CN111239218A - 一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学发光检测领域,具体涉及一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用方法。本发明提供的电化学发光适配体传感器是由适配体负载于由纳米复合材料HKUST‑1/PTC‑PEI修饰玻碳电极的表面而成。本发明充分利用PTC‑PEI与HKUST‑1两者的静电相互作用共同修饰到玻碳电极表面,使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高,再通过酰胺键的结合作用负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器,可特异性识别目标分子莱克多巴胺,提高了对莱克多巴胺检测的选择性。
Description
技术领域
本发明属于电化学发光检测领域,具体涉及一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用方法。
背景技术
众多食品安全问题已经严重影响了人们的生活。所以对食品安全的监测显得十分重要。莱克多巴胺(RAC),是一种新型的“瘦肉精”,可用于牲畜饲料中提高牲畜的瘦肉率,是一种肾上腺素受体激动剂,可以用于药物。但是使用时有严格的标准,使用不当会有严重的毒副作用,对动物机体产生副作用,具有激素残留的问题,同时也会影响消费者的健康。欧盟早已明确禁止在食用性动物中使用包括莱克多巴胺在内的激素类药物,中国政府对RAC非常重视,已经明文禁止在动物饲料中添加RAC,但是,目前世界上还有诸多国家在动物饲料中使用毒性相对较低的RAC,由于管理不规范及RAC价格低廉,不正确使用RAC的现象依然存在,这在一定程度上会增加RAC转移到人体内的几率,加重对人体的危害。现有技术中,常用的检测莱克多巴胺的方法主要有高效液相色谱、酶联免疫吸附法、液相色谱法、气相色谱法、电化学法等,但是这些方法普遍存在实验操作较复杂和耗时长等缺点,难以推广到市场中进行现场检测。
有鉴于上述现有的莱克多巴胺的检测中存在的缺陷,本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识,并配合学理的运用,积极加以研究创新,以期创设一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用方法,以提高莱克多巴胺的检测效率,使其更具有实用性。经过不断的研究、设计,并经反复试作样品及改进后,终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,具有灵敏度高、重现性好、选择性好和线性范围宽的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
本发明提出的检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,是由适配体负载于由纳米复合材料HKUST-1/PTC-PEI修饰玻碳电极的表面而成。本发明充分利用PTC-PEI与HKUST-1两者的静电相互作用共同修饰到玻碳电极表面,使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高,再通过酰胺键的结合作用负载适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称Aptamer/HKUST-1/PTC-PEI/GCE传感器),可特异性识别目标分子莱克多巴胺,提高了对莱克多巴胺检测的选择性。
灵敏度:PTC-PEI作为Per衍生物是一种发光体,可以与共反应剂过硫酸钾发生氧化还原,在较高电位下,PTC-PEI在电极上被还原成PTC-PEI·-,同时共反应剂K2S2O8的S2O8 2-可以被还原成SO4·-
然后两者可以反应生成激发态的PTC-PEI*,当更多的激发态回到基态时,便会产生更多的光,而HKUST-1掺杂后可以充分利用其表面积大等特性来加大发光体的负载量,更好的促进PTC-PEI与过硫酸钾相互作用,产生更多的光,提升电化学发光性能。
稳定性:单独修饰PTC-PEI在电极表面,电化学发光响应强度不高且不稳定,当负载HKUST-1后,复合物通过交联剂可以更好的利用酰胺键的结合作用,使复合材料的性能更加稳定,将电极浸泡在过硫酸钾溶液中,电极上的复合材料不会脱落,所以可以提高传感器的稳定性。
进一步的,适配体是由含有5'-NH2-AAAAGTGCGGGCAAA-3'碱基序列的适配体。
进一步的,纳米复合材料HKUST-1/PTC-PEI修饰玻碳电极的制备方法如下:
S1.PTC-PEI的制备:将PTCDA溶解在氢氧化钠的水溶液中,然后向其中加入HCl,得到红色沉淀物,将红色沉淀物用去离子水洗涤以除去过量的反应物质,得到PTCA溶液,向PTCA溶液中依次加入EDC、NHS,搅拌,并加入聚乙烯亚胺,继续搅拌,然后用盐酸调pH值,通过离心、干燥,制得红色粉末状产物PTC-PEI;将PTC-PEI分散于超纯水中,使其分散均匀,得到PTC-PEI的水分散液;
S2.HKUST-1的制备:将三水合硝酸铜和均苯三甲酸,溶解于二甲基亚砜中并超声波处理,然后将其注入到含有聚乙烯吡咯烷酮的甲醇中,同时搅拌;然后经离心,洗涤,干燥得到HKUST-1的蓝色纳米晶体;将HKUST-1分散于N,N-二甲基甲酰胺里,并加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,超声使其分散均匀,得到HKUST-1的DMF分散液;
S3.将玻碳电极抛光,依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗,室温下吹干,获得前处理后的玻碳电极待用;依次移取步骤S1中的PTC-PEI的水分散液和步骤S2中的HKUST-1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面,自然晾干,得到所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极。
进一步的,纳米复合材料HKUST-1/PTC-PEI修饰玻碳电极的制备方法如下:
S1.PTC-PEI的制备:将PTCDA溶解在氢氧化钠的水溶液中,然后向其中加入HCl,得到红色沉淀物,将红色沉淀物用去离子水洗涤以除去过量的反应物质,得到PTCA溶液,向PTCA溶液中依次加入EDC、NHS,搅拌,并加入聚乙烯亚胺(PEI),继续搅拌,然后用盐酸调pH值,通过离心、干燥,制得红色粉末状产物PTC-PEI,将其保存于4℃下;将PTC-PEI分散于超纯水中,超声30min,使其分散均匀,得到PTC-PEI的水分散液;
S2.HKUST-1的制备:将三水合硝酸铜和均苯三甲酸,溶解于二甲基亚砜中并超声波处理,然后将其注入到含有聚乙烯吡咯烷酮的甲醇中,同时搅拌;然后经离心,洗涤,干燥得到HKUST-1的蓝色纳米晶体;将HKUST-1分散于N,N-二甲基甲酰胺里,并加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,超声使其分散均匀,得到HKUST-1的DMF分散液;
S3.将玻碳电极抛光,依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗,室温下吹干,获得前处理后的玻碳电极待用;用微量注射器依次移取步骤S1中的PTC-PEI的水分散液和步骤S2中的HKUST-1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面,自然晾干,得到所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极。
进一步的,步骤S1中所得PTC-PEI的水分散液的浓度为0.5mg/mL。HKUST-1复合时,PTC-PEI在此浓度下可以达到最佳复合效果,得到最佳电化学发光强度,如果浓度过高,会使电化学发光强度值超量程,而无法准确测量,无法进行检测。
进一步的,步骤S2所得HKUST-1的DMF分散液的浓度为1mg/mL。在发明提供的本传感器中,HKUST-1作为载体,以HKUST-1的浓度为标准,优化PTC-PEI的浓度,使电化学强度达到最佳,在提升复合物电化学发光强度的同时可以进一步提高传感器的灵敏度。
进一步的,步骤S2中EDC和NHS的质量比为4:1。在此质量比下,可以更好的活化羧基,使氨基与羧基结合,进一步促进酰胺化反应的进行。
进一步的,步骤S3中PTC-PEI的水分散液为4μL,HKUST-1的DMF分散液为5μL。
本发明的第二个目的是提供一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,具有同样的有益效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
本发明提供的检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,通过酰胺键结合作用将所述适配体负载在所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面,自然晾干,制得所述电化学发光适配体传感器。
进一步的,将适配体负载在HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的具体方法为:首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris-HCl缓冲溶液中加入所述适配体,配制适配体浓度为1~6μmol/L的适配体溶液,然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。
进一步的,适配体溶液中适配体的浓度为5μmol/L。在本发明中,对适配体浓度进行优化,优化范围为1-6μmol/L,最优选的适配体浓度为5μmol/L,因为在此浓度下,电化学发光强度猝灭效果不大,减少非导电蛋白质对光强的影响,从而实现更好的检测效果。
本发明的第三个目的是一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的应用方法,具有同样的有益效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
本发明提供的检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,以电化学发光适配体传感器作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极组成三电极体系,样品中的莱克多巴胺被定量捕捉到传感器的表面,通过产生的发光信号实现莱克多巴胺的检测。
进一步的,具体步骤为:
A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制:用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.05mol/L K2S2O8的PBS缓冲溶液;
A2.不同浓度的莱克多巴胺标准溶液的配制:首先配制50×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液,用甲醇溶解,然后用水稀释得到1×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液,然后将1×10- 5mol/L的莱克多巴胺溶液用甲醇水溶液进行稀释,得到若干不同浓度的莱克多巴胺标准溶液,莱克多巴胺标准溶液的浓度范围为1.0×10-12~1.0×10-6mol/L;
A3.标准曲线的绘制:将所述电化学发光适配体传感器置于步骤A2配制的不同浓度的莱克多巴胺标准溶液中浸泡相同时间,使电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺,然后取出并淋洗,作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极,组成三电极体系,以步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液,在-1.7~0V的电化学窗口范围内,光电倍增管高压800V,扫速0.1V/s,进行循环伏安扫描,记录发光强度-时间曲线,建立电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺前后的发光强度差值与莱克多巴胺标准溶液中的莱克多巴胺浓度对数值的线性关系,得到相应的线性回归方程;
A4.样品中莱克多巴胺的检测:所述样品先经过预处理再用步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液调节pH,然后放入电化学发光适配体传感器浸泡相同时间,使电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺,然后取出并淋洗,作为工作电极,再采用步骤A3方法检测发光强度,再根据线性回归方程计算出样品中莱克多巴胺的浓度。
进一步的,步骤A3中浸泡时间为35min。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
本发明设计了一种基于Per衍生物PTC-PEI与铜基金属有机框架HKUST-1纳米复合材料的电化学发光适配体传感器,两者材料通过静电相互作用及酰胺键的结合,可以获得稳定的电化学发光性能,该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势,通过莱克多巴胺对该体系ECL信号强度的猝灭的机理,成功实现对莱克多巴胺的灵敏检测,该传感平台可特异性识别检测物莱克多巴胺,具有高选择性。本发明的检测范围为1.0×10-12~1.0×10-6mol/L,最低检测限为6.17×10-13mol/L。本发明检测莱克多巴胺的操作简单、选择性好、检测成本低、灵敏度高。本发明对推广适配体传感器在食品安全方面的实际应用具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中所构建的电化学发光适配体传感器在与不同浓度的莱克多巴胺结合后的ECL响应图,其中莱克多巴胺的浓度从左到右依次为:(a)1.0×10-6mol/L;(b)1.0×10-7mol/L;(c)1.0×10-8mol/L;(d)1.0×10-9mol/L;(e)1.0×10-10mol/L;(f)1.0×10- 11mol/L;(g)1.0×10-12mol/L;
图2为实施例1加入莱克多巴胺前后发光强度的差值与莱克多巴胺浓度对数值的标准曲线;
图3是实施例1中制备的HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料的扫描电镜图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,对依据本发明提出的检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用方法,其具体实施方式、特征及其功效,详细说明如后。
以下实施例中,含有5'-NH2-AAAAGTGCGGGCAAA-3'碱基序列的适配体购自生工生物工程(上海)股份有限公司,将该适配体负载在HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的方法为:首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris-HCl缓冲溶液中加入所述适配体,配制适配体浓度为5μmol/L的适配体溶液,然后移取4μL的所述适配体溶液并将其滴涂在所述的HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。具体的:
A1.采购的适配体开盖前先涡旋振荡10min,再以3000rpm离心20min;
A2.慢慢打开管盖,依照管上的标注,加入适量含有0.2mol/L KCl、0.1mol/LNaCl、5.0mmol/L MgCl2和1.0mmol/L乙二胺四乙酸的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液的储备溶液;
A3.充分振荡均匀,稀释到5μmol/L的浓度,放于4℃冰箱冷藏待用。
以下实施例中不同浓度的莱克多巴胺标准溶液的配制方法为:配制莱克多巴胺溶液,然后用甲醇水溶液进行稀释,得到一系列不同浓度的莱克多巴胺标准溶液,本实施例中莱克多巴胺标准溶液中莱克多巴胺的浓度分别为(a)1.0×10-6mol/L;(b)1.0×10-7mol/L;(c)1.0×10-8mol/L;(d)1.0×10-9mol/L;(e)1.0×10-10mol/L;(f)1.0×10-11mol/L;(g)1.0×10-12mol/L。
实施例1
(一)组装检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器
(1)PTC-PEI与HKUST-1材料的制备:
S1.准确称量0.1009g PTCDA溶解在氢氧化钠的水溶液中(0.05M),然后向其中缓慢加入HCl(1M),可以观察到沉淀物,用去离子水洗涤除去过量的物质,将含EDC、NHS的10mL的PTCA溶液在4℃下快速搅拌5h,同时在剧烈搅拌中加入5mL聚乙烯亚胺(PEI),搅拌12h,可以得到红葡萄酒色的溶液,然后用盐酸调pH为6-7之间,离心、干燥,制得红色粉末状产物PTC-PEI,将其保存于4℃下;
S2.准确称量2.4408g三水合硝酸铜,0.5812g均苯三甲酸,在5.0012g二甲基亚砜(DMSO)中超声波处理30min,然后将其在65℃电炉中保持12h,将1mL上述溶液注入含有0.1g聚乙烯吡咯烷酮的10.0mL的甲醇中,同时在55℃下剧烈搅拌90min,离心收集产物,并用10.0mL甲醇洗涤两次,干燥可得HKUST-1的纳米晶体;
S3.将制备的PTC-PEI配制成0.5mg/mL的超纯水分散液;将制备的HKUST-1配制成1mg/mL的DMF分散液,且向上述DMF分散液中加入EDC与NHS(质量浓度比为4:1),形成含有交联剂的HKUST-1的DMF分散液。
(2)检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备
首先将玻碳电极用抛光粉(Al2O3)在麂皮上打磨成镜面后,依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗,室温下吹干获得预处理后的玻碳电极。用微量注射器依次移取步骤(1)中制得的4μL 0.5mg/mL的PTC-PEI分散液,待自然晾干后,再滴涂5μL 1mg/mL的HKUST-1的DMF分散液,自然晾干后得到HKUST-1/PTC-PEI/GCE修饰电极,自然晾干待用;在HKUST-1/PTC-PEI/GCE修饰电极表面再滴涂4μL配制好的含适配体的Tris-HCl缓冲溶液,自然晾干10h,得到Aptamer/HKSUT-1/PTC-PEI/GCE传感器,作为电化学发光测试的传感元件。
(二)检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的应用方法
A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制:
用pH为7.4的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.05mol/L K2S2O8的PBS缓冲溶液;
A2.不同浓度的莱克多巴胺标准溶液的配制:首先配制配制50×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液,用甲醇溶解,然后用水稀释得到1×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液,然后将1×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液用甲醇水溶液进行稀释,得到一系列不同浓度的莱克多巴胺标准溶液,莱克多巴胺标准溶液的浓度范围为1.0×10-12~1.0×10-6mol/L;本实施例中莱克多巴胺标准溶液中莱克多巴胺的浓度分别为(a)1.0×10-6mol/L;(b)1.0×10-7mol/L;(c)1.0×10-8mol/L;(d)1.0×10-9mol/L;(e)1.0×10-10mol/L;(f)1.0×10-11mol/L;(g)1.0×10-12mol/L;
A3.标准曲线的绘制:将A1中的检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器作为传感元件,将其置于不同浓度的莱克多巴胺标准溶液中浸泡35min,取出后淋洗,作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极,组成三电极体系,并以含有0.05mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度,在-1.7~0V的电化学窗口范围内,光电倍增管高压800V,扫速0.1V/s,进行循环伏安扫描,记录发光强度-时间曲线,建立电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺前后的发光强度差值与莱克多巴胺标准溶液中的莱克多巴胺浓度对数值的线性关系,得到的相应的线性回归方程为;ΔECL=7128.3191+1944.2097lgC(nmol/L),检测范围为1.0×10-12~1.0×10-6mol/L,检测限为6.17×10- 13mol/L。
A4.样品的检测:将切碎的猪肉(5g)放入离心管中并且加入莱克多巴胺水溶液,加标样品在搅拌器上以300rpm的速度均质3min,然后在4℃下保持12h。随后用20mL乙腈通过超声30min,从加标猪肉中提取莱克多巴胺。在4℃下离心10分钟后,收集上清液。将该提取程序重复两次,合并两部分上清液,并使用旋转蒸发仪在40℃下干燥。将残余物重新溶解在甲醇中,并加入含有0.05mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4,取25mL所得溶液用于电化学发光分析,按步骤A1所得的线性回归方程计算出待检测样品中莱克多巴胺的浓度,其结果列于表1中。
本实施例以PTC-PEI为基底材料,通过二次滴涂HKUST-1得到纳米复合材料,形貌如图3,两者能够通过静电相互作用及酰胺键稳定结合,材料结合新颖,能够大幅度提高单独材料的电化学发光强度,导电性良好,稳定性好,且传感器选择性好,稳定性好。
(1)Aptamer/HKUST-1/GCE传感器的制备
用移液枪移取5μL 0.5mg/mL的HKUST-1的DMF分散液,滴涂到前处理过的玻碳电极(前处理方法同实施例1)表面,得到HKUST-1/GCE化学修饰电极,自然晾干待用;在HKUST-1/GCE化学修饰电极表面再滴涂4μL 5μmol/L莱克多巴胺适配体,自然晾干10h,得到Aptamer/HKUST-1/GCE传感器,作为电化学发光测试的传感元件。(单体测试滴涂量与样品浓度与实施例保持单一变量)
(2)标准曲线的绘制
将步骤(1)制得的Aptamer/HKUST-1/GCE传感器作为传感元件,将其置于不同浓度的莱克多巴胺标准溶液中浸泡35min,取出后淋洗,作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极,组成三电极体系,并以含有0.05mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度,在-1.7~0V的电化学窗口范围内,光电倍增管高压800V,扫速0.1V/s,进行循环伏安扫描,记录发光强度-时间曲线,建立电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺前后的发光强度差值与莱克多巴胺标准溶液中的莱克多巴胺浓度对数值的线性关系,得到相应的线性回归方程。
(3)样品的检测
将切碎的猪肉(5g)放入离心管中并且加入莱克多巴胺的甲醇稀释液,加标样品在搅拌器上以300rpm的速度均质3min,然后在4℃下保持12h。随后用20mL乙腈通过超声30min,从加标猪肉中提取莱克多巴胺。在4℃下离心10分钟后,收集上清液。将该提取程序重复两次,合并两部分上清液,并使用旋转蒸发仪在40℃下干燥。将残余物重新溶解在甲醇中,加入含有0.05mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4,取25mL所得溶液用于电化学发光分析,按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中莱克多巴胺的浓度,其结果列于表1中。
对比实施例2:
(1)Aptamer/PTC-PEI/GCE传感器的制备
用微量注射器移取4μL 1mg/mL的PTC-PEI水分散液,滴涂到前处理过的玻碳电极(前处理方法同实施例1)表面,得到PTC-PEI/GCE化学修饰电极,自然晾干待用;在PTC-PEI/GCE化学修饰电极表面再滴涂4μL 5μmol/L莱克多巴胺适配体,自然晾干10h,得到Aptamer/PTC-PEI/GCE传感器,作为电化学发光测试的传感元件。(单体测试滴涂量与样品浓度与实施例保持单一变量)。
(2)标准曲线的绘制
将步骤(1)制得的Aptamer/PTC-PEI/GCE传感器作为传感元件,将其置于不同浓度的莱克多巴胺标准溶液中浸泡35min,取出后淋洗,作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极,组成三电极体系,并以含有0.05mol/L K2S2O8的pH 7.4的0.1mol/L PBS缓冲液为电解液测定发光强度,在-1.7~0V的电化学窗口范围内,光电倍增管高压800V,扫速0.1V/s,进行循环伏安扫描,记录发光强度-时间曲线,建立电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺前后的发光强度差值与莱克多巴胺标准溶液中的莱克多巴胺浓度对数值的线性关系,得到相应的线性回归方程。
(3)样品的检测
将切碎的猪肉(5g)放入离心管中并且加入莱克多巴胺水溶液,加标样品在搅拌器上以300rpm的速度均质3min,然后在4℃下保持12h。随后用20mL乙腈通过超声30min,从加标猪肉中提取莱克多巴胺。在4℃下离心10分钟后,收集上清液。将该提取程序重复两次,合并两部分上清液,并使用旋转蒸发仪在40℃下干燥。将残余物重新溶解在甲醇中,加入含有0.05mol/L K2S2O8的0.1mol/L的PBS缓冲溶液调pH至7.4,取25mL所得溶液用于电化学发光分析,按步骤(2)所得的线性回归方程计算出待检测样品中莱克多巴胺的浓度,其结果列于表1中。
表1某猪肉样品的测定结果
其中:实际量a为三次测定的平均值
如表1所示,样品平行测定3次,加标回收率在97%~102%之间,相对标准偏差小于5%,回收效果较好。上述实验结果说明,不用HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰而单独用HKUST-1或PTC-PEI修饰玻碳电极后进一步组装传感元件无法检测出莱克多巴胺,因此本发明的传感器是可用于检测猪肉中的莱克多巴胺。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,其特征在于,所述电化学发光适配体传感器是由适配体负载于由纳米复合材料HKUST-1/PTC-PEI修饰玻碳电极的表面而成。
2.根据权利要求1所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,其特征在于,所述适配体是由含有5'-NH2-AAAAGTGCGGGCAAA-3' 碱基序列的适配体。
3.根据权利要求1所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,其特征在于,所述纳米复合材料HKUST-1/PTC-PEI修饰玻碳电极的制备方法如下:
S1. PTC-PEI的制备:将PTCDA溶解在氢氧化钠的水溶液中,然后向其中加入HCl,得到红色沉淀物,将红色沉淀物用去离子水洗涤以除去过量的反应物质,得到PTCA溶液,向PTCA溶液中依次加入EDC、NHS,搅拌,并加入聚乙烯亚胺,继续搅拌,然后用盐酸调pH值,通过离心、干燥,制得红色粉末状产物PTC-PEI;将PTC-PEI分散于超纯水中,使其分散均匀,得到PTC-PEI的水分散液;
S2. HKUST-1的制备:将三水合硝酸铜和均苯三甲酸,溶解于二甲基亚砜中并超声波处理,然后将其注入到含有聚乙烯吡咯烷酮的甲醇中,同时搅拌;然后经离心,洗涤,干燥得到HKUST-1的蓝色纳米晶体;将HKUST-1分散于N,N-二甲基甲酰胺里,并加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺,超声使其分散均匀,得到HKUST-1的DMF分散液;
S3.将玻碳电极抛光,依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗,室温下吹干,获得前处理后的玻碳电极待用;依次移取步骤S1中的PTC-PEI的水分散液和步骤S2中的HKUST-1的DMF分散液并将其滴涂在经前处理后的玻碳电极表面,自然晾干,得到所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极。
4.根据权利要求3所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,其特征在于,所述步骤S1中所得PTC-PEI的水分散液的浓度为0.5 mg/mL。
5.根据权利要求3所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器,其特征在于,所述步骤S2所得HKUST-1的DMF分散液的浓度为1 mg/mL。
6.一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于,通过酰胺键结合作用将适配体负载在所述HKUST-1/ PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面,自然晾干,制得所述电化学发光适配体传感器。
7.根据权利要求6所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于,将适配体负载在HKUST-1 /PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面的具体方法为:首先向含有KCl、NaCl、MgCl2和乙二胺四乙酸的Tris-HCl缓冲溶液中加入所述适配体,配制适配体浓度为1~6 μmol/L的适配体溶液,然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述HKUST-1/PTC-PEI纳米复合材料修饰的玻碳电极表面。
8.根据权利要求6所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的制备方法,其特征在于,所述适配体溶液中适配体的浓度为5 μmol/L。
9.一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的应用方法,其特征在于,以电化学发光适配体传感器作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂丝电极为对电极组成三电极体系,样品中的莱克多巴胺被定量捕捉到传感器的表面,通过产生的发光信号实现莱克多巴胺的检测。
10.根据权利要求9所述的一种检测莱克多巴胺的电化学发光适配体传感器的应用方法,其特征在于,具体步骤为:
A1.含K2S2O8的PBS缓冲溶液的配制:用pH为 7.4的0.1 mol/L的 PBS缓冲溶液配制含0.05 mol/L K2S2O8的PBS缓冲溶液;
A2.不同浓度的莱克多巴胺标准溶液的配制:首先配制50×10-5mol/L的莱克多巴胺溶液,用甲醇溶解,然后用水稀释得到1×10-5 mol/L的莱克多巴胺溶液,然后将1×10-5 mol/L的莱克多巴胺溶液用甲醇水溶液进行稀释,得到若干不同浓度的莱克多巴胺标准溶液,莱克多巴胺标准溶液的浓度范围为1.0×10-12~1.0×10-6 mol/L;
A3.标准曲线的绘制:将所述电化学发光适配体传感器置于步骤A2配制的不同浓度的莱克多巴胺标准溶液中浸泡相同时间,使电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺,然后取出并淋洗,作为工作电极,Ag/AgCl为参比电极,铂电极为对电极,组成三电极体系,以步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液为电解液,在 -1.7~0 V的电化学窗口范围内,光电倍增管高压800 V,扫速0.1 V/s,进行循环伏安扫描,记录发光强度-时间曲线,建立电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺前后的发光强度差值与莱克多巴胺标准溶液中的莱克多巴胺浓度对数值的线性关系,得到相应的线性回归方程;
A4.样品中莱克多巴胺的检测:所述样品先经过预处理再用步骤A1中的含K2S2O8的PBS缓冲溶液调节pH,然后放入电化学发光适配体传感器浸泡相同时间,使电化学发光适配体传感器结合莱克多巴胺,然后取出并淋洗,作为工作电极,再采用步骤A3方法检测发光强度,再根据线性回归方程计算出样品中莱克多巴胺的浓度。
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