CN103439319A - 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 - Google Patents
碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103439319A CN103439319A CN2013103962403A CN201310396240A CN103439319A CN 103439319 A CN103439319 A CN 103439319A CN 2013103962403 A CN2013103962403 A CN 2013103962403A CN 201310396240 A CN201310396240 A CN 201310396240A CN 103439319 A CN103439319 A CN 103439319A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- dna
- carbon nano
- electrochemiluminescence
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical class N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 title claims abstract description 49
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 239000011852 carbon nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 11
- YKWAWOTVGKMRAN-UHFFFAOYSA-L 2-(4-carboxylatopyridin-2-yl)pyridine-4-carboxylate;2-pyridin-2-ylpyridine;ruthenium(2+) Chemical compound [Ru+2].N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1.[O-]C(=O)C1=CC=NC(C=2N=CC=C(C=2)C([O-])=O)=C1 YKWAWOTVGKMRAN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 6
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 4
- -1 succinamide ruthenium Chemical compound 0.000 claims description 4
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical class [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 3
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 235000011091 sodium acetates Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 150000001455 metallic ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007743 anodising Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种博来霉素（BLMs）含量的检测方法，属于电化学发光和传感器技术领域。利用电化学发光试剂标记DNA制备DNA探针（Ru-DNA），将羧基化的碳纳米粒子修饰电极，通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用DNA与碳纳米粒子非共价键自组装原理构建了碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器。将目标物博来霉素与DNA探针作用，导致DNA被切割，吸附在碳纳米粒子修饰电极上DNA探针减少，产生的弱的电化学发光信号，以此实现对博来霉素的测定。这种方法有着简单、快速的优势。
Description
技术领域
本发明属于分析化学与电化学发光传感器领域，具体为一种碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法及应用。
技术背景
对于现代生化学科和生物医学研究来说，灵敏、准确测量与疾病有关的蛋白质在很多方面是至关重要的，特别是对于癌症早期特征蛋白的检测和精准预测具有重要的意义。免疫检测是一种强有力的分析测定技术，其已被广泛用于肿瘤标记物的检测分析。由于抗体具有高特异性和强的识别作用，因而被用作识别元素。然而，由于抗体在其生产、产品的稳定性以及临床操作上的缺陷，人们正在寻求其替代品。
DNA生物传感器是一种能够将与DNA相互作用的目标物转变成可检测的光、电等信号的传感装置，利用DNA与目标物的相互作用可以建立许多用于生命科学研究的检测技术。DNA生物传感器是一种强有力的分析测试方法，在许多方面可以替代传统的基于抗原抗体建立的分析方法。DNA生物传感器是迅速发展起来的全新的生物传感器，开辟了分子生物学与电化学，光谱学等学科的新研究领域，为生命科学的研究提供了新技术、新方法，对临床医学以及遗传工程的研究具有深远的意义。
电化学发光（电致化学发光），简称ECL，是通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间发生化学反应并生成某种不稳定的中间态物质，该物质分解而产生的化学发光现象。电化学发光技术是电化学与化学发光相结合的检测技术，该技术既集成了发光与电化学分析技术的优点，又具有二者结合产生的可控性、选择性、重现性好、灵敏度高、检测限低及动力学响应范围宽等新优势。
博来霉素（Bleomycins，BLMs，BLM）是一类糖肽类抗生素。它是日本科学家梅泽滨于1996年首次从轮枝链霉菌的培养液中分离得到。薄来霉素在氧气和氧化还原金属离子（如Fe2+等）的存在下可以选择性地切断单链DNA或双链DNA，从而将癌细胞杀死。基于此机理，薄来霉素和金属离子的复合物被广泛应用于皮肤癌、肺癌、食管癌、脑癌等多种癌症的辅助治疗。目前已报道的博来霉素的测定方法有荧光法（Feng Li, Yan Feng, Can Zhao, Peng Li and Bo Tang, A sensitive graphene oxide–DNA based sensing platform for fluorescence “turn-on” detection of bleomycin, Chem. Comm., 2012, 48:127; Yoshitsugu Akiyama, Qian Ma, Erin Edgar, Andrei Laikhter and Sidney M Hecht, A novel DNA hairpin substrate for bleomycin, Org. Lett., 2008, 10:2127）和电化学发光法等（Honglan Qi, Xiaoying Qiu, Chen Wang, Qiang Gao and Chengxiao Zhang，Anal. Methods, 2013, 5:612）。本发明建立了一种羧基化碳纳米粒子修饰金电极电化学发光生物传感器，并用其测定博来霉素。所提供的是一种简单而灵敏的电化学发光传感技术，利用本发明实现了博来霉素的测定。
发明内容
针对现有技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的是提供一种简单而灵敏的电化学发光传感技术，利用本发明实现了博来霉素的测定；同时本发明还可应用到其他对DNA具有切割作用的蛋白质类抗生素的测定，也可以很容易地扩展为多功能即时检测装置。
本发明的目的通过以下技术方案实现：碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器测定博来霉素的方法，具体包括以下步骤：
碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器的建立，其特征在于具体包括以下步骤：
羧基化碳纳米粒子（cCNP）制备：将0.1~1.0 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波炉（600 W）加热9.5分钟（min）至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，得碳纳米粒子；
将0.1~2.0克碳纳米粒子与0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8小时（h），得羧基化碳纳米粒子；
所述的电化学发光探针，具体制备步骤如下：
优选的，将200 μL 2 OD DNA加入200 μL 1.0×10-3 mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS（二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌）。室温下振荡6~18 h。随后，在该溶液中加入100 μL 3 mol/L 醋酸钠和2.0 mL 冷无水乙醇，溶液在-16 ℃冷却24 h。然后在12000转速和-4 ℃下离心30 min。沉淀物用1 mL冷乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的DNA探针（电化学发光探针）用1.0 mL 0.10 mol/L 磷酸缓冲溶液溶解，储藏在-18 ℃中备用；
优选的，所述氨基化DNA序列部分为：5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH2)6-NH2-3'（DNA，SEQ ID NO：1）。
修饰电极制备，具体制备步骤如下：
金电极经1.0 μm，0.3 μm，0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干，备用；
将处理好的金电极浸入100 μL（10-4 M）的巯基乙胺中，固定2~8 h（37℃）后，用磷酸缓冲溶液冲洗二次，取1 mL羧基化碳纳米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg、EDC 7.2 mg，在37 °C下活化1 h，再将上述电极浸入其中，反应过夜，制得碳纳米粒子修饰电极；
利用静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，得碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器。
碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器测定博来霉素的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
[0019] 优选的，在100 μL电化学发光探针中加入不同浓度的博来霉素样品溶液和0.1 mM的Fe2+，然后将修饰电极浸入其中反应一段时间，取出电极按常规方法测定电化学发光信号，根据电化学发光信号对博来霉素进行定量检测。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
通过静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，利用DNA与碳纳米粒子非共价键自组装原理构建了碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器；
利用构建的碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器建立了一种检测博来霉素的新方法。这种设计所采用的方法有着简单、快速的优势。因此，本发明涉及的电化学发光传感器在构建检测目标物的研究方法中体现出良好的发展前景。
附图说明
图1为碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器及测定博来霉素原理图。
图2为修饰电极在博来霉素与探针、Fe2+作用后的溶液中浸泡时间对电化学发光信号（ΔIECL）的影响关系图。
图3为电化学发光强度与博来霉素浓度的标准曲线图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），购于天津市巴斯夫化工有限公司；Ru(bpy)2(dcbpy)NHS（二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌，Ru）、HS-(CH2)6-NH2购于Sigma-Aldrich。
所用人工合成DNA序列（北京赛百盛生物工程有限公司购得）如下：
5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH2)6-NH2-3'（DNA，SEQ ID NO：1）。
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器公司）；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机（上海市安亭科学仪器厂）；实验采用三电极***：金电极及修饰金电极为工作电极，Ag/AgC1（饱和KCl）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。
1.2实验步骤
1.2.1电化学发光探针的制备
200 μL 2 OD DNA加入200 μL 1.0×10-3 mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。室温下振荡6~18 h。随后，在该溶液中加入100 μL 3 mol/L 醋酸钠和2.0 mL 冷无水乙醇，溶液在-16 ℃冷却24 h。然后在12000转速和-4 ℃下离心30 min。沉淀物用1 mL冷乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS。得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的DNA探针（电化学发光探针）用1.0 mL 0.10 mol/L 磷酸缓冲溶液溶解，储藏在-18 ℃中备用。
1.2.2羧基化碳纳米粒子的制备
（1）碳纳米粒子的制备：将0.5 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波炉（600 W）加热9.5 min至溶液颜色改变。将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，再用透析膜（截留分子量2000）在纯净水中对其透析，持续4天以去除残余聚乙烯醇，得碳纳米粒子。
（2）利用碳纳米粒子制备羧基化碳纳米粒子：将1克碳纳米粒子与0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8 h。然后，将产物利用0.22 μM超滤膜进行过滤，将滤液离心10 min（14000 rmp条件下），并用二次蒸馏水洗涤三次，得羧基化碳纳米粒子，然后分散在二次蒸馏水中制备成浓度为2.0 mg/mL溶液。
1.2.3碳纳米粒子修饰电极的制备
（1）金电极的预处理
金电极经1.0 μm，0.3 μm，0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干。采用三电极***检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3[Fe(CN)6]溶液中，设置电压为0～0.8 V，对金电极进行循环伏安（CV）扫描。若氧化还原电流峰在0～100 mV内，则已说明电极表面已被处理好。否则重新处理，直至符合要求为止。测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）修饰电极的制备
将上述处理好的金电极浸入100 μL（10-4 M）的巯基乙胺中，固定4 h（37℃）后，用磷酸缓冲溶液冲洗二次，取1 mL羧基化碳纳米粒子溶液，加入NHS 3.6 mg，EDC 7.2 mg，在37 °C下活化1 h，再将上述电极浸入其中，反应过夜，制得碳纳米粒子修饰电极。
1.2.4博来霉素的检测
在100 μL电化学发光探针中加入不同浓度的博来霉素溶液和0.1 mM Fe2+，反应30 min。然后将碳纳米粒子修饰电极浸入其中，37 °C下反应7 min。用10 mM的磷酸缓冲溶液（pH 7.4）冲洗电极三次。以该电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，以电化学发光信号为分析信号，进行博来霉素的测定。参数设置为：高压800 V，放大级数为3，控制电位为0-1.30 V。
1.3结果与讨论
实验原理
如图1所示，在该发明中，利用分子识别后的切割作用，从而产生信号变化，据此建立了测定博来霉素的电化学发光生物传感器。利用单链DNA为分子识别元素，以博来霉素为分析测定对象，对该发明进行了验证。
设计了DNA部分序列（5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH2)6-NH2-3'），将一个末端用Ru(bpy)2(dcbpy)NHS进行标记作为电化学发光信号探针。当博莱霉素存在，Ru-DNA被切割，形成片段DNA，其在碳纳米粒子修饰电极表面吸附量减少，电化学发光信号弱。当博莱霉素不存在时，溶液中的Ru-DNA不被切割，由于碳纳米粒子与DNA的静电斥力和π-π堆积作用，Ru-DNA被吸附在碳纳米粒子修饰电极表面，电化学发光信号强，据此实现对博来霉素的测定。
如图2所示，碳纳米粒子修饰电极浸泡在DNA探针、Fe2+、博来霉素样品作用后溶液时间对电化学发光信号（ΔIECL）具有影响。在1～5 min范围内，电化学发光信号强度随浸泡时间的增大而增强，5 min后电化学发光信号强度缓慢增加，直到7 min时达到最大值，大于7 min之后变化不大。因此确定碳纳米粒子修饰电极浸泡在DNA探针、Fe2+、博来霉素样品作用后溶液的最佳时间为7 min。
本实施例中研究了金属离子对博来霉素 切割DNA反应的影响。在反应体系中分别加入Fe2+、Co2+、Zn2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+金属离子时，实验发现只有Fe2+有明显的作用，而其它金属离子则对博来霉素切割DNA不起作用。这表明博来霉素与DNA的氧化切割作用需Fe2+离子作为辅助因子形成复合物从而使DNA链断裂。
本实施例的线性范围及检出限如下：优选的，在最优条件下，实验考察了不同浓度博来霉素与电化学发光强度之间的关系，得到了检测博来霉素的标准曲线，线性范围及线性方程。当博来霉素的浓度在1.0×10-10～3.0×10-7 M之间时，体系的电化学发光强度随着博来霉素浓度的增大而增大（如图3所示）。非线性回归方程为ΔIECL = -5618.44*exp(-C/79.05) -1156.30*exp(-C/3.67) + 6933.49（ΔIECL为体系的电化学发光强度；C为博来霉素的浓度，10-9 M；n = 7，R = 0.9980）。博来霉素的线性范围为1.0×10-10～3.0×10-8 M，线性回归方程为ΔIECL = 198.75C + 120.72。该方法检测限为4.0×10-11 M （3σ）。对浓度5.0×10-9 M 的博来霉素进行7次平行重复测定的RSD为3.5%，表明本发明有较好的重现性。
Claims (5)
1.碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法，其特征包括以下步骤：
a 将0.1~1.0 g聚乙烯醇溶解在10 ml水中制得均相溶液，然后放入微波炉（600 W）加热15 min（分钟）至溶液颜色改变，将上述溶液以13000 rpm离心30 min去除杂质，得碳纳米粒子；将0.1~2.0克碳纳米粒子与0.5 mL 63%的硝酸和0.5 mL二甲基甲酰胺混合后在100摄氏度下反应8小时（h）；
b 将200 μL 2 OD DNA加入200 μL 1.0×10-3 mol/L Ru(bpy)2(dcbpy)NHS（二(2,2'-联吡啶) (2,2'-吡啶-4,4'-二碳酸)琥珀酰胺钌），室温下振荡6~18 h，随后，在该溶液中加入100 μL 3 mol/L 醋酸钠和2.0 mL 冷无水乙醇，溶液在-16 ℃冷却24 h，然后在12000转速和-4 ℃下离心30 min，沉淀物用1 mL冷乙醇清洗三次，除去未反应的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS，得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的DNA探针（电化学发光探针）用1.0 mL 0.10 mol/L 磷酸缓冲溶液溶解；
c 金电极经1.0 μm，0.3 μm，0.05 μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5 min，用高纯氮气吹干，备用；将处理好的金电极浸入100 μL（10-4 M）的巯基乙胺中，固定2~8 h（37℃）后，用磷酸缓冲溶液冲洗二次，取1 mL羧基化碳纳米粒子溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3.6 mg、1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）7.2 mg，在37 °C下活化1 h，再将上述电极浸入其中，反应过夜，制得碳纳米粒子修饰电极，利用DNA与探针与碳纳米粒子修饰电极之间的静电斥力和π-π堆积作用之间的竞争作用，得碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器。
2.利用权利要求1所制备的碳纳米粒子修饰电极电化学发光生物传感器测定博来霉素的方法，其特征包括以下步骤：
在100 μL电化学发光探针中加入不同浓度的博来霉素溶液和0.1 mM Fe2+，然后将修饰电极浸入其中反应7 min，用10 mM的磷酸缓冲溶液（pH 7.4）冲洗电极三次，然后进行电化学发光测定，根据作用后电极表面电化学发光探针所产生电化学发光信号，对博来霉素进行定量检测。
3.根据权利要求2所述的电化学发光测定具体为：采用三电极***检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，参数设置为：高压800 V，放大级数为3，控制电位为0-1.30 V。
4.根据权利要求1所述，其特征在于： DNA部分序列为5'-CGCTTTAAAAAAAGTG-(CH2)6-NH2-3'。
5.根据权利要求1所述，其特征在于： DNA部分序列为3'末端为氨基修饰。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310396240.3A CN103439319B (zh) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310396240.3A CN103439319B (zh) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103439319A true CN103439319A (zh) | 2013-12-11 |
| CN103439319B CN103439319B (zh) | 2015-11-04 |
Family
ID=49693021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310396240.3A Expired - Fee Related CN103439319B (zh) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103439319B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007152A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 青岛科技大学 | 基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定dna的电化学传感器和测定dna的方法 |
| CN105385770A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-09 | 山东大学 | 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法 |
| CN105950757A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-09-21 | 山东大学 | 基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法 |
| CN110426440A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 曲阜师范大学 | 一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法 |
| CN114487066A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-13 | 上海市肿瘤研究所 | 一种超灵敏dna-生物大分子传感器、构建及其应用 |
-
2013
- 2013-09-03 CN CN201310396240.3A patent/CN103439319B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007152A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 青岛科技大学 | 基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定dna的电化学传感器和测定dna的方法 |
| CN104007152B (zh) * | 2014-06-18 | 2016-05-25 | 青岛科技大学 | 基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定dna的电化学传感器和测定dna的方法 |
| CN105385770A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-09 | 山东大学 | 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法 |
| CN105385770B (zh) * | 2015-12-18 | 2018-09-28 | 山东大学 | 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法 |
| CN105950757A (zh) * | 2016-06-17 | 2016-09-21 | 山东大学 | 基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法 |
| CN105950757B (zh) * | 2016-06-17 | 2019-11-22 | 山东大学 | 基于双环发夹探针以及酶介导的级联扩增策略检测博来霉素的方法 |
| CN110426440A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 曲阜师范大学 | 一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法 |
| CN110426440B (zh) * | 2019-07-16 | 2022-02-01 | 曲阜师范大学 | 一种光电化学生物传感器及其对blm的检测方法 |
| CN114487066A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-05-13 | 上海市肿瘤研究所 | 一种超灵敏dna-生物大分子传感器、构建及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103439319B (zh) | 2015-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210247349A1 (en) | METHOD FOR PREPARING RATIOMETRIC ELECTROCHEMICAL miR3123 APTASENSOR BASED ON METAL-ORGANIC FRAMEWORK COMPOSITE | |
| CN111205280B (zh) | 一种检测次氯酸的比率型荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN104597019B (zh) | 一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法 | |
| Yang et al. | Development of a lateral flow strip biosensor based on copper oxide nanoparticles for rapid and sensitive detection of HPV16 DNA | |
| CN103439319B (zh) | 碳纳米粒子修饰电极电化学发光测定博来霉素的方法 | |
| CN109115850B (zh) | 一种灵敏检测强力霉素的化学修饰电极及其制备方法与应用 | |
| CN102435662B (zh) | 一种检测水体中目标汞离子的方法 | |
| Kothur et al. | A low pH sensor from an esterified pillar [5] arene | |
| CN110618185A (zh) | 一种赭曲霉毒素a的比率电化学检测方法 | |
| CN104391117B (zh) | 一种基于PPy-NH2GO-Ag2Se@CdSe的胃癌抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用 | |
| CN105044273B (zh) | 一种基于纳米粒子标记氧化还原循环检测多巴胺的方法 | |
| CN104764782A (zh) | 一种用于检测miRNA-20a的硼掺杂石墨烯量子点电化学发光传感器的制备及其应用 | |
| Li et al. | A molecularly imprinted sensor based on an electrochemiluminescent membrane for ultratrace doxycycline determination | |
| US20210269421A1 (en) | Water-soluble fluorescent probe and nanoparticals with aggregation-induced emission effect for ovarian cancer and preparation method and use thereof | |
| CN104152449A (zh) | miRNA捕获探针及其修饰电极与捕获探针互补链及其修饰碳纳米管-金磁纳米粒复合物 | |
| CN103951673B (zh) | 一种试剂及其在硫醇检测中的应用 | |
| CN107064258B (zh) | 基于dna产生电信号及其自组装放大信号的电化学适配体传感器测定her2的方法 | |
| CN105866211B (zh) | 一种氨苄西林分子印迹传感器的制备方法及应用 | |
| CN109932349B (zh) | 一种检测次氯酸的有机硅小分子荧光探针 | |
| Zha et al. | A high performance dual-mode biosensor based on Nd-MOF nanosheets functionalized with ionic liquid and gold nanoparticles for sensing of ctDNA | |
| CN112630279B (zh) | 用于检测双氯酚酸的基于金纳米粒子的等离子共振增强型电化学发光传感器及制备方法 | |
| CN103616357A (zh) | 一种可视化生物传感器件及其制备方法 | |
| CN106198503B (zh) | 一种电化学发光夹心生物传感器及制备与应用 | |
| CN105445350A (zh) | 一种基于肽核酸的电化学dna生物传感器及其制备方法 | |
| CN103044406B (zh) | 香豆素类衍生物及其制备方法和在检测氰根离子中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zheng Chuanqi Inventor before: Mixed Xu Inventor before: Liu Fang |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180125 Address after: 510670 Guangzhou high tech Industrial Development Zone, Guangzhou, Guangdong Province, South Yun three Road 39, eight building 2 building 201 and 202 Patentee after: Guangzhou spectrum peak Technology Co.,Ltd. Address before: 266000 Shandong province Qingdao City, No. 53 Zhengzhou Road, College of chemistry and Molecular Engineering Patentee before: QINGDAO University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151104 Termination date: 20210903 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |