CN103163301A

CN103163301A - 一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(hsa)定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN103163301A
Application number: CN2011104120390A
Authority: CN
Inventors: 万勇; 吴英松; 陈殷; 陈少琅; 黄黉; 姚小艳
Original assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd Zhongshan University
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(HSA)定量检测试剂盒。该试剂盒包括：包被有抗HSA抗体的96孔微孔反应板，校准品，铕标记抗HSA抗体，分析缓冲液，洗涤液和增强液。通过双抗体夹心的免疫反应，形成包被抗HSA抗体-HSA分子-铕标记抗HSA单克隆抗体复合物，加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本发明除拥有TRFIA技术优点外，还可满足生物制品生产中高浓度(微克级)HSA定量检测的要求，避免在使用时稀释待检样品，缩短工作时间大大提高工作效率。

Description

一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(HSA)定量检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物分析化学、纳米生物技术领域，具体地说，涉及一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的HSA定量检测试剂盒，可用于测定疫苗类相关生物制品中所含人血清白蛋白的浓度，辅助生产过程中产品质量的管控。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。在血浆中其浓度为42g/L，约占血浆总蛋白的60％。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时还维持血液正常的渗透压。

在生物制品尤其是疫苗的生产中，HSA作为一种常用的添加组份，可以有效维持生物制品中活性成分的稳定，这也是《中国药典》指定被允许加入多种生物制品中的稳定剂之一。然而，如果生物制品中的HSA添加量过高则有可能打破患者体液平衡，引发身体不适或疾病的发生；过低则可能无法维持产品中生物活性组分的稳定。因此，在生物制品的质量管理中，严格控制HSA的正确添加量，是影响产品质量的关键环节之一。

目前检测HSA大多采用酶免疫分析(Enzymatic immunoassay，EIA)、化学发光免疫分析(Chemilinescent immunoassay，CLIA)和一些化学反应检测方法，但酶免分析为定性或半定量试剂，不能准确定量，难以满足生产实践需要。化学发光免疫分析试剂与其它标记技术相比有许多优点：①无放射性辐射的危害；②灵敏度高，检测线性范围宽；③稳定性好、自动化程度高；④应用范围宽，可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可以用于核酸探针的检测。但化学发光免疫分析试剂同时也有发光过程短、样品不能重复检测、本底较高及易受环境物质干扰，加之成本较高，一定程度上阻碍了其应用的范围的缺点。化学反应方法虽然有一定的参考性，但其一般用于总蛋白浓度的测定，特异性差，不能在多组分蛋白溶液中测出HSA组份的含量。

TRFIA技术是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，非常适用于定量要求高、重复性好、需批量处理的检测样品。

目前TRFIA技术已广泛应用于多种临床检测项目中，但运用该技术检测HSA的尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人血清白蛋白的时间分辨荧光免疫分析定量检测方法及试剂盒。

本发明检测方法的原理是双抗体夹心的免疫反应：将抗HSA的一株单克隆抗体包被到96孔微孔板上，封闭，将HSA校准品及待检样品加入反应孔中振荡反应，再加入另一株铕标记抗HSA单克隆抗体充分反应后洗板。加入增强液震荡反应后，在紫外光的激发下发射出很强的荧光，用时间分辨仪器测定其荧光强度。荧光强度与样品中的HSA浓度成正比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的含量。

本发明提供的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括以下组分：1)校准品、2)包被抗HSA抗体的96孔微孔板、3)铕标记抗CEA抗体、4)分析缓冲液、5)洗涤液(25x)，和6)增强液。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征在于试剂盒的包被抗HSA抗体的96孔微孔板制备：将包被缓冲液稀释抗HSA抗体至适当浓度→包被至96孔微孔板→用封闭缓冲液封闭1小时→保存等步骤得到包被有抗HSA的96孔微孔反应板，其中包被缓冲液为：

Tris-HCl(50-200mmol/L)、pH7.2缓冲液；封闭缓冲液由Tris-HCl(50-200mmol/L)、含0.1％-0.5％水解酪蛋白、5-10％蔗糖、pH7.2缓冲液组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的铕标记抗HSA抗体的制备步骤为：选用抗HSA-单克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗体与Eu³⁺标记物的比例为5∶1(质量比)为最佳比例，标记率太高，影响被标记抗体的免疫活性；标记率太低，信号强度不够，降低检测灵敏度。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的校准品为：用含1～5g/L水解酪蛋白及1g/L NaN₃的50mmol/l pH7.8Tris-Hcl缓冲液，将HSA抗原配制成0μg/mL、1.23μg/mL、3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mL系列浓度的校准溶液，按每瓶1mL分装冻干，4℃保存。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的分析缓冲液由含PEG6000(1.5％)、水解酪蛋白(0.5％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween 20(0.1％)、NaCl(0.84％)的pH7.8Tris-HCl(50mmol/L，)缓冲液组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的洗涤液(25x)由Tris-HCl(1.25mmol/L，)、Tween 20(2.5％)、NaCl(21％)和pH7.8缓冲液组成。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的增强液由β₂二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton200、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH 2.0～3.2)组成，并用适量邻苯二甲酸氢钾调整pH为3.0-3.2。

根据本发明的一个优选实施方案，其特征还在于试剂盒的检测对象为疫苗类相关生物制品或半成品溶液，定量检测溶液中HSA含量。

本发明的测定方法为：往反应板中加入HSA校准品或样品100μl，再加入用分析缓冲液以体积比为1∶50稀释的Eu³⁺标记抗体100μl；室温震荡孵育反应60min，最后每孔加入200μl增强液振摇5min后在时间分辨荧光检测仪上按所编程序测定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明首先对所用的原材料进行筛选试验和质量检定，包括包板抗体和铕标标记抗体的活性、标记物和抗体的比例、标记物的稀释度等通过反复探索和试验比对最终找到了简便、效率高、成本低、质量可靠的标记方法。

2、本发明公开了基于上述探索试验得到的各种试剂配方，包括：洗涤液配方、分析缓冲液配方、增强液配方，并公开了铕标记抗体制备过程。

3、本发明试剂盒采用TRFIA技术，拥有TRFIA技术的重复性好、无放射性污染、标准曲线范围宽等诸多优点外，与现有同类检测方法相比，该技术可以更好的适应生产工作中的需要。主要体现在：在产品设计中，提高了蛋白的可检测量达到μg级，最大检测量达到100μg/mL，更好兼容了待检样品所需要的检测要求，减少了样本检测过程中的稀释过程，大大提高了样品检测的效率。

附图说明

图1为实施例3基于时间分辨荧光免疫分析技术的HSA定量检测试剂盒SIGMA公司HSA配制定标品拟合标准曲线(三次样条平滑拟合)。

图2为实施例3基于时间分辨荧光免疫分析技术的HSA定量检测试剂盒定标品拟合标准曲线(三次样条平滑拟合)。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1 本发明的试剂盒的制备

(1)抗HSA微孔反应板制备步骤：

包被：取抗HSA抗体用包被缓冲液稀释到3ug/mL，按100uL/孔包被到96孔微孔板上，振荡混匀，4℃放置过夜。次日取出洗板4次。

封闭：在清洗后的微孔板中加入150ml封闭液，振荡混匀，4℃放置过夜。

保存：次日取板拍干，抽真空后，保存2-8℃。

上述所用的包被缓冲液为：Tris-HCl(50mmol/L)、pH7.2缓冲液。

上述所用的封闭缓冲液为：Tris-HCl(50mmol/L)、含0.5％水解酪蛋白、10％蔗糖、pH7.2缓冲液。

(2)铕标记抗HSA抗体制备步骤为：

抗体纯化和浓缩：将1mg抗HSA单克隆抗体加入0.5ml标记缓冲液(50mmol/L，Na2CO3，pH 9.0)，混匀后，用Millipore公司带有滤膜的G-50离心管10000rpm离心5min，再重复洗涤6次，倒转离心收集抗体，体积控制在200μl左右。

抗体标记：将纯化的抗HSA抗体加入0.2mg Eu³⁺标记试剂(PerKin Elmer公司产品，编号：1244-302)，充分混匀，25℃振荡过夜。

上样与洗脱：用Sephadex G-50层析柱(1x30cm)分离纯化，洗脱液(含0.9％NaCl的50mmol/l Tris-HCl)洗脱，同时收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光度(A280nm)，合并峰管，测蛋白含量并计算标记率。

确定稀释度：并管后的铕标记物，进行稀释度摸索，选择线性较好，灵敏度较低的稀释度；分装铕标记物：用连续加样枪分装，体积为1.0ml/瓶，真空冷冻干燥。

保存：冻干后2℃-8℃。

(3)校准品制备步骤为：用含1g/L水解酪蛋白及1g/LNaN₃的50mmol/l pH7.8 Tris-Hcl缓冲液，将HSA抗原纯品配制成0μg/mL、1.23μg/mL、3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mL系列浓度的校准溶液，按每瓶1mL分装冻干，4℃保存备用。

(4)分析缓冲液配方为：Tris-HCl(50mmol/L，)、PEG6000(1.5％)、HSA(0.5％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween 20(0.1％)和NaCl(0.84％)pH7.8缓冲液。

(5)洗涤液(25x)配方为：Tris-HCl(1.25mmol/L，)、Tween 20(2.5％)和NaCl(21％)pH7.8缓冲液。

(6)增强液配方为：由β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)(15μmol/L)、三辛基氧化磷(TOPO)(50μmol/L)、Triton X-100(0.1％)、醋酸(0.6％)组成，用适量邻苯二甲酸氢钾调整pH为3.0-3.2。

实施例2 本发明的试剂盒的使用方法

(1)样本收集

取疫苗或其他含HSA待检生物制剂成品或半成品100uL，2-8℃保存一周。更长时间保存需保存-20℃。

(2)试剂的准备

1)洗涤液：将50mL浓缩洗液和1200mL去离子水混合，作为工作洗涤液。

2)标记物工作液：使用前一小时将每瓶标记物用1mL去离子水溶解，用分析缓冲液以1∶50倍稀释作为铕标抗体工作液。

3)96孔微孔反应板：使用前取出室温平衡15min。

(3)操作步骤

1)取校准品和待检样品每孔各100uL，室温震荡孵育60min。反应结束后洗板4次，用吸水纸拍干。

2)加入稀释好的铕标记抗体工作液，100uL/孔，室温振荡孵育60min，反应结束后洗板6次，用吸水纸拍干。

3)每孔加增强液200μl，震荡孵育5分钟。

4)测定。

实施例3 本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造和检定规程对通过实施例1中制备成的试剂盒进行检定，结果如下：

(1)准确度

对校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定后，用双对数数学模型(log-log)拟合，两条剂量-反应曲线基本平行(图1：为SIGMA公司HSA纯品(货号：A8763，琼脂糖凝胶电泳检测纯度≥99％)配制的标准品剂量-反应曲线；图2：为校准品的剂量-反应曲线；Cps为每秒钟荧光计数)，两条曲线的斜率分别为0.98和0.97(t检验P＞0.05)。以HSA国家标准品为对照品，校准品的实测效价与标示效价的比值在0.9～1.1之间。剂量-反应曲线的线性相关系数(r)＝0.999。

2)分析灵敏度和线性范围

以零参考标准品当作样品测量8次，计算其荧光值及标准差。以该点荧光测定平均值加2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试剂分析灵敏度为0.17μg/ml。将抗原稀释成不同浓度进行测定，测得标准曲线线性范围为0.17～100μg/ml。

3)精密度(CV％)

用本发明试剂盒对自制的HSA质控品(质控品I、II、III，预期浓度分别为5.3、21.4、60.7ng/ml)进行测定，各设10个复孔。结果本发明试剂盒的批内变异系数(CV％)为5.1％～7.2％和批间变异系数(CV％)为7.9％～9.6％。

表1 批内精密度测试结果(n＝10)

表2 批间精密度测试结果(三批，n＝3*10)

4)特异性

将高浓度的人血清免疫球蛋白、牛血清免疫球蛋白、牛血清白蛋白作为样品用本试剂盒测定，结果表明无明显交叉反应，见表3。

表3 HSA特异性检测结果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(HSA)定量检测试剂盒，包括：1)校准品，2)包被抗HSA抗体的96孔微孔反应板，3)铕标记抗HSA抗体，4)分析缓冲液，5)洗涤液，和6)增强液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于校准品为：用含2g/L水解酪蛋白、1g/LNaN₃的50mmol/l pH7.8Tris-Hcl缓冲液，将HSA抗原配制成0μg/mL、1.23μg/mL、3.7μg/mL、11.1μg/mL、33.3μg/mL、100μg/mL系列浓度的校准溶液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于包被抗HSA抗体的96孔微孔反应板的制备：用包被缓冲液稀释抗HSA抗体至适当浓度→包被至96孔微孔板→用封闭缓冲液封闭1小时→拍干保存，其中包被缓冲液为：Tris-HCl(50-200mmol/L)、pH7.2缓冲液；封闭缓冲液由Tris-HCl(50-200mmol/L)、含0.1％-0.5％水解酪蛋白、5-10％蔗糖、pH7.2缓冲液组成。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于铕标记抗HSA抗体的制备：选用抗HSA-单克隆抗体进行Eu³⁺标记，抗体与Eu³⁺标记物的质量比例为5-10∶1。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于分析缓冲液由Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.8)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、NaN₃(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween 20(0.1％)、NaCl(0.84％)组成。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于25×洗涤液由Tris-HCl(1.25mmol/L)、Tween 20(2.5％)、NaCl(21％)和pH7.8缓冲液组成。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于增强液由β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)(15μmol/L)、三辛基氧化磷(TOPO)(50μmol/L)、Triton X-100(0.1％)、醋酸(0.6％)组成，并用适量邻苯二甲酸氢钾调整pH为3.0-3.2。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于试剂盒的检测对象为疫苗类相关生物制品或半成品溶液，定量检测溶液中HSA含量。