1:1E:T比(每孔总共110.000个细胞)一式三份铺板于96孔悬浮培养板(Greiner-bio one)中，最终体积为200μl。之后，将96孔板以190g在RT下离心2分钟，并用
Figure GDA0002907774350000571
密封。
在37℃和5％CO2下，在潮湿气氛中孵育20小时后，使用多通道移液器向上和向下移液10次，混合各孔的内容物。将100μl细胞悬液转移至新的白色透明底部96孔板(Greiner-bio-one)中，并添加100μl ONE-GloTM荧光素酶测定(Promega)。在黑暗中于300rpm的旋转振荡器上孵育15分钟后，使用
Figure GDA0002907774350000572
Spark10M读板器以1秒/孔的检测时间测量RT发光。
柱状图示出表达抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞在5:1的E:T比下与SUDHL4靶细胞共培养20小时后的激活。在CD3抗体包被的孔中与靶细胞共培养的表达抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD的Jurkat NFAT T细胞示出最高的发光信号，其与没有CD3刺激的相同条件相当。其他Jurkat NFAT野生型细胞未示出任何激活，但如果以10:1的E:T在CD3抗体包被的孔中共培养，则可检测到清晰的发光信号，证明了它们的功能。每个条代表三次技术重复的平均值。标准偏差由误差条指示。
实施例5
最初通过噬菌体展示文库筛选选择了两个抗体候选物5E11和33H09以与MHCI复合的WT1肽“RMF”结合。通过流式细胞术检查了两种结合物IgG形式的稀释液系列的结合情况。因此，将用10μM靶肽“RMF”、10μM脱靶肽“VLD”脉冲刺激或未经脉冲刺激的T2细胞与抗体的稀释液系列在冰上孵育30分钟。在除去未结合的结合物的洗涤步骤后，将细胞与荧光标记的第二抗体(anti-huFc,Jackson ImmunoResearch)一起孵育，然后进行另一个洗涤步骤，并通过流式细胞术检测剩余的抗体。重要的是，在此测定中，两种评定的候选物(5E11和33H09)在特异性方面均表现出相似，与用脱靶肽“VLD”脉冲刺激的T2细胞或未经脉冲刺激的T2细胞没有结合相比，在用靶肽“RMF”脉冲刺激的T2细胞上具有明显的浓度依赖性信号(图8)。
在图9示出的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定中评定了相同的两种抗体候选物(5E11和33H09)加上针对相同靶肽/MHC的两种其他候选物(ESK1和11D06)。
此Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定采用Jurkat NFAT报告细胞的细胞群，该细胞群可通过嵌入细胞表面上表达的嵌合抗原受体的四个不同的Fab(分别为5E11(SEQ ID NO145和146)、ESK1、33H09(SEQ ID NO 143和144)或11D06(SEQ ID NO 141和142))识别HLA-A2/WT1肽RMF。
在与Jurkat NFAT报告细胞共孵育之前，将T2细胞用10-5M的相应肽在37℃下脉冲刺激2小时，或不进行脉冲刺激。将靶细胞和报告细胞按5:1E:T比(每2000个靶细胞中10.000个效应细胞/每孔)一式三份铺板于384孔白色透明平底板中(Greiner-bio-one)。将Jurkat NFAT报告CAR-T细胞和靶细胞在37℃下共孵育7小时，然后每孔添加6μl ONE-GloTM荧光素酶底物(Promega)，并使用TECAN Infinite M1000Pro读板器直接测量发光。在RMF或VLD肽脉冲刺激的T2细胞上重复三次测量得到的CAR-NFAT信号传导的激活以柱状图形式表示(图9)。比较RMF肽(靶标)与VLD肽(脱靶)和与荧光素酶底物一起但未与报告细胞一起孵育的经不同方式脉冲刺激的T2细胞上的信号，有助于评定相应结合物激活的特异性。
不同于图8示出的基于FACS的筛选，其可以与经典的基于抗体的诊断性测定法进行比较，此Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定确实可以与脱靶上的非特异性激活对照，依据靶上的特异性T细胞激活明确区分不同的治疗候选物5E11和33H09。因此，与经典的基于抗体的诊断测定相比，根据本发明的诊断性测定法更适合于预测癌症免疫疗法的治疗疗效。
如图10所示出，与上述荧光素酶底物一起孵育但未与靶细胞共孵育的各个JurkatNFAT报告细胞群的背景信号很低。
实施例6
此Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定采用可识别两个不同HLA-A2/肽靶的JurkatNFAT报告细胞的细胞群。细胞群F06、F29和F30表达被选择与盲肽/HLA靶标结合的候选Fab，而具有Fab 33H09的细胞群对HLA-A2/WT1肽RMF具有特异性。
在与Jurkat NFAT报告细胞共孵育之前，将T2细胞用10-5M的相应肽在37℃下脉冲刺激2小时，或不进行脉冲刺激。将靶细胞和报告细胞按5:1E:T比(每2000个靶细胞中10.000个效应细胞/每孔)一式三份铺板于384孔白色透明平底板中(Greiner-bio-one)。将Jurkat NFAT报告细胞和靶细胞在37℃下共孵育7小时，然后每孔添加6μl ONE-GloTM荧光素酶底物(Promega)，并使用TECAN Infinite M1000Pro读板器直接测量发光。在T2细胞上重复三次测量得到的CAR-NFAT信号传导的激活以柱状图形式表示(图11)。从不同肽上的四个不同细胞群获得的信号的比较指示，各个候选物对其所需靶肽/HLA的激活具有很高的特异性。
示例性序列
表2：抗CD20 Fab氨基酸序列
Figure GDA0002907774350000591
Figure GDA0002907774350000601
Figure GDA0002907774350000611
表3：抗CD20 Fab DNA序列
Figure GDA0002907774350000612
Figure GDA0002907774350000621
Figure GDA0002907774350000631
Figure GDA0002907774350000641
Figure GDA0002907774350000651
Figure GDA0002907774350000661
Figure GDA0002907774350000671
Figure GDA0002907774350000681
Figure GDA0002907774350000691
Figure GDA0002907774350000701
表4：抗CEA(98/99)scFv序列
Figure GDA0002907774350000702
Figure GDA0002907774350000711
表5：抗WT1(11D06)示例性Fab序列
Figure GDA0002907774350000712
Figure GDA0002907774350000721
表4：抗WT1(33H09)示例性scFv序列
Figure GDA0002907774350000722
Figure GDA0002907774350000731
Figure GDA0002907774350000741
表14
Figure GDA0002907774350000742
Figure GDA0002907774350000751
Figure GDA0002907774350000761
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 检测癌症患者中肿瘤抗原的诊断性测定法
<130> P34754
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR H1 Kabat
<400> 1
Tyr Ser Trp Ile Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR H2 Kabat
<400> 2
Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR H3 Kabat
<400> 3
Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR L1 Kabat
<400> 4
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR L2 Kabat
<400> 5
Gln Met Ser Asn Leu Val Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20 CDR L3 Kabat
<400> 6
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 融合
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
245 250 255
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
260 265 270
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
290 295 300
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
305 310 315 320
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
325 330 335
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
340 345 350
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
355 360 365
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
370 375 380
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
385 390 395 400
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-Fab-重链
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 9
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-Fab-轻链
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-VL
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL
<400> 11
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-VH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD
<400> 14
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 15
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28CSD
<400> 15
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 16
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 17
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 17
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
85 90 95
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
100 105 110
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
130 135 140
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
165 170 175
Leu Pro Pro Arg
180
<210> 18
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 18
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)4 接头
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S 接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 接头
<400> 21
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 22
<211> 2659
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 22
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60
atcgtgatga cccagactcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc cgccagcatt 120
agctgcaggt ctagcaagag cctcttgcac agcaatggca tcacttattt gtattggtac 180
ctgcaaaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatttatc aaatgtccaa ccttgtctct 240
ggcgtccctg accggttctc cggatccggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300
agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcgctc agaatctaga acttccttac 360
accttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaaccgtacg gtggctgcac catctgtctt 420
catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct 480
gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc 540
gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag 600
cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 660
cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttagaa 720
tagaattccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca 780
ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg 840
cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac 900
catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc 960
actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa 1020
tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagtgcct attgagctaa ctggtagtcc 1080
tccggcccct gattgcggct aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg 1140
gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt 1200
ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg 1260
attggccatc cggtgtgcaa cagggcaact gtttacctat ttattggttt tgtaccatta 1320
tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaacgccac 1380
catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca gctaccggtg tgcactccca 1440
ggtgcaattg gtgcagtctg gcgctgaagt taagaagcct gggagttcag tgaaggtctc 1500
ctgcaaggct tcgggatacg ccttcagcta ttcttggatc aattgggtgc ggcaggcgcc 1560
tggacaaggg ctcgagtgga tgggacggat ctttcccggc gatggggata ctgactacaa 1620
tgggaaattc aagggcagag tcacaattac cgccgacaaa tccactagca cagcctatat 1680
ggagctgagc agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat tactgtgcaa gaaatgtctt 1740
tgatggttac tggcttgttt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct ccagcgctag 1800
caccaagggc ccctccgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac 1860
agccgctctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa 1920
cagcggagcc ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gttctggcct 1980
gtatagcctg agcagcgtgg tcaccgtgcc ttctagcagc ctgggcaccc agacctacat 2040
ctgcaacgtg aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag 2100
ctgcggaggg ggcggatcct tctgggtgct ggtggtggtg ggcggcgtgc tggcctgcta 2160
cagcctgctg gtgaccgtgg ccttcatcat cttctgggtg aggagcaaga ggagcaggct 2220
gctgcacagc gactacatga acatgacccc caggaggccc ggccccacca ggaagcacta 2280
ccagccctac gcccccccca gggacttcgc cgcctacagg agcagggtga agttcagcag 2340
gagcgccgac gcccccgcct accagcaggg ccagaaccag ctgtataacg agctgaacct 2400
gggcaggagg gaggagtacg acgtgctgga caagaggagg ggcagggacc ccgagatggg 2460
cggcaagccc aggaggaaga acccccagga gggcctgtat aacgagctgc agaaggacaa 2520
gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag aggaggaggg gcaagggcca 2580
cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg ccctgcacat 2640
gcaggccctg ccccccagg 2659
<210> 23
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20- Fab-VL
<400> 23
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180
tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336
<210> 24
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab CL
<400> 24
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 25
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20- Fab-VH
<400> 25
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttcgggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctccagc 357
<210> 26
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fab CH1
<400> 26
gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcacagccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct 180
ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgc 309
<210> 27
<211> 647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES EV71 内部核糖体进入侧
<400> 27
cccgaagtaa cttagaagct gtaaatcaac gatcaatagc aggtgtggca caccagtcat 60
accttgatca agcacttctg tttccccgga ctgagtatca ataggctgct cgcgcggctg 120
aaggagaaaa cgttcgttac ccgaccaact acttcgagaa gcttagtacc accatgaacg 180
aggcagggtg tttcgctcag cacaacccca gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaac 240
ccccatgggc gaccatggca gtggctgcgt tggcggcctg cccatggaga aatccatggg 300
acgctctaat tctgacatgg tgtgaagtgc ctattgagct aactggtagt cctccggccc 360
ctgattgcgg ctaatcctaa ctgcggagca catgctcaca aaccagtggg tggtgtgtcg 420
taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattcct 480
atattggctg cttatggtga caatcaaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca 540
tccggtgtgc aacagggcaa ctgtttacct atttattggt tttgtaccat tatcactgaa 600
gtctgtgatc actctcaaat tcattttgac cctcaacaca atcaaac 647
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S 接头
<400> 28
ggagggggcg gatcc 15
<210> 29
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD
<400> 29
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 30
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28CSD
<400> 30
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 31
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 32
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 32
ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60
gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag aggagcaggc tgctgcacag cgactacatg 120
aacatgaccc ccaggaggcc cggccccacc aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180
agggacttcg ccgcctacag gagcagggtg aagttcagca ggagcgccga cgcccccgcc 240
taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag ggaggagtac 300
gacgtgctgg acaagaggag gggcagggac cccgagatgg gcggcaagcc caggaggaag 360
aacccccagg agggcctgta taacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcctacagc 420
gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 480
ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccagg 540
<210> 33
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A 接头
<400> 33
tccggagagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 60
agg 63
<210> 34
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 34
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtga 717
<210> 35
<211> 3438
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD-eGFP
<400> 35
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattccgat 60
atcgtgatga cccagactcc actctccctg cccgtcaccc ctggagagcc cgccagcatt 120
agctgcaggt ctagcaagag cctcttgcac agcaatggca tcacttattt gtattggtac 180
ctgcaaaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatttatc aaatgtccaa ccttgtctct 240
ggcgtccctg accggttctc cggatccggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300
agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgcgctc agaatctaga acttccttac 360
accttcggcg gagggaccaa ggtggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttagaat 720
agaattcccc gaagtaactt agaagctgta aatcaacgat caatagcagg tgtggcacac 780
cagtcatacc ttgatcaagc acttctgttt ccccggactg agtatcaata ggctgctcgc 840
gcggctgaag gagaaaacgt tcgttacccg accaactact tcgagaagct tagtaccacc 900
atgaacgagg cagggtgttt cgctcagcac aaccccagtg tagatcaggc tgatgagtca 960
ctgcaacccc catgggcgac catggcagtg gctgcgttgg cggcctgccc atggagaaat 1020
ccatgggacg ctctaattct gacatggtgt gaagtgccta ttgagctaac tggtagtcct 1080
ccggcccctg attgcggcta atcctaactg cggagcacat gctcacaaac cagtgggtgg 1140
tgtgtcgtaa cgggcaactc tgcagcggaa ccgactactt tgggtgtccg tgtttccttt 1200
tattcctata ttggctgctt atggtgacaa tcaaaaagtt gttaccatat agctattgga 1260
ttggccatcc ggtgtgcaac agggcaactg tttacctatt tattggtttt gtaccattat 1320
cactgaagtc tgtgatcact ctcaaattca ttttgaccct caacacaatc aaacgccacc 1380
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcccag 1440
gtgcaattgg tgcagtctgg cgctgaagtt aagaagcctg ggagttcagt gaaggtctcc 1500
tgcaaggctt cgggatacgc cttcagctat tcttggatca attgggtgcg gcaggcgcct 1560
ggacaagggc tcgagtggat gggacggatc tttcccggcg atggggatac tgactacaat 1620
gggaaattca agggcagagt cacaattacc gccgacaaat ccactagcac agcctatatg 1680
gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag aaatgtcttt 1740
gatggttact ggcttgttta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc cagcgctagc 1800
accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcaca 1860
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac 1920
agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg 1980
tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc 2040
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 2100
tgcggagggg gcggatcctt ctgggtgctg gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac 2160
agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttctgggtga ggagcaagag gagcaggctg 2220
ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc aggaggcccg gccccaccag gaagcactac 2280
cagccctacg ccccccccag ggacttcgcc gcctacagga gcagggtgaa gttcagcagg 2340
agcgccgacg cccccgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtataacga gctgaacctg 2400
ggcaggaggg aggagtacga cgtgctggac aagaggaggg gcagggaccc cgagatgggc 2460
ggcaagccca ggaggaagaa cccccaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggacaag 2520
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgaga ggaggagggg caagggccac 2580
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 2640
caggccctgc cccccaggtc cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 2700
gaggagaatc ccggccctag ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 2760
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 2820
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 2880
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 2940
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 3000
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 3060
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 3120
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 3180
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 3240
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 3300
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 3360
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 3420
gacgagctgt acaagtga 3438
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR H1 Kabat
<400> 36
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR H2 Kabat
<400> 37
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR H3 Kabat
<400> 38
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR L1 Kabat
<400> 39
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR L2 Kabat
<400> 40
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA CDR L3 Kabat
<400> 41
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 42
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA (98/99)-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 融合
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
180 185 190
Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
260 265 270
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
275 280 285
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
290 295 300
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
<210> 43
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA (98/99)-scFv
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala
180 185 190
Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
245 250
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA (98/99)-VH
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA (98/99)-VL
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR H1 Kabat
<400> 46
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR H2 Kabat
<400> 47
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR H3 Kabat
<400> 48
Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR L1 Kabat
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR L2 Kabat
<400> 50
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06) CDR L3 Kabat
<400> 51
Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr
1 5
<210> 52
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06)-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 融合
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
225 230 235 240
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
245 250 255
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
260 265 270
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
275 280 285
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
290 295 300
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
305 310 315 320
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
325 330 335
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
340 345 350
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
355 360 365
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
370 375 380
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
385 390 395 400
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
<210> 53
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06)-Fab-重链
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
165 170 175
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
180 185 190
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
195 200 205
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
210 215 220
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
225 230 235 240
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Cys
<210> 54
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06)-轻链
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06)-VL
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asp Tyr Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (11D06)-VH
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Glu Leu Trp Trp Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09) CDR H3 Kabat
<400> 57
Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09) CDR L3 Kabat
<400> 58
Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr
1 5
<210> 59
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09)-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD 融合
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr
180 185 190
Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
245 250 255
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
260 265 270
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
275 280 285
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
290 295 300
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
305 310 315 320
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
325 330 335
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
340 345 350
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
355 360 365
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
370 375 380
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
385 390 395 400
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
405 410 415
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
420 425 430
Pro Arg
<210> 60
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09)-scFv
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 61
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09)-VH
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Asp Leu Phe Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 WT1 (33H09)-VL
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Gly Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 64
<211> 492
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60
gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120
atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagag 180
ccccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480
ccccctcgct aa 492
<210> 65
<211> 164
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 65
Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr Ala
35 40 45
Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn
100 105 110
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Pro Arg
<210> 66
<211> 495
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 66
atgaagtgga aagtgtctgt tctcgcctgc atcctccacg tgcggttccc aggagcagag 60
gcacagagct ttggtctgct ggatcccaaa ctctgctact tgctagatgg aatcctcttc 120
atctacggag tcatcatcac agccctgtac ctgagagcaa aattcagcag gagtgcagag 180
actgctgcca acctgcagga ccccaaccag ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga 240
gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag 300
cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca 360
gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc 420
ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcagacc 480
ctggcccctc gctaa 495
<210> 67
<211> 660
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
atgctgcgcc tgctgctggc gctgaacctg tttccgagca ttcaggtgac cggcaacaaa 60
attctggtga aacagagccc gatgctggtg gcgtatgata acgcggtgaa cctgagctgc 120
aaatatagct ataacctgtt tagccgcgaa tttcgcgcga gcctgcataa aggcctggat 180
agcgcggtgg aagtgtgcgt ggtgtatggc aactatagcc agcagctgca ggtgtatagc 240
aaaaccggct ttaactgcga tggcaaactg ggcaacgaaa gcgtgacctt ttatctgcag 300
aacctgtatg tgaaccagac cgatatttat ttttgcaaaa ttgaagtgat gtatccgccg 360
ccgtatctgg ataacgaaaa aagcaacggc accattattc atgtgaaagg caaacatctg 420
tgcccgagcc cgctgtttcc gggcccgagc aaaccgtttt gggtgctggt ggtggtgggc 480
ggcgtgctgg cgtgctatag cctgctggtg accgtggcgt ttattatttt ttgggtgcgc 540
agcaaacgca gccgcctgct gcatagcgat tatatgaaca tgaccccgcg ccgcccgggc 600
ccgacccgca aacattatca gccgtatgcg ccgccgcgcg attttgcggc gtatcgcagc 660
<210> 68
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 69
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 69
atgaccctgc gcctgctgtt tctggcgctg aactttttta gcgtgcaggt gaccgaaaac 60
aaaattctgg tgaaacagag cccgctgctg gtggtggata gcaacgaagt gagcctgagc 120
tgccgctata gctataacct gctggcgaaa gaatttcgcg cgagcctgta taaaggcgtg 180
aacagcgatg tggaagtgtg cgtgggcaac ggcaacttta cctatcagcc gcagtttcgc 240
agcaacgcgg aatttaactg cgatggcgat tttgataacg aaaccgtgac ctttcgcctg 300
tggaacctgc atgtgaacca taccgatatt tatttttgca aaattgaatt tatgtatccg 360
ccgccgtatc tggataacga acgcagcaac ggcaccatta ttcatattaa agaaaaacat 420
ctgtgccata cccagagcag cccgaaactg ttttgggcgc tggtggtggt ggcgggcgtg 480
ctgttttgct atggcctgct ggtgaccgtg gcgctgtgcg tgatttggac caacagccgc 540
cgcaaccgcc tgctgcagag cgattatatg aacatgaccc cgcgccgccc gggcctgacc 600
cgcaaaccgt atcagccgta tgcgccggcg cgcgattttg cggcgtatcg cccg 654
<210> 70
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 70
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln
1 5 10 15
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val
20 25 30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val
50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val
85 90 95
Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe
100 105 110
Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg
115 120 125
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr
130 135 140
Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val
145 150 155 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp
165 170 175
Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met
180 185 190
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala
195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
210 215
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 YMNM
<400> 71
Tyr Met Asn Met
1
<210> 72
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 PYAP
<400> 72
Pro Tyr Ala Pro
1
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 73
Ala Thr Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val His Ser
20
<210> 74
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽 DNA 序列
<400> 74
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcc 57

Claims (15)

1.一种用于确定样品中肿瘤细胞的存在的诊断性测定法，所述诊断性测定法包括以下步骤：
a)使所述样品与表达报告T(CAR-T)细胞的嵌合抗原受体(CAR)接触，其中所述报告CAR-T细胞包含：
i.能够与所述肿瘤细胞特异性结合的CAR，其中，所述CAR可操作地偶联至响应元件；
ii.在所述响应元件控制下的报告基因；以及
b)通过测量所述报告基因的表达来测定T细胞的激活以确定所述肿瘤细胞的存在。
2.根据权利要求1所述的诊断性测定法，其特征在于，所述CAR包含能够与肿瘤靶抗原特异性结合的靶抗原结合部分。
3.根据权利要求2所述的诊断性测定法，其特征在于，所述靶抗原结合部分是Fab片段。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述报告CAR-T细胞是Jurkat细胞。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的诊断性测定，其特征在于，所述肿瘤靶抗原是细胞表面抗原和/或受体。
6.根据权利要求2或5中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述肿瘤靶抗原选自由CD20、CD38、CD138、CEA、EGFR、FolR1、HER2、LeY、MCSP、STEAP1、TYRP1和WT1或其片段组成的组。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述肿瘤靶抗原是与人类主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述CAR包含至少一个细胞内刺激信号传导和/或共刺激信号传导结构域。
9.根据权利要求8所述的诊断性测定法，其特征在于，所述细胞内信号传导和/或共信号传导结构域的激活导致所述响应元件的激活。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述响应元件的激活导致所述报告基因的表达。
11.根据实施例1至10中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述响应元件是NFAT途径、NF-κB途径或AP-1途径的一部分。
12.根据实施例1至11中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述报告基因编码发光蛋白。
13.根据实施例1至12中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的诊断性测定法，其特征在于，所述样品是源自患有疾病的个体的患者样品，特别是其中所述疾病是癌症。
15.一种预测抗肿瘤CAR-T细胞治疗疗效的方法，所述方法包括提供来自患有肿瘤的受试者的样品，以及根据实施例1至15中任一项所述的诊断性测定法，通过测量所述报告基因的表达来确定T细胞激活，其中所述报告基因的激活指示所述抗肿瘤CAR-T细胞治疗在应用于所述受试者时的疗效。
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